Il modello di liquame cecale per la sepsi polimicrobica è un potente strumento per sezionare una fisiopatologia neonatale unica. Può essere variabile e gli endpoint umani non sono ben descritti. Qui presentiamo la nostra procedura altamente standardizzata per preparare un liquame cecale e iniettare in animali da esperimento.
Inoltre, utilizziamo un approccio basato sui dati per identificare i cuccioli moribondo al più presto possibile. Iniziamo preparando un calcio di liquame cecal congelato. Questo viene fatto raggruppando il concent cecal da almeno cinque topi adulti, sospendendo in acqua sterile di destrosio e immagazzinando a meno 80 per un uso successivo.
Puoi usare maschi o femmine, ma il sesso, l'età e lo sfondo dei topi per i tuoi esperimenti dovrebbero essere mantenuti costanti. Per prima cosa, prepariamo i nostri strumenti per la dissezione. Questi includono un set di forbici e forcep per la pelle e un secondo set per gli organi interni.
Accendere lo sterilizzatore di perline calde almeno 30 minuti prima dell'uso. Immergere gli utensili in etanolo al 70% e quindi immergerli nello sterilizzatore di perline calde per almeno un minuto. Spruzzare un tappetino di tovaglioli di carta con 70%etanolo, quindi rimuovere gli strumenti dallo sterilizzatore senza toccare la parte sterilizzata dello strumento alle maniglie non sterili di altri strumenti.
Mettili sull'asciugamano di carta per rinfrescarli. Sezionare i topi in un armadietto di sicurezza biologico. Fissare le gambe del mouse a una tavola da polistirolo usando aghi calibro 23 in modo che il mouse sia addome.
Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Usando forcette e forbici sterili, tagliare la pelle, allentare la pelle dal rivestimento peritoneale con le forbici e tagliare una regione rettangolare dall'inguine allo sterno e dal lato sinistro a quello destro. Rimuovere la pelliccia intorno al peritoneo.
Passare a un nuovo paio di strumenti sterili per tagliare il peritoneo, rendendo anche un'apertura rettangolare. Identificare il cieco, che dovrebbe correre da sinistra a destra sul corpo. Interrompere il tessuto connettivo per identificare i rami del cieco dall'intestino e tagliare il cieco lontano dall'intestino.
Posizionarlo su un foglio di carta di pesata sterilizzato. Utilizzando strumenti sterili, tagliare entrambe le estremità del cieco. Tenere il centro del cieco con le forcelle e utilizzare una spatola metallica piatta per spingere delicatamente il contenuto di cecal fuori dalle estremità usando un movimento di rotolamento.
Raccogliere il contenuto e posizionarlo in un tubo di centrifuga pre-pesato da 15 millilitri. Mettere in comune il contenuto di un massimo di cinque topi nello stesso tubo. Pesare nuovamente il tubo una volta aggiunto tutto il contenuto.
Per calcolare il volume di acqua di destrosio da aggiungere al contenuto cecale in ogni tubo, dividere il peso del contenuto cecale nel tubo per la concentrazione desiderata in milligrammi per millilitro. Mantenere un'aliquota di acqua di destrosio sul ghiaccio per la riaspensione del contenuto cecale. Aggiungere la quantità richiesta di acqua di destrosio al tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente contenuto cecale.
Vortice il tubo verticalmente e orizzontalmente per circa 30 secondi. Osservare la presenza di particolato di circa pochi millimetri di diametro e, se presente, continuare a vortice fino a quando tutto il particolato è stato visibilmente scomparso. Posizionare un tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio per raccogliere il filtrato e installare un filtro cellulare sterile da 70 micrometri sopra la parte superiore.
Pipetta quattro millilitri di liquami ri-sospesi da un tubo da 15 millilitri sopra il filtro cellulare e nel tubo di raccolta. Sospendere di nuovo il particolato tubazione su e giù da due a tre volte. Estrudere delicatamente le bolle per aumentare la velocità di filtraggio mescolando il contenuto con la punta della pipetta fino a quando non c'è più liquido filtrato.
Questo dovrebbe richiedere circa 30 secondi. Cambiare i filtri cellulari tra ogni tubo di liquame cecale, ma mettere in comune tutto il contenuto nello stesso tubo di raccolta da 50 millilitri. Se il tuo stock supera i 40 millilitri, vortice per 15 secondi e posiziona 20 millilitri in un nuovo tubo di centrifuga.
Dividere i liquami in flaconcini criogenici di 500 aliquote microliter ciascuna. Vortice il liquame tra ogni tre fiale. Tieni il magazzino principale in fiale sul ghiaccio.
Immagazzinando aliquote a meno 80, la colonia aerobica che forma concentrazione unitaria in una preparazione di liquami cecali non cambia per un periodo di sei mesi. Ora che il liquame cecal è preparato, possiamo usarlo per sfidare una cucciolata di topi vecchi da sette a otto giorni con una dose regolata di peso di liquami cecali. La letalità del liquame dipende dalla dose.
