Noi riconosciamo con gratitudine il gruppo di biologia delle cellule Beta all'UMass diabete centro di eccellenza per le discussioni e consigli utili. Isolotti pancreatici umani sono stati forniti dal NIDDK-finanziato integrato isolotto distribuzione programma (IIDP) alla città della speranza. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) e dall'associazione americana del diabete concedere n. 1-15-BS-003 (LCA) in collaborazione con l'ordine dell'amaranto.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato di uso e UMass Medical School istituzionale Animal Care. Gli studi umani dell'isolotto sono stati determinati mediante la UMass Institutional Review Board a non qualificarsi per revisione IRB o esenzione perché non implicano l'uso di soggetti umani.
1. isolotto isolamento e coltura
<ol><li>Isolotti di isolare e separare dalla contaminazione del tessuto esocrino e duttale utilizzando il metodo di vostra scelta. Nota: Questo metodo è stato ottimizzato utilizzando isolotti isolati di insufflazione ductal collagenosi e Ficoll separazione12 (roditore) o post-shipment isolotti dal programma integrato di distribuzione dell'isolotto (IIDP13; umani). Gli isolotti sono state raccolte a mano con una micropipetta P200.</li>
	<li>Per ottimizzare la morfologia dell'isolotto, consentire isolotti recuperare una notte nel mezzo di isolotto completa di 10 mL (RPMI con 10% FBS, penicillina/streptomicina e glucosio 5,5 mmol/L) in una camera umidificata contenente 5% CO2 a 37 ° C. Anche se questo passaggio non è necessario per ottenere le sezioni, le isolette sono più intatte dopo un periodo di recupero (Vedi Figura 2).</li>
</ol>2. isolotto fissazione
<ol><li>Utilizzando una punta di basso-associazione P200, accuratamente circa 250 isolotto equivalenti (IEQ)13 utilizzando una griglia calibrata sotto un microscopio stereoscopico in una provetta da 1,5 mL basso associazione microfuge. Basso-associazione consigli e tubi riducono la perdita dell'isolotto.</li>
	<li>Consentire isolotti a depositarsi sul fondo del tubo del microfuge. Rimuovere il surnatante maggior parte con una punta di pipetta P200, facendo attenzione a non per rimuovere qualsiasi isolotti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta in una centrifuga di Benna oscillante fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di soluzione di formalina al 10% o paraformaldeide 4% appena fatte. Difficoltà a temperatura ambiente per 30 minuti. Per i risultati testati in questo metodo, questi metodi di fissazione erano indistinguibili. Più breve fissazione può anche essere possibile; si consiglia di ottimizzare la durata della fissazione per il risultato desiderato.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo con una punta di P200.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.</li>
	<li>Procedere immediatamente alla fase successiva.</li>
</ol>3. preparazione del disco dell'isolotto (Figura 1)
<ol><li>Al primo utilizzo, sciogliere il gel (ad esempio, Histogel) a 70 ° C e fare le aliquote in 1,5 mL microfuge tubi per immagazzinaggio a lungo termine. Aliquotare il volume non è critico, poiché le aliquote possono essere riutilizzate.</li>
	<li>Caldo il gel (circa 100 µ l per campione) a 70 ° C inserendo microfuge provetta contenente l'aliquota di gel in un blocco di calore impostato a 70 ° C.</li>
	<li>Trasferimento dell'agarosi blu perline (10 µ l per ogni campione) in una provetta pulita microfuge 1,5 mL. Risospendere accuratamente le perle prima di pipettaggio. Nota: Perline blu sono mescolati con gli isolotti di assistere nell'identificazione visiva del materiale incorporato nel pulsante di agarosio e il blocco di paraffina. Il numero di perline blu utilizzato non è fondamentale per il risultato, ma evitare eccessiva Perline (> 5 x il numero di isolotti) per consentire una distribuzione ottimale degli isolotti in sezioni.</li>
	<li>Lavare le perle blue con 1mL di PBS, due volte. Per ogni lavaggio, girare le perline 1 min a 800 x g. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perline a (n+ 2) x 10 µ l di PBS, dove n è il numero di provette; ad esempio, per 2 provette dei campioni, il volume di PBS per aggiungere ai talloni sarebbe 40 µ l.</li>
	<li>Centrifugare la provetta microfuge contenente isolotti (breve rotazione a 200 x g) e rimuovere la maggior parte del surnatante. Tagliare la punta di una punta di una micropipetta 10 µ l con forbici o una lama e aggiungere 10 µ l di perline in ogni provetta dell'isolotto, utilizzando una punta pulita per ogni campione. Non mescolare (per evitare di perdere gli isolotti).</li>
	<li>Centrifugare a isolotti e perline (breve rotazione a 200 x g). Rimuovere tanto PBS come possibile con un integrale punta micropipetta 10 µ l.</li>
