Ringraziamo i membri del laboratorio Ninov per commenti sul manoscritto, membri del centro per strutture di pesce e microscopia di Dresda di terapie rigenerative (CRTD) per assistenza tecnica. N.N. è sostenuto da finanziamenti da DFG-CRTD, Cluster of Excellence di TU-Dresden, Fondazione di ricerca tedesca (DFG) e il centro tedesco per la ricerca di diabete (DZD).

Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate dall'Animal Welfare Act e con permesso della Landesdirektion Sachsen, Germania (AZ 24 – 9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. preparazione
Nota: Questo protocollo è per l'ex vivo imaging di zebrafish isolotto primario da doppi transgenici Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); TG (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. In questa linea transgenica, il promotore di insulina (ins) unità espressione specifica della cellula beta di due transgeni: nls-Renilla-mKO2, che segna il nucleo delle cellule beta con monomerico Kusabira orange 2 (mKO2) fluorescenza; e GCaMP6s15, che emette fluorescenza verde in risposta all'aumento dei livelli di calcio intracellulare. L'espressione della beta-cellula-specifico di GCaMP6s permette di studiare la reattività del glucosio delle cellule beta senza interferenze dalla variazione del calcio che circondano i tipi delle cellule.
<ol><li>Preparare il brodo di fibrinogeno fresco (10 mg/mL) sciogliendo 10 mg di fibrinogeno bovino in 1 mL di Ca2 +/Mg2 +-contenente soluzione salina bilanciata Hanks' (HBSS) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Vortice energicamente fino a quando la polvere di fibrinogeno si dissolve completamente. Mantenere la soluzione a temperatura ambiente per almeno 15 minuti di più. Nota: Lo stock può essere mantenuto a temperatura ambiente per 2 – 3 h. scartare il brodo se la soluzione inizia a polimerizzare e diventa viscosa.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro di fibrinogeno (3,3 mg/mL) diluendo il brodo di fibrinogeno triplice in HBSS. Per esempio, mix 300 µ l di brodo di fibrinogeno in 600 µ l di HBSS per preparare 900 µ l di soluzione di lavoro di fibrinogeno.</li>
	<li>Preparare la soluzione di trombina (10 U/mL) sciogliendo 10 unità di trombina in 1 mL di HBSS o fosfato tampone salino (PBS). Nota: Questa soluzione può essere preparata in anticipo, aliquotata in 50 parti di µ l e congelata a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 200 mM D-glucosio soluzione sciogliendo 1,8 g di D-glucosio in 50 mL di acqua. Conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Preparare 300 mM KCl soluzione sciogliendo 1,1 g di KCl in 50 mL di acqua. Conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Procurare piatti con fondo di vetro di diametro 35 mm per gli isolotti di montaggio.</li>
	<li>Per dissezione e montaggio dell'isolotto, utilizzare un microscopio stereo dotato di Lampada fluorescenza e filtro rosso cubo (TRITC: eccitazione: 532 – 554 nm, emissione: 570 – 613 nm; o Texas-rosso: eccitazione: 540-580 nm, emissione: 592 – 667 nm).</li>
	<li>Per l'imaging l'afflusso di calcio nelle cellule beta, uso un microscopio confocale invertito (Zeiss LSM 780 o simili) con 20 X (0,8 NA) aria obiettivo e dotato di un porta targa per i piatti con fondo di vetro di diametro 35 mm.</li>
	<li>Preparare una soluzione di 200 mg/L di solfonato di tricaina metano (MS222) per eutanasia zebrafish.</li>
	<li>Procurare piastre di Petri di 90 mm per la dissezione di zebrafish.</li>
</ol>2. Zebrafish primaria dell'isolotto dissezione e montaggio
<ol><li>Eutanasia di un pesce tramite incubazione prolungata in MS222. Per questo, delicatamente togliere il pesce dal serbatoio di pesce utilizzando una rete da pesca e viene quindi incubato in una piastra Petri contenente la soluzione di MS222 fino a quando l'animale non mostra nessun movimento opercular (branchie); in genere, questo prende 5 minuti trasferimento il pesce a una piastra Petri contenente la soluzione HBSS con Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
Microscopio stereo dotato di una lampada a fluorescenza e cubo di filtro rosso, sezionare la pelle che copre il lato destro dell'addome dell'animale per isolare il pancreas.