Dovrai determinare la dose letale desiderata nella tua struttura per ogni nuovo stock con una nuova titolazione della dose. Per cucciolata viene preparata un'aliquota di iniezione di liquami cecali. Normalizziamo l'inoculo a un volume di 100 microlitri, arrotondando ai 10 microlitri più vicini per ogni animale nella lettiera.
La preparazione dell'aliquota di sfida richiede tre calcoli, il volume di scorte di liquami richiesto, il volume aggiuntivo di acqua di destrosio e il volume arrotondato per ogni cucciolo nella lettiera. I dettagli su come eseguire ogni calcolo sono disponibili nella sezione tre del protocollo. Eseguire questi calcoli a mano per ogni esperimento può richiedere molto tempo e contribuirà all'errore sperimentale, quindi è possibile scaricare un foglio di calcolo insieme al protocollo in cui si immette la concentrazione di magazzino, la dose desiderata e il peso della lettiera e la quantità di materiale liquame, il volume di acqua di destrosio e il volume effettivo per cucciolo viene restituito automaticamente.
Puoi stampare questo foglio e portarlo con te quando sei pronto a sfidare i tuoi animali. Preparare l'aliquota di iniezione in un armadietto di sicurezza biologico e tenerlo sul ghiaccio. Prima di caricare la siringa, mescolare il tubo di microcentrifugo svolazzando 20 volte.
I cuccioli sono sfidati con una siringa per insulina calibro 28. Prima di tagliare i liquami, mescolare l'aliquota ispirando ed espellendo da 300 a 500 microlitri dell'aliquota di sfida all'interno e all'uscita dal tubo di microcentrifugo. Quindi, redigere circa 150 microlitri della sfida aliquota.
Questo dovrebbe essere più grande del volume di iniezione per un cucciolo di sette-otto giorni. Premere la siringa per spodestare le bolle dallo stantuffo e tirarsi leggermente indietro sulla siringa per espellere eventuali bolle d'aria. Non toccare l'ago o l'albero dello stantuffo durante questo processo.
Erogare il liquame cecal in eccesso nel tubo di microcentrifugo fino a quando la quantità calcolata di liquami cecali per il topo viene caricata nella siringa. I liquami cecali vengono somministrati con un'iniezione intraperitoneale. Esegui questo secondo il protocollo presso il tuo istituto di cura degli animali.
Per ridurre al minimo le perdite, inclinare il cucciolo verso il basso e inserire l'ago tra la gamba e i genitali, mantenendo l'ago poco profondo e sottocutaneo. Dopo aver inserito l'ago di circa un centimetro, premere verso il basso e in avanti fino a sentire l'ago forare il peritoneo, quindi deprimere lentamente lo stantuffo. Ritira con cura l'ago seguendo lo stesso percorso in cui sei entrato, rilassando il dito medio mentre lo fai.
Prendere nota di eventuali perdite nel notebook da laboratorio e prendere in considerazione l'omissione di animali con perdite sostanziali dal risultato finale. In questa sezione illustreremo i diversi livelli di salute che osserviamo nei topi sfidati con sepsi polimicrobica e il loro corrispondente endpoint umano. Per qualsiasi operazione che coinvolga topi neonatale, trasferiamo il materiale della biancheria da letto in una nuova gabbia.
Questo trasferisce l'odore della dama sui guanti e riduce lo stress sulla dama dall'ingresso ripetuto nella sua gabbia. Facciamo un secondo nido nella nuova gabbia per tenere i cuccioli monitorati fino alla fine della procedura o monitoraggio quando l'intera lettiera è pronta per essere restituita alla gabbia della dama. Posizionare un mouse sulla schiena e monitorare la possibilità di destra entro quattro secondi.
Se è in grado di farlo, attendere altri otto secondi per determinare il livello di mobilità. Un mouse non contestato o in recupero è più spesso in grado di destra ed esplorare il proprio ambiente facendo più passaggi di seguito. Raggruppa i topi che sono in grado di raddrizzare se stessi e fare alcuni passi per esplorare il suo ambiente come letargico dei diritti.
Questi topi possono cadere mentre prendono un passo e sembrano traballanti sui loro piedi. Un mouse che non è in grado di destra e ha un movimento dell'anca che supera i 90 gradi dall'orizzontale, ci raggruppamo come non riescono a destra-mobile. Questo mouse alla fine avrà ragione, ma non può entro quattro secondi.
A causa dei suoi movimenti dell'anca, è raggruppato come non riescono a destra-mobile. I cuccioli che non sono stati in grado di destra e hanno un movimento dell'anca inferiore a 90 gradi dall'orizzontale sono raggruppati come non dannosi per il letargico destro. Questo è un altro esempio di un topo i cui fianchi non superano i 90 gradi dall'orizzontale ed è raggruppato come non titolo di letargico destro.