	<li>Marcare i vetrini microscopio per identificazione dei campioni. Due o tre campioni possono essere preparati su ogni diapositiva. Porre il vetrino sul banco vicino il blocco di calore con gel riscaldato. Tagliare le punte di tre-cinque 20 consigli di micropipetta obbligatoria bassa µ l per campione con una lama di rasoio o forbici. Caricare due P20 Micropipette con punte di taglio per consentire il rapido passaggio da uno a altro.</li>
	<li>Utilizzando la micropipetta prima, aggiungere 15-20 µ l di gel caldo al tubo microfuge isolotti/perline; miscelare immediatamente, evitando bolle; e applicare la miscela liquida di agar/isolotti/perline alla diapositiva per formare un < disco 1 cm di diametro. Posizionare il disco vicino al bordo della diapositiva, lasciando spazio per l'anello esterno gel (passo successivo). Tocca la diapositiva delicatamente un paio di volte a risolvere gli isolotti e perline.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta seconda, aggiungere 20 µ l di gel caldo alla provetta del campione. Utilizzando il prima micropipetta, mix nuovo gel con qualsiasi isolotti/perline restanti, ri-riscaldamento del blocco di calore se inizia a solidificare, quindi applicare questa miscela alla diapositiva, che circondano il disco originale. Ripetere, se necessario, con ulteriori suggerimenti pre-tagliati, fino a quando il disco è la dimensione desiderata e lo spessore. Nota: La gestione del disco gelificato è più facile se l'anello esterno è leggermente più spessa. Di solito, 3 x 20 µ l del gel è sufficiente. Questo passaggio minimizza la perdita di isolotti da tubo lavaggi e aggiunge isolotto-poveri agarosio all'esterno del disco per facilitare la gestione dei dischi.</li>
	<li>Preparare individualmente ogni disco e tenere traccia accurata di ordine del campione se posizionando più dischi su ogni diapositiva.</li>
	<li>Porre i vetrini su una superficie piana di ghiaccio bagnato, con un coperchio, per 10 minuti o fino a quando il gel si solidifica. È più difficile da far scorrere il disco fuori il vetro se si asciuga.</li>
	<li>Biopsia di etichetta elaborazione/incorporamento cassette per tessuti con la matita, uno per ogni campione. Asciugare la parte posteriore della diapositiva per evitare di bagnare la carta blu.</li>
	<li>Utilizzando il bordo non tagliente di una lama di rasoio, premere delicatamente il disco in ogni direzione per liberarlo dal vetro. Quando scivola facilmente, spingere lentamente il disco dal vetrino da microscopio sulla carta tessuto blu. Posizionare il disco, il lato piatto verso il basso, direttamente sulla carta.</li>
	<li>Mantenere il disco piatto, piegare la carta intorno al disco per evitare qualsiasi movimento, inserire il CD in carta piegata nella cassetta e chiudere la cassetta. Se il disco non scorre in modo pulito il vetro, aggiungere più gel e/o ritorno lo scivolo di ghiaccio per un paio di minuti.</li>
	<li>Immergere la cassetta in PBS in un becher. Processo per lo stesso giorno per morfologia ottimale di inclusione a paraffina.</li>
</ol>4. inclusione in paraffina
Nota: Processo il gel dell'isolotto dischi a blocchetti di paraffina usando una serie di disidratazione abbreviato come descritto di seguito. Questa tecnica è stata ottimizzata utilizzando un processore automatizzato, ma l'elaborazione manuale dovrebbe produrre risultati simili.
<ol><li>Immergere le cassette in 85% di etanolo per 15 minuti.</li>
	<li>Immergere le cassette in etanolo al 95% per 15 minuti.</li>
	<li>Immergere le cassette in etanolo al 100% per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Immergere le cassette in xilene per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Immergere le cassette in paraffina fusa per 10 minuti.</li>
	<li>Trasferire cassette al fresco paraffina fusa per 10-30 minuti.</li>
	<li>Aprire la cassetta con cautela e scartare la carta blu. Rimuovere il disco di gel, tenendo traccia della superficie piana che si opponeva alla carta. Incorporare il disco in uno stampo piccolo, con la superficie piatta (isolotto-contenenti) verso il basso, parallelo alla superficie di taglio. Per la spina, attentamente rimuoverlo dal cassetto e incorporarlo in uno stampo piccolo con la punta rivolta verso la superficie di taglio.</li>
</ol>5. paraffina sezionamento e colorazione
<ol><li>Etichettare i vetrini in sequenza se le sezioni di serie sono necessari.</li>
	<li>Hanno 5 µm paraffina sezioni tagliate da un esperto istotecnico. Per massimizzare la resa, salvare tutte le sezioni contenenti materiale. In genere, raccogliendone 20 sezioni, cattura della maggior parte del materiale.</li>
	<li>Memorizzare sezioni a temperatura ambiente. Le sezioni sono suscettibili di immunofluorescenza (ad es., insulina, glucagone e DAPI) e le macchie istologiche sistematiche (ad es., H & E). Ottimizzare la fissazione per altri antigeni, se necessario.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