	<ol>
<li>Per questo, tagliare la pelle di zebrafish dalla bocca alla pinna anale utilizzando pinze taglienti. Togliere la pelle tagliata per esporre l'addome; Questa cattura espone gli organi interni. Usando la fluorescenza rossa di mKO2 espressione in cellule beta, accertare la posizione degli isolotti da esame visivo sotto il microscopio. Se necessario, rimuovere i lobi del fegato, come essi potrebbero coprire l'isolotto, che lo rende difficile da trovare. Nota: L'isolotto primario si trova nei pressi della regione anteriore dell'addome, in genere sul lato destro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire l'isolotto primario rimuovendo accuratamente il tessuto circostante come fegato e adipociti. Prendere precauzioni per non ferire o poke l'isolotto; dopo l'eliminazione del tessuto circostante, le singole celle sulla superficie dell'isolotto diventano percepibile.</li>
	<li>Dispensare una goccia di 30 µ l di HBSS al centro di un piatto fondo di vetro. Trasferire l'isolotto dissecata questo calo.</li>
	<li>Lavare accuratamente l'isolotto una volta con HBSS e una volta con 30 µ l di soluzione di lavoro di fibrinogeno (3,3 mg/mL). Assicurati di evitare l'essiccazione dell'isolotto durante le fasi di lavaggio, perché in caso contrario si traduce nella morte delle cellule.</li>
	<li>Lentamente e delicatamente aggiungere 10 µ l di soluzione di trombina (10 U/mL). Lasciare intatta per 15 – 20 min. osservare che la goccia di fibrinogeno-trombina diventerà viscoso e leggermente opaco a questo punto l'isolotto e il piatto.</li>
</ol>3. Ex Vivo Live-imaging di intensità di fluorescenza di GCaMP in Zebrafish primaria isolotti
<ol><li>Aggiungere 200 µ l di HBSS sopra lo stampo e mettete il piatto con attenzione sul supporto piastra del microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo di aria X, 0,8 NA, 20 per l'imaging confocale. Individuare l'isolotto utilizzando l'opzione di campo chiaro.</li>
	<li>Utilizzo del filtro per fluorescenza rossa per visualizzare la fluorescenza di mKO2 nucleare in cellule beta, concentrarsi sull'isolotto. Diversi nuclei devono essere chiaramente visibili.</li>
	<li>Individuare un chiaro piano di imaging modificando manualmente il piano focale del microscopio confocale in modo da muoversi attraverso lo spessore dell'isolotto lungo l'asse z. Assicurarsi che il piano di formazione immagine contiene un numero sufficiente (50 – 100) delle beta-cellule per l'imaging e la luminosità della fluorescenza mKO2 nucleare è uniforme, soprattutto nel centro dell'isolotto.</li>
	<li>Impostare un'acquisizione sequenza fluorescenza GCaMP6s e mKO2 utilizzando le seguenti impostazioni nel Menu"Smart Setup": GCaMP6s, eccitazione: 488 nm, emissione: 500 – 555 nm, falso-colore: verde (Select "GFP"); mKO2, eccitazione: 561 nm (mCherry), emissione: 570-630 nm, falso-colore: rosso (selezionare "mCherry"). Nota: Con questa impostazione, il canale rosso Registra la posizione dei nuclei delle cellule beta, mentre il canale verde registrerà l'intensità di fluorescenza di GCaMP.</li>
	<li>In modalità"acquisizione" impostare la risoluzione dell'immagine a 1.024 x 1.024 pixel, velocità a 10 e con una media di 1. Iniziato un continuo registrazione selezionando l'opzione per "Time-series", e impostando la "durata" per 500 cicli, con circa 2 s tempo di acquisizione per ogni frame. Nota: I primi 50 fotogrammi della serie tempo corrispondono all'attività delle beta-cellule a concentrazione nel glucosio di 5 mM. Questa è la risposta della linea di base. Una risposta della cellula beta mostrerà inceratura e calante dell'intensità di fluorescenza verde con tempo. Abbiamo osservato che alcuni (1 – 5%) delle beta-cellule oscillano al glucosio di 5 mM.</li>
	<li>
Tenere d'occhio il ciclo di formazione immagine. Dopo i primi 50 fotogrammi, aumentare la concentrazione di glucosio della soluzione circostante fino a 10 mM senza arrestare la registrazione.