Un cucciolo nonmobile destro avrà gambe che possono scuotere o vibrare ma non hanno movimento dell'anca. Gli arti possono estendersi e ritrarsi ma non avranno movimento laterale. Il cucciolo è visibilmente malato e ha raggiunto l'endpoint umano.
Questo è un altro esempio di un cucciolo non in grado di destra-nonmobile. I suoi fianchi non tremano da sinistra a destra, ma le sue zampe vibrano. Quando si maneggia la gabbia della dama, i cuccioli possono essere trascinati fuori dal nido se la dama infermieristica corre.
Li sostituiamo e poi controlliamo la presenza di altri cuccioli sparsi che sono lontani dai loro compagni di nido. Se quei cuccioli sparsi non riescono a letargici a destra, sono a un punto finale umano. Ecco una curva di sopravvivenza Kaplan-Meier del nostro modello di sepsi.
I punti di tempo di monitoraggio sono disponibili nella SOP allegata. In qualsiasi punto lungo la curva di sopravvivenza se si trova che un topo non riesce a destra-nonmobile, è al suo endpoint umano ed eutanasiato. Tra le 12 e le 21 ore dopo la sfida, i topi appariranno malati e circa la metà dei topi sarà in grado di destra da un lato, mentre l'altra metà non riesce a destra su uno dei loro lati.
Questo è il periodo di tempo in cui i topi inizieranno a divagare nel punteggio di salute e raggiungere l'endpoint umano di non riuscire a destra-nonmobile. Questi sono risultati rappresentativi dei punteggi di salute osservati in questo lasso di tempo. I gruppi di superstiti e non sopravvissuti non possono essere differenziati a questo punto in base ai loro punteggi di salute.
In questa fase della malattia, da 21 a 48 ore dopo la sfida, osserviamo la più alta percentuale di endpoint umani. Abbiamo anche osservato che la stragrande maggioranza dei topi che non sono in grado di destra da entrambe le parti non finirà per riprendersi dalla malattia, che diventa quindi un nuovo criterio per l'endpoint umano oltre ai criteri di non esito destro-non mobili. I punteggi di salute osservati durante questa fase della malattia hanno portato alla separazione dei sopravvissuti dai non sopravvissuti.
La stragrande maggioranza dei topi che non erano in grado di destra da entrambe le parti non si sono ripresi dalle malattie. Questi dati supportano che un nuovo criterio per l'endpoint umano a partire da 21 ore dopo la sfida dovrebbe essere quello di eutanasia di tutti i topi che non riescono a destra su entrambi i lati. Oltre 48 ore dopo la sfida molti topi inizieranno a mostrare più attività e un riflesso di giusticamento migliore.
Anche se la proporzione di endpoint umani è inferiore in questo periodo, i topi possono ancora divagare e diventare più bassi, e richiedono comunque il monitoraggio per endpoint umani. Durante questo periodo di tempo, alcuni di quei topi che alla fine sono stati raggruppati come non sopravvissuti avevano mostrato un aumento dell'attività ad un certo punto, ma in seguito hanno fatto peggio e hanno raggiunto un endpoint umano. Ciò richiede un monitoraggio continuo degli animali malati con maggiore frequenza se iniziano a mostrare risultati sanitari peggiori.
Gli sperimentatori indipendenti che non hanno ricevuto una formazione di persona e che osservano solo questo video didattico sono stati testati nella loro capacità di assegnare lo stesso punteggio degli investigatori utilizzando video di test registrati. Questo video didattico si traduce in una classificazione comportamentale accurata. La capacità di assegnare il punteggio corretto per non riuscire ai topi neonatali destro-non mobili, che è una misura dell'endpoint umano, è stata determinata su 60 topi neonatali e una media del 97% dei comportamenti è stata accuratamente distinta, con solo il 3% che è stato erroneamente identificato.
Successivamente, è stata testata la capacità di differenziare i topi neonatali che non avevano ragione o che erano in grado di farlo entro quattro secondi. Questa è un'altra misura dell'endpoint umano ed è stata accuratamente assegnata nel 97% dei topi neonatale, mentre il 3% dei cuccioli è stato erroneamente assegnato come a destra. Ecco i risultati rappresentativi per il cambiamento di peso percentuale dei topi rispetto al loro momento di sfida.
Il cambiamento medio di peso tra sopravvissuti e non sopravvissuti ha iniziato a separarsi a 24 ore dopo la sfida, ma c'è molta sovrapposizione tra i gruppi. Ci sono stati alcuni sopravvissuti che hanno perso oltre il 20% di peso ma si sono ancora ripresi dalla malattia. Il cambiamento di peso non è stato così efficiente nel prevedere i risultati rispetto alle differenze nei punteggi di salute, motivo per cui non viene utilizzato come criterio per determinare se i topi si trovano in un endpoint umano.
Per concludere, ora dovresti essere in grado di preparare uno stock di liquami cecali congelati, calcolare la dose regolata per il peso. E iniettare e monitorare i topi appena nati alla ricerca di endpoint umani. Speriamo che questa sia una risorsa preziosa per la tua ricerca sul mouse.