Questo metodo di incorporamento gel a base di disco modificato fornisce un semplice, poco costoso e un modo efficace per generare un rendimento elevato degli isolotti per ogni sezione. Costruire il disco gel su una superficie di vetro piano facilita spalmare isolotti in una distribuzione uniforme su un'area ben definita. Diffondere gli isolotti in un disco piatto offre il vantaggio di immissione molti isolotti nel piano della sezione, ottimizzando il rendimento e permettendo minori isolotti essere utilizzato. Lo spessore del disco può essere regolato per soddisfare le esigenze degli investigatori. Poiché possono essere ottenuti più sezioni, sezioni di serie degli isolotti stessi possono essere analizzate, aumentando il numero di risultati distinti che possono essere misurati sullo stesso campione sperimentale. Anche se qui ottimizzato per isolotti pancreatici, la tecnica potrebbe essere applicata ad altro materiale di basso-abbondanza, compresi quelli con piccoli pezzi, natura friabile o campioni viscosi che altrimenti sarebbe difficili processo. Questo metodo è ottimizzato per isolotti fresco-fisso e non è stato testato per altri tipi di materiale, come isolotti precedentemente congelati. Queste sezioni possono anche essere utili per analisi di ibridazione in situ rilevare il DNA o RNA. L'aggiunta di extra gel serve a due scopi: per massimizzare la raccolta di isolotto e per proteggere il centro ricco di isolotto disco da distruzione durante la movimentazione/trasferimento. Il disco di gel sottile si solidifica rapidamente e permette di xilene e la disidratazione ridotta passi di infiltrazione per inclusione in paraffina. Formando il disco su una superficie piana piuttosto che in un contenitore secondario (microfuge tubo o cultura piastra ben) rende più facile per trasferire fisicamente il disco alla cassetta per l'elaborazione. Quando confrontato con i risultati di tecnica del disco, la tecnica di Conetti aveva ridotto rendimento dell'isolotto e a blocchi di distribuzione dell'isolotto, anche se la disposizione del tessuto non planari potrebbe generare un numero maggiore di isolotto-contenente sezioni.
I passaggi critici del protocollo includono fissazione del tessuto, formazione del disco gel, paraffina incorporamento e sezionamento. Per quanto riguarda la fissazione, come provato da H & E e immunofluorescenza per insulina e glucagone, nessuna differenza è stata rilevata tra PFA e formalina o fissazione durata che variano da 10-30 minuti (non mostrati). Tuttavia, durata e intensità di fissazione dovrebbe essere ottimizzati per le esigenze dell'utente finale. La principale innovazione contenuta in questo protocollo è la preparazione del disco dell'isolotto gel; fasi critiche sono riassunti nella Figura 1. Passaggi chiave includono utilizzando una piccola quantità di gel per concentrare il tessuto in una piccola area e formando il disco su una superficie piana per organizzare il tessuto in un unico piano per il sezionamento. Uso di basso-associazione microfuge tubi e suggerimenti e una centrifuga di Benna oscillante per tutte le rotazioni migliora la resa del tessuto; isolotti stick di plastica dopo la fissazione. Aggiunta di perline facilmente visibile assiste con formazione di disco, l'incorporamento e sezionamento. Rimozione tanto PBS come possibile prima di aggiungere che il gel è fondamentale per evitare di diluire l'agarosio, che conduce al povero solidificazione e difficoltà di trasferimento del disco alla carta. Mantenendo intatto il disco sottile mentre facendolo dal vetrino del libro può essere impegnativo. In caso di una ruga nel disco, lasciarla tornare nella posizione originale, aggiungere più gel e ri-chill la diapositiva. Per quanto riguarda l'inclusione in paraffina, è importante che il disco verranno incorporate flat-lato verso il basso e parallelo al piano di taglio. Un istotecnico sperimentato con il taglio di sezioni della paraffina è essenziale per il successo di questa procedura, poiché il materiale è concentrato all'avanguardia del blocco. Esposto a eccessivo fuori il blocco può portare alla perdita del campione. Si raccomanda di iniziare la raccolta delle sezioni, non appena le perline blue sono visibili.
Durata e intensità di fissazione deve essere ottimizzati per tessuto specifico e le esigenze dell'utente finale. Il numero di isolotti utilizzato per campione può essere modificato se necessario; Tuttavia, riducendo il materiale di partenza genera sezioni con isolotti minori. Dischi più spessi o più grande possono essere generati usando questa tecnica; disidratazione e xilene infiltrazione passi potrebbero essere necessario essere allungato e dovrebbero essere ottimizzati. Se sezioni risultanti contengono solo una forma di parziale disco, considerare la possibilità che il disco non è stato incorporato paralleli alla superficie di taglio. Se si ottengono sezioni troppo pochi, il tecnologo può aver perso materiale durante la preparazione del blocco iniziale.
Questo metodo genera sezioni contenenti tessuto fisso dell'isolotto e, come tale, può essere utilizzato solo per i risultati istologici. Per ottenere un gran numero di isolotti per ogni sezione, 200-250 IEQ materiale di partenza è stato utilizzato, che è una sfida di generare per alcuni tipi di esperimento. Sezioni di alta qualità sono dipendenti avendo un istotecnico esperto.
La capacità di generare 10 + sezioni contenenti molti isolotti da una sola condizione sperimentale permetterà di quantificazione dei risultati multipli sullo stesso materiale, migliorando l'efficienza sperimentale. Analisi di routine degli isolotti intatti possono condurre a progressi nella comprensione nella eterogeneità del tessuto, non solo a livello cellulare, ma anche a livello dell'isolotto, su cui poco è attualmente capito. Applicando questa tecnica ad altri campioni di tessuto limitata-abbondanza può offrire benefici per altri campi pure.

