Diese Methode bietet einen neuen Ansatz, um Schlüsselfragen auf dem Gebiet der lungenvaskulären Forschung anzugehen, wie den molekularen Pfad von Mechanismen der intimen Proliferation bei pulmonaler Hypertonie. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es eine winzige zelluläre Biopsie des pulmonalen vaskulären Endothel ohne zusätzliches Risiko für den Patienten bietet. Die Vorführung des Verfahrens wird Miss Reina Perez, unsere klinische Koordinatorin, und Dr.Phillip Gallo, der Leiter meines Labors, zeigen.
Nachdem der Katheter aus der Hülle genommen wurde, tauchen Sie ihn sofort in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit 40 Millilitergekühlter steriler Saline ein. Wirbeln Sie den Katheter mehrmals, um Blut zu entfernen, und spülen Sie die Linie, wenn nötig, um das darin zurückgehaltene Blut zu entfernen. Schneiden Sie die distalen fünf Zentimeter der Katheterspitze ab und lassen Sie sie in das Zentrifugenrohr fallen.
Verwenden Sie Zangen, um die Spitze sofort zu entfernen, und übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr, das 15 Milliliter Endothelzellwachstumsmedium enthält. Als nächstes versiegeln Sie das Rohr. Legen Sie die Röhre auf Eis und übertragen Sie sie ins Labor.
Entweder verarbeiten Sie die Probe sofort oder verpacken Sie die Probe auf nassem Eis für den nächtlichen Versand in das Labor, wo die Verarbeitung stattfinden wird. Es ist wichtig, dass der Ballon im Medium eingetaucht bleibt. Stellen Sie also sicher, dass der Kopfinder in dem 15 ml-Rohr minimal enthin ist, indem Sie es vollständig mit einem endothelialen Zellwachstumsmedium füllen.
Fügen Sie zunächst fünf Milliliter Zellablösung zu einem sauberen 15 Milliliter Zentrifugenrohr hinzu. Legen Sie diese Röhre auf Eis. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze einen Milliliter Endothelzellmedien aus dem, was im Nachtrohr verbleibt, ziehen.
Setzen Sie die Nadel der ein Milliliter-Spritze vorsichtig in das weiße Loch gegenüber dem Führungsdraht ein. Legen Sie die Katheterspitze in das 15 Milliliter Zentrifugenrohr, das die Zellablösung enthält. Aufblasen Sie den Ballon mit ca. 200 Mikroliter Medien, wobei Sie darauf achten, ihn nicht zu sprengen.
Legen Sie die Röhre auf Eis, und lassen Sie den Katheter fünf Minuten in der Zellablösung sitzen, wobei der Ballon aufgeblasen wird. Danach gießen Sie den Inhalt des Rohres in eine 100-Millimeter-Schale, um sicherzustellen, dass der Ballon in dieser Pfütze der Zellablösung platziert wird. Mit einem Zellschaber, kratzen Sie den aufgeblasenen Ballon, konzentrieren Sie sich auf die Pole des Ballons, wo es den Katheter trifft.
Stellen Sie als Nächstes sicher, dass der Zellschaber mindestens zweimal mit der gesamten Oberfläche des Ballons in Kontakt kommt, und spülen Sie den Zellschaber in der Zellablösung periodisch aus. Entleeren Sie den Ballon und kratzen Sie ihn mit einer Bürstenbewegung. Dann spülen Sie den Zellschaber in der Pfütze der Zellablösung ab.
Entsorgen Sie die Katheterspitze, die Nadel und den Zellschaber in einen entsprechenden Abfallbehälter. Gießen Sie die Zellablösung, die die Zellernte enthält, in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Schütteln Sie das Sammelrohr und gießen Sie die restlichen Medien auch in die gesammelte Probe.
Zentrifuge die Probe bei 650 mal G, und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Aspirieren Sie die Medien, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören oder zu aspirieren. Setzen Sie das Pellet in einem Milliiter gekühlter roter Blutkörperchen Lyselösung aus, und übertragen Sie diese Suspension in ein 1,5-Mikroliter-Zentrifugenrohr, und schaukeln Sie das Rohr bei vier Grad Celsius für 10 Minuten sanft.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann die rote Blutkörperchen-Lyselösung ansaugen. Setzen Sie das Pellet in einer Lösung aus, die PBS, FcR-Blocker und antihumane CD-146-Mikroperlen enthält.
Bei vier Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie einen Milliliter gekühlten PBS hinzu. Zentrifuge bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Den Überstand ansaugen und das Pellet in einem Milliliter gekühlten PBS wieder aufhängen. Als nächstes legen Sie eine magnetische LS-Säule auf ein magnetisches Rack bei Raumtemperatur. Primieren Sie die Spalte, indem Sie einen Milliliter PBS hinzufügen und das gesamte Volumen durchfließen lassen.
Entsorgen Sie den Durchfluss. Laden Sie die Probe auf die magnetische Spalte, und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitergekühlten PBS für jede Wäsche.
Verwerfen Sie all diesen Durchfluss. Dann drei Milliliter gekühlten PBS zu einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen. Entfernen Sie die Magnetsäule aus dem Rack, und gießen Sie den PBS aus dem Rohr in die Säule.
Legen Sie die Säule schnell in das Zentrifugenrohr, um den Durchfluss zu fangen. Sofort mit dem mitgelieferten Kolben eintauchen. Die Probe ist nun gereinigt und bereit für Fixierung, Färbung oder Kultur.
In dieser Studie werden die Zellen nach der rechten Herzkatheterisierung von Swan-Ganz Katheterspitzen gereinigt. Diese Zellen binden an eine CD-146-Auswahlspalte und verfügen über vorwärts- und seitliche Streuprofile, die nicht von kultivierten primären menschlichen Lungenarterien-Endothelzellen zu unterscheiden sind. Da der Katheterballon nur in körperlichem Kontakt mit der Einfänglichenscheide, der Gefäßwand der Lungenarterie und dem Blut steht und die Zellen nachweislich nicht aus dem Blut stammen, wird davon ausgegangen, dass sie von der Gefäßwand der Lungenarterie abgeleitet sind.
Im Anschluss an das Verfahren können geerntete Zellen mit einer Vielzahl von Methoden analysiert werden, wie Z. B. Durchflusszytometrie, qPCR, Sequenzierung und Proteomix. Die Zellerträge sind zu niedrig für herkömmliche Western Blot, aber es könnten niedrige Eingabeblotting-Methoden in Betracht gezogen werden. Zellen können kultiviert werden, aber das ist sehr schwierig, und es gelingt nicht immer in unseren Händen.
Wenn Kultur versucht werden soll, ist es wichtig, das Intervall zwischen der Sammlung der Kathetspitze vom Patienten und den abschließenden Reinigungs- und Beschichtungsschritten zu minimieren und sicherzustellen, dass die Probe während aller Behandlungsschritte der Methode kalt gehalten wird. Vergessen Sie nicht, dass dieses Protokoll die Arbeit mit menschlichem Blut und Gewebe beinhaltet. Universelle Vorsichtsmaßnahmen sind zu beachten.
Insbesondere gibt es einen Schritt zu früh im Protokoll, der das Einsetzen einer scharfen Nadel in das geschnittene Ende der Katheterspitze beinhaltet, die mit dem Blut des Patienten kontaminiert ist. Vergessen Sie nie, dass die Katheterspitze während dieses Schritts mit Hämostaten gehalten werden muss, nicht mit den Fingern, um das Risiko eines Nadelstocks zu vermeiden.
