Questo metodo può aiutare a produrre grandi quantità di RNA ricombinanti di interesse per l'applicazione nella ricerca o nell'industria. Il vantaggio principale è che l'RNA ricombinante è prodotto in Escherichia coli in un processo economico che può essere facilmente scalato. È importante sottolineare che l'RNA è prodotto su un'impalcatura circolare dell'RNA, che facilita la purificazione all'omogeneità.
A differenza del DNA o delle proteine, gli RNA di interesse non sono facilmente prodotti in grandi quantità nei sistemi biofabbri, come una cultura di Escherichia coli. Il nostro metodo si basa sulla co-espressione dell'RNA di interesse inserito in un'impalcatura circolare altamente stabile e applicando una ligasi che media la circolarizzazione dell'RNA. L'impalcatura circolare dell'RNA deriva da una viroide brevettata.
I viroidi sono RNA circolari relativamente piccoli, non arrotolato, altamente accoppiati alla base che sono infettivi per alcune piante superiori. Possiamo produrre decine di milligrammi dell'RNA ricombinante per litro di coltura batterica in normali condizioni di laboratorio. Per iniziare questa procedura, amplificare il cDNA da PCR come descritto nel protocollo di testo.
Quindi, aggiungere 100 nanogrammi del pLELVd-BZB plasmide a un tubo da 0,5 millilitri. Aggiungere 10 U dell'enzima di restrizione IIS BpiI e abbastanza tampone G per creare una reazione di 20 microliter. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire il plasmide.
Successivamente, separare la PCR e i prodotti di digestione per elettroforesi in un gel di agarosio dell'uno per cento nel tampone TAE. Macchiare il gel scuotendolo in bromuro di etidio da 200 millilitri ad una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro. Usando un transilluminatore UV, visualizza il DNA.
Utilizzare un bisturi per tagliare le bande corrispondenti al cDNA amplificato e al plasmide digerito BpiI. Usando colonne di gel di silice, elutare i DNA dai frammenti di gel. Quantificare la concentrazione del DNA mediante analisi spettrofotometrica.
Impostare una reazione Gibson Assembly utilizzando il cDNA amplificato e il plasmide digerito. Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Quindi, utilizzare una colonna di gel di silice per purificare la reazione.
Dopo aver elettroporato le cellule E.coli DH5-Alpha competenti, raccogliere diverse colonie bianche e trasferirle su mezzo liquido LB. Fai crescere le colonie durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare un kit miniprep per purificare i plasmidi e analizzarne le dimensioni per elettroforesi in un gel di agarosio dell'uno per cento nel buffer TAE.
In primo luogo, co-elettroporare il ceppo E.coli selezionato sia con il derivato pLELVd-BZB che contiene il cDNA corrispondente all'RNA di interesse che con il P15LTRNISM plasmide per co-esprimere la tRNA ligasi delle melanzane. Trasferire il mezzo liquido SOC nella cuvetta di elettroporazione per recuperare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, placcare i batteri su un mezzo solido LB contenente 50 microgrammi per ampicillina millilitro e 34 microgrammi per cloramfenicolo millilitro.
Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 250 millilitri di mezzo liquido TB, contenente 50 microgrammi per ampicillina millilitro, e 34 microgrammi per millilitro cloramfenicolo, a un pallone Erlenmeyer sconcertato da un litro. Recuperate l'E.Coli incubato, quindi scegliete una colonia e inoculate il mezzo nel pallone.
Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti vigorosi a 180 giri/min per 12-16 ore prima di raccogliere i batteri. Versare la coltura di E.Coli raccolta in una bottiglia di centrifuga da 250 millilitri e far girare le cellule a 14.000 G per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 30 millilitri di acqua.
Trasferire questa sospensione in un tubo di centrifuga e far girare di nuovo le celle utilizzando le condizioni precedenti. Scartare il supernatante e aggiungere 10 millilitri di tampone di cromatografia al pellet cellulare. Vortice per rimorsi le celle nel buffer.