	<ol>
<li>Senza perturbare l'acquisizione dell'immagine, delicatamente Pipettare 5 µ l della mM 200 D-glucosio soluzione sulla superficie del gel che tiene l'isolotto. Acquisire 150 fotogrammi al glucosio di 10 mM. Nota: L'aumento della concentrazione di glucosio aumenterà il numero delle beta-cellule che subiscono le oscillazioni fluorescente GCaMP nel verde del canale.</li>
		<li>Garantire che i nuclei delle cellule rimangono stabili durante il processo. Se l'isolotto è agitazione estesamente durante l'acquisizione e i nuclei sono in movimento fuori dal piano focale, scartare il campione (se necessario).</li>
		<li>Attendere un sufficiente periodo di tempo per attivare la polimerizzazione dello stampo del fibrinogeno-trombina al fine di garantire la stabilità dei campioni successivi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A 200 fotogrammi, aumentare ulteriormente la concentrazione della soluzione a 20 mM pipettando delicatamente 10 µ l di 200mm soluzione di D-glucosio. Acquisire 150 fotogrammi per la concentrazione di 20 mM.</li>
	<li>Dopo 350 telai, depolarizzare l'isolotto con 30 mM di KCl. Per questo, aggiungere 20 µ l di soluzione di KCl riserva di 300 millimetri. In questa fase, osservare che le oscillazioni di fluorescenza GCaMP6s verranno interrompere e difficoltà ad alta intensità; beta-cellule che non hanno risposto al glucosio possono inoltre essere visualizzato un aumento nell'intensità di fluorescenza verde con l'aggiunta di KCL.</li>
</ol>4. quantificazione degli GCaMP traccia di fluorescenza per Beta-cellule individuali
Nota: Per tracciare e quantificare le risposte delle beta-cellule individuali ai diversi livelli di glucosio, quantificare l'intensità di fluorescenza di GCaMP per l'intero periodo di formazione immagine. Quantificazione è effettuata al cellulare ad alta risoluzione. Per questo, è necessario utilizzare FIJI20 per estrarre i valori di intensità di fluorescenza GCaMP dalle immagini (punti 4.1-4.6) e software di foglio di calcolo o R21 per eseguire l'analisi (passaggi 4.8-4.9).