Isole di Langerhans, la sola fonte di insulina, di circolazione sono un tessuto critico per gli investigatori studiando il diabete mellito. Da qualsiasi dato organismo, isolotti hanno dimensione variabile, frequenza di tipo cellulare e architettura1,2,3. La strategia convenzionale di studiare in vivo struttura e composizione endocrina delle cellule degli isolotti pancreatici è sezionando pancreas tessuto4,5. Poiché gli isolotti comprendono solo una piccola frazione del totale contenuto cellulare pancreatica, gli studi molecolari sono svolti su isolotti isolati. Ex vivo dell'isolotto cultura esperimenti di verifica risposta a nutrienti, modulazione genica (trasfezione, trasduzione), o trattamenti sperimentali forniscono comprensione importante nei meccanismi che modulano la funzione, la proliferazione e sopravvivenza delle cellule endocrine 5 , 6.
Ex vivo esperimenti isolotto spesso sono analizzati utilizzando gli studi molecolari degli isolotti interi o studi istologici o molecolari delle cellule dell'isolotto disperso coltivate in monostrato5,6. L'analisi molecolare degli isolotti interi introduce l'avvertimento serio di mescolanti tipi di cellule, che possono produrre risultati falsi-negativi o falsi positivi quando estrapolati per qualsiasi tipo di cellula individuale. Dispersione delle cellule sul coprioggetto per post-cultura microscopia permette la misura di esito di cellula-tipo-specifico, ma sconvolge architettura dell'isolotto, che può alterare la risposta ad intervento e preclude l'identificazione dei risultati legati al architettura. Inoltre, generalmente solo un singolo risultato può essere misurato; ad esempio, per misurare la proliferazione delle cellule beta e la morte delle cellule beta nelle stesse condizioni, due esperimenti separati devono essere eseguite. Questi approcci sono anche ciechi alla variabilità inter-isolotto, un'area di crescente interesse nel campo. Le cellule dell'isolotto ordinamento tramite flusso cytometry per studi molecolari specifici del tipo di cellula o di cella singola RNA studi sono eleganti ma costoso, richiede tempo, limitato da abbondanza di tessuto, eradicare l'architettura e non ben si adatta ad analisi di routine delle cellule cultura 5 , 7. formazione immagine confocal di intero-monta immunostained isolotti fornisce dati intatti-architettura di alta qualità, ma è alta intensità di manodopera, e i dati ottenuti da ciascun campione sono limitati ai risultati identificabili in un singolo immunostaining8.
La capacità di generare sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti interi post-cultura consentirebbe di affrontare molte di queste preoccupazioni. Tessuto dell'isolotto ad alto costo, basso-abbondanza da modelli genetici unici o da donatori di organi umani, o isolotti stato post in vivo o in vitro manipolazione sperimentale, sono preziosi. Come ottenere di più sezioni di paraffina dalle isolette stesse consentirebbe analisi multiple di cellula-tipo-specifico, architettura intatta dallo stesso esperimento.
Le tecniche esistenti per generare pellet dell'isolotto per il sezionamento sono imperfette. Istologia-ottimizzato dell'agarosi sono un gel acquoso basso punto di fusione che è ampiamente usato nell'elaborazione di campioni istologici e citologici inclusi campioni di tessuto piccolo o frammentati che sono difficili da processo9. Un isolotto l'incorporamento di approccio è quello di sospendere gli isolotti in agarosio in un tubo del microcentrifuge, centrifugare a pellet il materiale, recuperare la spina di agar, poi elaborare e incorporare per il sezionamento10,11. Estrarre il campione solidificato dalla parte inferiore del tubo è che richiede tempo e difficile, portando a occasionali frammentazione del campione e rischio di lesioni personali. Gli isolotti sono concentrati nella punta della spina, che conduce alla distribuzione inadeguata dell'isolotto in sezioni ottenute da questo metodo. Il fondo rotondo della spina complica l'incorporamento tale che una regione dell'isolotto-poveri può essere presentata per il sezionamento. Nel complesso, questo metodo porta a bassa resa e distribuzione ragruppata isolotto nelle sezioni risultante.