Aggiungere vigorosamente un volume di fenolo:cloroformio e vortice per rompere le cellule. Quindi, centrifuga a 12.000 G per 10 minuti. Recuperare la fase acquosa, aggiungere vigorosamente un volume di cloroformio e vortice.
Centrifuga a 12.000 G per 10 minuti. Successivamente, filtrare la preparazione dell'RNA attraverso un filtro siringa da 45 micrometri. Purificare l'RNA usando una colonna di amina di dietile dietile etanolo collegata a un sistema di cromatografia liquida.
Regolare la portata a un millilitro al minuto ed equilibrare la colonna con 10 millilitri di tampone cromatografico. Quindi, caricare il campione e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone cromatografico. Eluire l'RNA con 20 millilitri di tampone di eluizione e raccogliere aliquote millilitre.
Usando l'elettroforesi bidimensionale in gel di poliacrilammide, separare gli RNA circolari dalle loro controparti lineari. In primo luogo, preparare un gel di poliacrilammide al cinque per cento nel buffer TBE e contenente otto urea molare come delineato nel protocollo di testo. Mescolare 20 microlitri dei preparati di RNA con un volume di buffer di carico.
Incubare a 95 gradi Celsius in un blocco riscaldante per 1,5 minuti, quindi raffreddare sul ghiaccio. Caricare i campioni nel gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi nelle condizioni appropriate per la dimensione del gel. Dopo questo, macchiare il gel in 0,5 microgrammi per bromuro di etidio millilitro per 15 minuti.
Lavare il gel macchiato con acqua, quindi visualizzare l'RNA sotto la luce UV. L'analisi elettroforetica di diversi plasmidi ricombinanti in cui sono inseriti diversi cDA mostrano migrazioni diverse rispetto a pLELVd-BZB. Si noti che pLELVd-BZB contiene il marcatore lacZ, che viene sostituito dal cDNA corrispondente all'RNA di interesse, quindi mentre la migrazione dipende dalle dimensioni del cDNA inserito, i plasmidi ricombinanti di solito migrano più velocemente del plasmide di controllo.
La produzione dell'RNA ricombinante in colture batteriche co-elettroporate viene monitorata rompendo le cellule e analizzando l'RNA denaturando PAGE. Si possono vedere bande forti, che corrispondono a forme vuote di ELVd e ELVd chimerico, in cui sono stati inseriti diversi RNA di interesse. È interessante notare che una frazione maggiore dell'RNA ricombinante è vista come una forma circolare.
La circolarità della frazione principale si osserva utilizzando una combinazione di due PAGE in condizioni di denaturazione ad alta e bassa resistenza ionica. La preparazione dell'RNA può essere ulteriormente purificata dalla cromatografia a scambio ionico. Come visto qui, l'RNA E.Coli viene efficientemente mantenuto a bassa forza ionica, e successivamente eluitato ad alta forza ionica, con la maggior parte dell'RNA raccolto in frazioni due e tre.
L'RNA ricombinante può essere ulteriormente purificato all'omogeneità per elettroforesi 2D. Questo protocollo consente la facile produzione di grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli e la purificazione all'omogeneità grazie alla circolarità del prodotto finale. Ricorda che l'RNA di interesse risulta incorporato in un'impalcatura circolare di RNA derivata da una pianta viroide.
Se si desidera separare entrambe le moieties, è necessario utilizzare una strategia standard, ad esempio ribozimi, DNAzymes o RNasi H.Il rendimento di questo protocollo dipende dal particolare RNA di interesse, poiché è probabile che i piccoli RNA vengano prodotti in quantità più elevate rispetto a quelle più grandi. Per espressioni su larga scala, prendi in considerazione che il tempo ottimale per raccogliere i batteri dipende da molti fattori tra cui il ceppo E.Coli, il mezzo di coltura e le condizioni di crescita. Si consiglia un saggio preliminare del corso di tempo per trovare la finestra di produzione ottimale nelle vostre particolari condizioni.
Ricorda che gli RRNA ricombinanti si accumulano nelle cellule batteriche in modo transitorio e che scompaiono completamente nella fase di crescita tardiva.