<ol><li>Aprire il file di immagine in Figi utilizzando "LSM casella degli strumenti". Per questo, selezionare "Plugin | LSM Toolbox | Visualizzare la casella degli strumenti LSM". Nellacasella"LSM", fare clic su "Open LSM" e selezionare il file di immagine. Nota: Per i formati non supportati da "LSM Toolbox", convertirli prima di tiff per analisi.</li>
	<li>Estrarre le risposte delle cellule utilizzando lo strumento area di interesse (ROI) in FIJI. Aprire il "ROI Manager" nel menu "Analizza" sotto "Strumenti". Disegnare manualmente il ROI utilizzando lo "strumento di selezione poligono" situato nella barra degli strumenti.</li>
	<li>Disegnare il ROI nel canale del rosso in cui sono visibili i nuclei delle cellule beta. Selezionare il ROI tale che copre un'area che è più grande di nucleo di una cellula al fine di includere alcuni di citoplasma della cellula. Assicurarsi che la posizione di ROI è coerenza tra i fotogrammi e se necessario, regolare la posizione.</li>
	<li>Aggiungere il ROIs selezionato al "manager di ROI" cliccando sul pulsante "Aggiungi [t]". Selezionare e aggiungere più ROIs il ROI per l'ottenimento di dati su più celle.</li>
	<li>Successivamente, dal menu "Analizza", selezionare "Set di misurazioni". Selezionare "Densità integrata" per la specifica estrazione dell'intensità di fluorescenza totale all'interno dell'area.</li>
	<li>Spostare il canale verde contenente la fluorescenza di GCaMP e selezionare "Multi misura" in "Gestione ROI". Nota: Ciò fornirà le misure di intensità per le cellule in tutto il tempo-serie.</li>
	<li>Nel caso in cui la posizione di ROI deve essere regolata a causa del movimento dell'isolotto, compilare manualmente le misure di intensità in fotogrammi diversi. Copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo separato.</li>
	<li>Ottenere il timestamp dei frame immagine da "LSM Toolbox". Uso "Applica timbri | Applica timbri t | Nome del file | Dump di file di testo"per ottenere il timestamp. Salvare i timestamp usando l'opzione "Salva come", o li copia nel foglio di lavoro.</li>
	<li>Al momento di compilare i valori di intensità per tutte le celle, è necessario eseguire l'analisi una cella alla volta o automaticamente (ad esempio, utilizzando le formule di Excel o R).</li>
	<li>
Analizzare le singole celle in due passaggi.
	<ol>
<li>Nel primo passaggio, calcolare l'intensità di fluorescenza sopra la linea di base. A tal fine, è necessario calcolare l'intensità di fluorescenza della linea di base (F0) come la media delle intensità di fluorescenza per i primi 50 fotogrammi (glucosio 5 mM). Quindi sottrarre la linea di base (F0) dall'intera serie temporale (F-F0). Nota: alcune cellule possono mostrare chiare oscillazioni GCaMP sotto basale del glucosio, che in genere continuano a seguito di una stimolazione con concentrazioni più elevate. Per tali cellule, è solo possibile stimare F0 prendendo l'intensità media dei fotogrammi iniziali in cui le cellule hanno mostrato un calo in fluorescenza.</li>
		<li>Nella seconda fase dell'analisi, è possibile ottenere l'intensità di fluorescenza GCaMP finale normalizzando l'intensità di fluorescenza. Nota: Questo viene eseguito per rimuovere le differenze tra gli isolotti da diversi animali. Individuali degli isolotti visualizzare diversi livelli di emissione di fluorescenza su stimolo del glucosio.</li>
		<li>Normalizzare l'intensità di fluorescenza dividendo con il più alto valore di intensità. Per questo, calcolare l'intensità di picco (Fmax – F0) e dividere i valori basali sottratto per intensità di picco per produrre l'intensità di fluorescenza GCaMP finale (F – F0) / (Fmax – F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare le cellule che non presentano una variazione di intensità dopo stimolazione con KCl, come potrebbero essere integro o danneggiato.</li>
	<li>Per eseguire l'analisi (passaggi 4.9 – 4.10) in R, utilizzare lo script di R (plotcelltrace. R) fornito con questo manoscritto.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui dimostriamo una tecnica per la quantificazione-risposta delle cellule beta glucosio a cella singola risoluzione. Ciò è reso possibile da monitorare la concentrazione di calcio intracellulare utilizzando un indicatore di calcio geneticamente codificati, GCaMP6s. L'attività della beta-cellula è acquisito ex vivo montando l'isolotto in uno stampo di fibrinogeno-trombina. Un passaggio fondamentale del protocollo è la stabilità dello stampo. Tempo sufficiente deve essere dato per il fibrinogeno sciogliere nella soluzione di HBSS. Senza questo, la muffa non polimerizza sufficientemente per fornire la stabilità durante la sessione di imaging. Un isolotto montato in stampo di fibrinogeno-trombina e immersi in terreni di coltura delle cellule possa rimanere vitale per almeno una settimana (dati non mostrati). Alternative allo stampo di fibrinogeno-trombina, come dell'agarosi di basso-fusione, possono essere utilizzate per montare l' isolotto22. Un altro parametro critico è la dissezione dell'isolotto. Durante questo passaggio, il tessuto che circonda l'isolotto deve essere rimosso senza ferire o frugando l'isolotto. Una dissezione abile è dotato di pratica.