Questo nuovo metodo è un approccio semplificato e migliorato per la preparazione di sezioni dell'isolotto. Gli isolotti sono concentrati in un piccolo volume e poi messo sulla superficie liscia di un vetrino da microscopio per formare un piccolo disco, con gli isolotti in un unico piano. Il disco Histogel-isolotto è successivamente trattato per inclusione in un protocollo di infiltrazione di xilene e ridotta disidratazione a paraffina. L'approccio precedente, che si concentra sugli isolotti nella parte inferiore di un tubo di microfuge, avviene anche come termine di paragone. Questa nuova tecnica migliora il rendimento degli isolotti per ogni sezione, la distribuzione degli isolotti in ogni sezione e richiede meno tempo per trasferire i blocchi dell'isolotto a cassette. Questa tecnica è utile per i biologi dell'isolotto o altri gli scienziati che studiano i piccoli pezzi di tessuto che desiderano massimizzare produttivo utilizzano di un tessuto basso-abbondanza misurando i risultati multipli su un singolo campione nella sua architettura di tessuto nativo.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ranin Classic Starter Kit</td><td>ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (1000 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (200 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (20 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (10 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin solution</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose blue beads- Affi-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing cassette</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000 tissue processor</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finesse ME+</td><td></td></tr><tr><td>Insulin antibody</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon antibody</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Gli esperimenti usando isolotti pancreatici isolati sono importanti per la ricerca sul diabete, ma gli isolotti sono costosi e di abbondanza limitata. Isolotti contengono una popolazione di cellule miste in un'architettura strutturata che gli impatti funzione e isolotti umani sono ampiamente variabile nella composizione di tipo cellulare. Attuali metodi utilizzati di frequente per studiare isolotti coltivati includono studi molecolari su isolotti interi, tipi di cellule dell'isolotto disparati lumping insieme, o microscopia o studi molecolari su cellule disperse dell'isolotto, interrompendo l'architettura dell'isolotto. Per in vivo gli studi dell'isolotto, paraffina pancreas sezionamento è una potente tecnica per valutare i risultati di cellula-specifico nell'ambiente del pancreas nativo. Studiando la post-cultura isolotti dalla divisione di paraffina sarebbe offrono diversi vantaggi: rilevamento di risultati multipli sulla stessi isolotti (potenzialmente anche lo stessa esatta isolotti, utilizzando sezioni di serie), le misure di cellula-tipo-specifico e mantenimento nativo isolotto-cellula e cellula-substrato interazioni sia durante l'esposizione sperimentale che per l'analisi. Tuttavia, le tecniche esistenti per l'incorporamento isolato isolotti post-cultura sono inefficienti, che richiede tempo, soggetta a perdita di materiale e generalmente producono sezioni con numeri di isolotto inadeguata per essere utili per quantificare i risultati. Impianti di preparazione delle cella blocco del laboratorio di patologia clinica sono inaccessibili e poco pratico per i laboratori di ricerca di base. Abbiamo sviluppato un metodo di banco migliorato, semplificato che genera sezioni con resa robusta e distribuzione degli isolotti. Fissi isolotti sono risospese in gel di agarosio istologico caldo e pipettati in un disco piatto su un vetrino standard, tale che gli isolotti sono distribuiti in un aereo. Dopo disidratazione standard e incorporamento, più (10 +) 4-5 µm sezioni possono essere tagliati dallo stesso blocco dell'isolotto. Utilizzando questo metodo, analisi istologiche ed immunofluorescenti possono essere eseguite sul topo, ratto e isolotti umani. Si tratta di un approccio efficace, poco costoso, risparmio di tempo per valutare i risultati specifici del tipo di cellula, architettura intatta da isolotti coltivati.

