Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biologia cellulare e dell'immunologia come come vengono influenzate le vie di segnalazione da diversi stimoli o farmaci? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di eseguire analisi di segnalazione a cella singola in modo medio-alto. Dopo aver nuovamente sospeso le celle in un mezzo RPMI 16/40 integrato, trasferire la quantità richiesta di sospensione cellulare nei pozzi di una piastra inferiore a V da 96 pomp po '.
Trasferire la piastra in un bagno d'acqua preriscaldato di 37 gradi Celsius e lasciare riposare lì per 10 minuti. Quindi aggiungere 60 microlitri di tampone fisso uno ad ogni pozzo di una nuova piastra di pozzo 96 per impostare la piastra fissa. Posizionare questo piatto nel bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Trasferire un campione di controllo da 50 microliter sulla piastra e mescolare tubazione su e giù. Facoltativamente, aggiungere 10 microlitri per millilitro anti-IgM alle celle per iniziare il corso del tempo di simulazione e mescolare pipettando su e giù. Trasferire un campione di 50 microliter sulla piastra fissa in ogni punto del tempo, mescolando ogni campione man mano che viene aggiunto.
Dopo aver aggiunto l'ultimo campione, lasciare la piastra fissa nel bagno d'acqua per 10 minuti. In primo luogo, lavare le cellule tre volte con PBS. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Successivamente, preparare una piastra inferiore a V fresca da 96 po 'con reagenti per la posa a barre, pipettando cinque microlitri di ogni reagente di barcodifica in ogni pozzo riempiendo il numero di pozzi necessari per macchiare ciascuno dei campioni. Nella piastra cellulare fissa, rimostrare le cellule in ogni pozzo con 190 microlitri di PBS. Quindi, trasferire ogni pozzo di cellule al pozzo corrispondente nella piastra di barcodifica, mescolandoli bene accuratamente.
Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Centrifugare la piastra a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante. Dopo questo, lavare le cellule in ogni bene due volte con il lavaggio del flusso.
Quindi aggiungere 190 microlitri di lavaggio del flusso ad ogni pozzo di cellule. Unire tutti i campioni codificati a barre in un tubo da 15 millilitri e trasferire ogni controllo di compensazione in un tubo separato da 1,7 millilitri. Centrifugare a 500 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.
Per iniziare, trasferire due millilitri di tampone perm tre in un tubo da 15 millilitri. Conservare a meno 20 gradi Celsius in modo che sia ghiacciato quando usato. Quando è pronto, aggiungere 1,5 millilitri di tampone perm ghiacciato al tubo da 15 millilitri contenente la popolazione di celle codificate a barre per poco tempo mentre si vortice per evitare il raggruppamento cellulare.
Aggiungere 100 microlitri di tampone perm ghiacciato a ciascuno dei controlli di compensazione nello stesso modo. Trasferire immediatamente le celle in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per un minimo di 30 minuti. Quando è pronto per iniziare la colorazione dell'antigene, rimuovere le cellule dal congelatore e trasferirle in una scatola di ghiaccio.
Lavare le cellule tre volte con un eccesso di lavaggio del flusso. Centrifugare le cellule a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo la popolazione cellulare codificata a barre in un volume di lavaggio del flusso, tale che ci sono 25 microlitri di sospensione cellulare per macchia fosfo-anticorpale.
Sospendere di nuovo i controlli di compensazione in 200 microlitri di lavaggio del flusso. Per iniziare a preparare gli anticorpi per la colorazione, aggiungere 10 microlitri di anticorpo fosfo-specifico, diluiti nel lavaggio del flusso, ad ogni pozzo di una piastra fresca con fondo a V da 96 po '. Aggiungere 15 microlitri di marcatore di superficie, diluiti nel lavaggio del flusso e 25 microlitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo per un volume finale di 50 microlitri per pozzo.
Lasciare riposare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo questo, lavare le celle macchiate due volte con il lavaggio del flusso. Centrifuga a 500 volte G per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 150 microlitri di lavaggio del flusso. Quindi eseguire l'analisi della citometria del flusso come delineato nel protocollo di testo. Nel protocollo presentato, la stampa a barre tridimensionale viene eseguita combinando tre coloranti per la stampa a barre.
I singoli campioni vengono quindi de-contorti mediante successiva gating su ogni reagente di decodifica a barre rispetto all'area di dispersione laterale. I livelli di fosforilazione indotti dalla basale e stimolazione di 20 molecole di segnalazione a valle del recettore delle cellule B sono quindi caratterizzati in cellule B da pazienti affetti da CLL e controlli normali in varie condizioni. La fosfo tirosina 705 stat3 è considerata significativamente regolata.
Le cellule vengono stimolate con anti-IgM per un massimo di 30 minuti al fine di identificare aberrazioni di segnalazione indotte attraverso la via del recettore cellulare B. Mentre le cellule CLL di pazienti con IGVH non muto mostrano una maggiore sensibilità verso la stimolazione anti-IgM, è statisticamente significativa solo per la serina fosforica AKT 473. Le cellule vengono quindi esposte all'inibitore del delta PI 3-chinasi idelalisib per verificare se il segnale AKT pS473 aberrante può essere invertito.
Come mostrato qui, i livelli di aberrante sono significativamente ridotti al trattamento in modo dipendente dalla concentrazione dimostrando che gli inibitori della chinasi possono essere applicati per normalizzare la segnalazione aberrante nelle cellule CLL. Prima di tentare questa procedura è importante ricordare di titolare reagenti e anticorpi della cotofazione a barre e verificare che i marcatori di superficie selezionati siano compatibili con i reagenti di fissazione e permeabilizzazione. Le cellule devono essere in sospensione per l'analisi del fosforo, tuttavia il protocollo può essere adattato alle cellule aberranti o ai tessuti seguendo procedure per ottenere la sospensione a singola cellula, come l'intera tripzinazione.