Una limitazione del protocollo imaging è la limitazione a un piano confocale dell'isolotto. Questo viene fatto per catturare le dinamiche di afflusso del calcio all'interno di singole cellule beta. Uno Z-stack attraverso l'intero spessore dell'isolotto conduce a bassa velocità e perdita di segnale oscillatorio da singole celle imaging. Questa limitazione potrebbe essere migliorata utilizzando mezzi più veloci di imaging confocale come microscopia di disco rotante, per consentire di catturare le dinamiche del calcio in 3 dimensioni. Un'altra frontiera sarebbe in vivo del calcio imaging12. La natura trasparente di embrione di pesce zebra o l'uso di ceppi di pigmento-meno di zebrafish adulti23 potrebbe aprire la possibilità per in vivo imaging in futuro.
L'imaging di attività della beta-cellula ad alta risoluzione spaziale e temporale consente di indagare l'eterogeneità funzionale tra beta-cellule individuali. Questo approccio può aiutare a far luce sull'esistenza di sub-popolazioni beta-cellula. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato l'esistenza delle sottopopolazioni nelle dimensioni nominali omogenee beta-cellule24,25,26. Ex vivo imaging può essere combinato con reporter genetici per la caratterizzazione della risposta della sub-popolazione a glucosio. Inoltre, combinando il programma di installazione di imaging con stimolo farmacologico può consentire per screening di composti che potrebbero migliorare la funzionalità delle cellule beta.
In sintesi, la tecnica presentata qui permette la quantificazione e confronto tra la velocità di risposta del glucosio per beta-cellule individuali. Fornisce una finestra diretta nella funzionalità delle cellule beta, un parametro importante nello sviluppo del diabete.

La nostra glicemia è mantenuta in un intervallo ristretto, in gran parte dovuto la funzione del pancreas endocrino. Il ruolo endocrino del pancreas è eseguito da degli isolotti di Langerhans, che contengono cellule disecrezione. Il beta-cellule secernenti insulina sono responsabili della riduzione dei livelli di glucosio nel sangue dopo un pasto contenente carboidrati. Secrezione di insulina insufficiente da beta-cellula può causare diabete1, che è caratterizzato da glicemia alta sostenuta. Tipo 1 e diabete di tipo 2, che attualmente affligge più di 400 milioni di persone nel mondo, conduce alla morbosità ed alla mortalità2. Indagando i fattori molecolari e ambientali che contribuiscono alla disfunzione beta-cellulare, comprenderemo meglio come diabete di tipo 2 inizia e progredisce. Inoltre, la capacità di differenziare cellule staminali umane in beta-cellule funzionali in vitro può fornire una fonte di nuove cellule beta per le terapie di sostituzione cellulare nel diabete di tipo 1. A tal fine, è importante studiare la funzione beta-cellulare e la maturazione in organismi modello genetico al fine di acquisire le conoscenze necessarie per rendere funzionale beta-cellule in un piatto.
Funzionalità delle cellule beta può essere monitorato a livello di intero-isolotto di quantificare la quantità totale di insulina secernuta in risposta a stimolazione del glucosio. Questo approccio cumulativo studia l'isolotto come un singolo gruppo di cellule senza differenziare le singole proprietà di una cella. Tuttavia, l'analisi delle risposte del glucosio delle cellule beta individuali ha rivelato una diversità nelle proprietà funzionali delle cellule beta e la presenza di eterogeneità3. Per valutare la funzione delle beta-cellule individuali, è possibile monitorare i cambiamenti intracellulari che portano alla secrezione di insulina4. La secrezione dell'insulina è preceduta da un'entrata del glucosio nelle cellule beta. Il glucosio che entra nelle cellule beta viene rapidamente metabolizzato all'ATP. Più alte concentrazioni di ATP intracellulare diminuiscono la probabilità aperta di canali di ioni del potassio ATP-sensibili che portano alla depolarizzazione della cellula beta. Depolarizzazione apre i canali ionici voltaggio-dipendenti del calcio e aumenta il calcio intracellulare. A sua volta, calcio innesca l'esocitosi di insulina, che viene rilasciato nella circolazione e abbassa i livelli di glucosio promuovendo l'utilizzazione del glucosio5,6,7.