Un disegno schematico illustrato i passaggi per preparare il disco gel è illustrato nella Figura 1. Questo risultati del metodo di disco gel nelle sezioni della paraffina che contengono un numero sufficiente di isolotti distribuiti in un unico piano per consentire significativa quantificazione dei risultati. La figura 2 Mostra il basso ingrandimento immagini delle sezioni risultante per illustrare il numero di isolotti catturato per ogni sezione. In generale, > 35 isolotti erano visibili in ogni sezione quando IEQ 250 sono stati utilizzati per la procedura, e > 10 sezioni (4-5 µm) contenenti gli isolotti sono stati ottenuti da ciascun campione. Aumentando il numero di isolotti utilizzato per la procedura, ha aumentato il numero degli isolotti nelle sezioni. Isolotti nelle sezioni erano strutturalmente diverse e di diverse dimensioni, sostenendo il concetto che i nuovi e interessanti dati possono essere ottenuti utilizzando sezioni piuttosto che tecniche cieche alle differenze inter-isolotto. Il metodo ha funzionato altrettanto bene per roditore isolotti isolati in laboratorio (ratto, topo) e per isolotti umani pervenuti dopo la spedizione del IIDP. Isolotti roditore ha avuto di gran lunga più morfologia intatto dopo post-isolamento recupero durante la notte in mezzo dell'isolotto, con una superficie liscia e arrotondata e compatta di forma sferica (Figura 2A). Umano dell'isolotto morfologia era simile quando incorporato il giorno di arrivo o quando incorporato dopo il recupero post-spedizione durante la notte, forse perché le isolette avevano già recuperato dallo sforzo di isolamento prima della spedizione. Il metodo di Conetti ha reso un'area di sezione trasversale di tessuto più piccola, con meno isolotti per ogni sezione e densamente imballato isolotti e perline (Figura 2B). Le immagini di Conetti illustrate nella Figura 2B erano il meglio che siamo riusciti a ottenere con questo metodo; uno dei campioni doveva essere rispedito indietro per tagliare più sezioni perché nessun isolotti sono stati trovati nel primo set di sezioni.
Questa tecnica genera sezioni di isolotto di alta qualità per istologici e di immunofluorescenza colorazione (Figura 3). Insulina e glucagone che macchia ha mostrato la composizione varia e l'eterogeneità dell'architettura dell'isolotto. Le sezioni si ricapitola chiaramente le differenze di architettura noto tra umani, isolotti di topo e di ratto, con isolotti umani composto da α-cellule abbondanti mescolareate con le cellule beta, mentre gli isolotti di topo e nel ratto hanno mostrato architettura simile con un nucleo delle cellule beta e le cellule alfa nella periferia. Le sezioni di serie erano ottenibili; i pannelli in Figura 3 mostrano le sezioni di serie dello stesso isolotto macchiato per H & E (sinistra) e immunofluorescenza (a destra).