Questo metodo fornisce un nuovo approccio per affrontare le questioni chiave nel campo della ricerca vascolare polmonare, come il percorso molecolare dei meccanismi di proliferazione intimale nell'ipertensione polmonare. Il principale vantaggio di questo metodo è che fornisce una piccola biopsia cellulare dell'endotelio vascolare polmonare senza ulteriori rischi per il paziente. A dimostrare la procedura saranno la signorina Reina Perez, la nostra coordinatrice clinica, e il dottor Phillip Gallo, il direttore del mio laboratorio.
Dopo che il catetere è stato ritirato dalla zattera, immergerlo immediatamente in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente 40 millilitri di soluzione salina sterile refrigerata. Ruotare il catetere più volte per rimuovere il sangue e sciacquare la linea se necessario per rimuovere il sangue trattenuto al suo interno. Tagliare il distale di cinque centimetri della punta del catetere e lasciare cadere nel tubo della centrifuga.
Utilizzare le forcep per rimuovere immediatamente la punta e trasferirla in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 15 millilitri di mezzo di crescita cellulare endoteliale. Quindi, sigillare il tubo. Metti il tubo sul ghiaccio e trasferiscilo in laboratorio.
Elaborare immediatamente il campione o imballare il campione su ghiaccio umido per la spedizione notturna al laboratorio in cui si verificherà la lavorazione. È fondamentale che il palloncino rimanga immerso nel mezzo. Quindi assicurati che ci sia uno spazio minimo per la testa nel tubo da 15 ml riempiendoli completamente con un mezzo di crescita cellulare endoteliale.
In primo luogo, aggiungere cinque millilitri di soluzione di distacco cellulare a un tubo di centrifuga pulito da 15 millilitri. Metti questo tubo sul ghiaccio. Utilizzando una siringa millilitro, disegnare un millilitro di supporti cellulari endoteliali da ciò che rimane nel tubo di raccolta del comodino.
Inserire con cura l'ago della siringa da un millilitro nel foro bianco opposto al filo guida. Posizionare la punta del catetere nel tubo di centrifuga da 15 millilitri che contiene la soluzione di distacco cellulare. Gonfiare il palloncino con circa 200 microlitri di supporti, facendo attenzione a non scoppiarlo.
Posizionare il tubo sul ghiaccio e lasciare che il catetere si sieda nella soluzione di distacco cellulare per cinque minuti con il palloncino gonfiato. Dopo questo, versare il contenuto del tubo in un piatto da 100 millimetri, assicurandosi che il palloncino sia posto in questa pozzanghera di soluzione di distacco cellulare. Usando un raschietto cellulare, raschiare il palloncino gonfiato, concentrarsi sui poli del palloncino dove incontra il catetere.
Assicurarsi quindi che il raschietto della cella contatti l'intera superficie del palloncino almeno due volte e risciacqui periodicamente il raschietto cellulare nella soluzione di distacco cellulare. Sgonfiare il palloncino e raschiarlo con un movimento di spazzolatura. Quindi sciacquare il raschietto cellulare nella pozzanghera della soluzione di distacco cellulare.
Scartare la punta del catetere, l'ago e il raschietto cellulare in un contenitore di rifiuti appropriato. Versare la soluzione di distacco cellulare che contiene la raccolta cellulare in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Agitare il tubo di raccolta e versare anche il supporto rimanente da esso nel campione raccolto.
Centrifugare il campione a 650 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare il supporto, facendo attenzione a non disturbare o aspirare il pellet. Rimescolare il pellet in un milliiter di soluzione dilisi dei globuli rossi refrigerati e trasferire questa sospensione in un tubo di centrifuga da 1,5 microlitri e scuotere delicatamente il tubo a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Centrifugare il tubo a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aspirare la soluzione di lisi dei globuli rossi. Resuspend il pellet in una soluzione contenente PBS, blocco FcR e microperline CD-146 anti-umane.
Incubare a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un millilitro di PBS refrigerato. Centrifuga a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di PBS refrigerato. Quindi, posizionare una colonna LS magnetica su un rack magnetico a temperatura ambiente. Innescare la colonna aggiungendo un millilitro di PBS e permettendo all'intero volume di fluire.
Scartare il flusso. Caricare il campione sulla colonna magnetica ed eliminare il flusso. Lavare la colonna tre volte utilizzando tre millilitri di PBS refrigerato per ogni lavaggio.
Scartare tutto questo flow-through. Quindi aggiungere tre millilitri di PBS refrigerato a un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Rimuovere la colonna magnetica dal rack e versare il PBS dal tubo nella colonna.
Posizionare rapidamente la colonna nel tubo di centrifuga per catturare il flusso. Immergersi immediatamente con lo stantuffo fornito con la colonna. Il campione è ora purificato e pronto per la fissazione, la colorazione o la coltura.
In questo studio, le cellule vengono purificate dalle punte del catetere Swan-Ganz dopo la cateterizzazione cardiaca destra. Queste cellule si legano a una colonna di selezione CD-146 e hanno profili di dispersione avanti e laterale indistinguibili dalle cellule endoteliali dell'arteria polmonare umana primaria coltivata. Poiché il palloncino del catetere è solo a contatto fisico con la torcia dell'introvo, la parete polmonare del vaso dell'arteria e il sangue, e le cellule hanno dimostrato di non derivare dal sangue, si presume quindi che derivino dalla parete polmonare del vaso dell'arteria.
Seguendo la procedura le cellule raccolte possono essere analizzate con una varietà di metodi, come citometria del flusso, qPCR, sequenziamento e proteomix. Le rese cellulari sono troppo basse per la macchia occidentale convenzionale, ma potrebbero essere prese in considerazione metodologie di soffiatura a basso input. Le cellule possono essere coltivate, ma questo è molto difficile, e non sempre ha successo nelle nostre mani.
Se si vuole tentare la coltura, è importante ridurre al minimo l'intervallo tra la raccolta della punta del catetere dal paziente e le fasi finali di purificazione e placcatura e assicurarsi che il campione sia tenuto freddo durante tutte le fasi di manipolazione del metodo. Non dimenticare che questo protocollo prevede di lavorare con sangue e tessuti umani. Devono essere osservate precauzioni universali.
In particolare, c'è un passo all'inizio del protocollo che prevede l'inserimento di un ago affilato nell'estremità tagliata della punta del catetere che è contaminato dal sangue del paziente. Non dimenticare mai che la punta del catetere deve essere tenuta con emostati durante questo passaggio, non con le dita, al fine di evitare il rischio di un bastone d'ago.