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig1.jpg"> Figura 1 . Illustrazione delle fasi critiche per rendere il disco di gel dell'isolotto. Gel riscaldato a 70 ° C in un blocco di calore (A) viene trasferito nella provetta di microfuge obbligatoria bassa contenente il pellet isolotto/tallone (B). Gli isolotti sono risospese in gel caldo e trasferiti ad una lastra di vetro, diffondendo il materiale a forma di disco (C-D). Ulteriori gel pulito viene trasferito al tubo microfuge, quindi tutto il materiale restante è rimosso e diffondere circonferenzialmente intorno al disco iniziale dell'isolotto/tallone-contenente su vetrino (E-F). Dopo la gelificazione sul ghiaccio, il disco è trasferito, piatto laterale verso il basso, al libro di istologia (G), che è piegato e messo in un cassetto (H) per l'elaborazione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57931/57931fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig2.jpg"> Nella figura 2. Sezioni della paraffina di gel dischi contengono un gran numero di isolotti ben distribuiti. Pannelli di ingrandimento basso (A) (40 X, 3 x 3 immagini cuciti insieme, con sovrapposizione di 15%) di topo, ratto o sezioni umano dell'isolotto macchiati con H & E mostrano che molti isolotti sono visibili in ogni sezione. Inserti ad alto ingrandimento (200x) Visualizza rappresentante isolotti. Pannelli a sinistra Visualizza sezioni di isolotti incorporati immediatamente dopo l'isolamento (topo, ratto) o spedizione (umana); pannelli di destra mostrano isolotti incorporati dopo il recupero durante la notte nella cultura. Cerchi blu pallidi visti in 40 immagini di X sono le perle incluse per visualizzazione durante l'incorporamento e sezionamento. Questi esempi particolari sono da un topo C57BL/6N (1 anno) e di BBDR ratto (4 settimane), isolotti isolati dall'iniezione di collagenasi ductal e separazione Ficoll e isolotti umani T2D ricevuti dalla IIDP. (B) 250 IEQ degli isolotti umani incorporato per la vecchia tecnica di microfuge tubo, per il confronto. Pannelli di ingrandimento a bassa (40 X; un singolo unstitched immagine catturata tutto il materiale) e inserti di alta mag (200 X) Visualizza sezioni rappresentative. Terreno di coltura è stato RPMI con 10% FBS, penicillina/streptomicina e glucosio 5,5 mmol/L. Barre della scala per i pannelli a basso ingrandimento sono 1000 µm; barre della scala per i pannelli ad alto ingrandimento sono 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57931/57931fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57931/57931fig3.jpg"> Figura 3 . Rappresentante istochimici e immunofluorescenza che macchia su sezioni seriali isolotto. Sezioni di topo, ratto e isolotti umani incorporato dopo una notte cultura erano macchiate per H & E e ripreso da microscopia in campo chiaro (200 X; sinistra). Una sezione adiacente era macchiata per insulina (rosso), glucagone (verde), montato in supporti contenenti DAPI (blu) e imaging utilizzando la microscopia fluorescente (200 X; diritto). Scala bar: 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57931/57931fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  UMass Medical School. Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Video: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Protocollo di raccolta per pancreas umano

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Ricerca

Medicina

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Biologia dello sviluppo

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Bioingegneria

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Neuroscienze

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologia e infezioni

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Biologia

Affettare il pancreas umano per la ricerca sulla funzione delle isole

Generating Human Pancreatic Tissue Slices to Study Endocrine and Exocrine Pancreas Physiology

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the pancreas endocrine and exocrine physiology and interplay. Much has been learned from the study of isolated pancreatic islets, but this prevents examining their function and interactions in the context of the whole tissue. Pancreas slices provide a unique opportunity to explore the physiology of normal, inflamed, and structurally damaged islets within their native environment, in turn allowing the study of interactions between endocrine and exocrine compartments to better investigate the complex dynamics of pancreatic tissue. Thus, the adoption of the living pancreas slice platform represents a significant advancement in the field. This protocol describes how to generate living tissue slices from deceased organ donors by tissue embedding in agarose and vibratome slicing as well as their utilization to assess functional readouts such as dynamic secretion and live cell imaging.

Autore in primo piano: Far progredire la ricerca sul diabete di tipo 1 utilizzando piattaforme innovative per fette pancreatiche

This protocol describes how to generate human pancreas slices from deceased organ donors to study cell function under near-physiological conditions. This innovative approach enables the investigation of normal and structurally damaged islets and the intricate interplay between endocrine and exocrine compartments.

Generazione di fette di tessuto pancreatico umano per studiare la fisiologia del pancreas endocrino ed esocrino

It is crucial to study the human pancreas to understand the pathophysiological mechanisms associated with type 1 (T1D) and 2 diabetes (T2D) as well as the ...