Diverse strategie sono state applicate per studiare la funzione delle cellule beta, tra cui monitoraggio del potenziale di membrana8, visualizzazione diretta di insulina-vescicole esocitosi9e la quantificazione di intracellulare di Ca2 + afflusso come proxy per glucosio-reattività10. Fra loro, la formazione immagine del intracellulare di Ca2 + offre il vantaggio di upscaling l'analisi a più celle individuali all'interno stesso dell'isolotto11,12, consentendo per un confronto diretto della glucosio-responsività tra beta-cellule individuali. Concentrazione intracellulare di Ca2 + possa essere monitorata utilizzando coloranti fluorescenti sensibili al calcio13 o geneticamente codificato calcio indicatori (GECIs)14. Considerando che il calcio-indicatore coloranti mancanza cellula-tipo specificità, GECIs può essere espressa in uno specifico tipo cellulare di promotori specifici. Inoltre, la nuova generazione di GECIs, come GCaMP6, fornisce il migliore rapporto segnale-rumore insieme più veloce dinamica temporale15. Qui descriviamo l'utilità della nuovo-generazione di GECIs, in particolare GCaMP6s, visualizzare calcio in cellule beta a cella singola risoluzione. Applichiamo questo metodo fino all'isolotto di zebrafish primario come il nostro modello di scelta. Durante lo sviluppo embrionale, beta-cellule nell'isolotto primaria provengono da dorsale e ventrale del pancreas boccioli16. L'isolotto primario si trova in una posizione anatomica stereotipata all'interno del pancreas di zebrafish, consentendo la facile identificazione e isolamento. Beta-cellule nell'isolotto primaria sono necessari per la regolazione del glucosio, come loro ablazione genetica conduce a iperglicemia17,18. Inoltre, queste cellule beta diventano glucosio-reattiva durante i primi zebrafish sviluppo19. Questo protocollo può essere applicato anche per gli isolotti secondari, che si formano durante le fasi di post-embrionale di imaging. Il protocollo permette di immagine beta-cellule ex vivo, alle successive fasi di sviluppo e sotto le concentrazioni di glucosio definiti.

<table><tbody><tr><td>Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>By request from authors</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&amp;nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter glass-bottom dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine methane sulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R, version 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>A custom script provided with the manuscript</td></tr></tbody></table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

Beta-cellule pancreatiche rispondono all'aumento delle concentrazioni di glucosio nel sangue che secerne l'ormone insulina. La disfunzione delle cellule beta porta a iperglicemia e conseguenze gravi, pericolo di vita. Comprendere come le beta-cellule operano in condizioni fisiologiche e quali fattori genetici ed ambientali potrebbero causare loro disfunzione potrebbe portare a migliori opzioni di trattamento per i pazienti diabetici. La capacità di misurare i livelli del calcio in cellule beta serve come un importante indicatore della funzione beta-cellulare, come l'afflusso di calcio ioni Trigger rilascio di insulina. Qui descriviamo un protocollo per il monitoraggio l'afflusso di calcio glucosio-stimolata in zebrafish beta-cellule utilizzando GCaMP6s, un sensore codificato geneticamente di calcio. Il metodo consente di monitorare le dinamiche del calcio intracellulare con risoluzione di singole cellule in isolotti ex vivo montato. La glucosio-risposta delle cellule beta entro l'isolotto stesso possa essere catturata contemporaneamente sotto le concentrazioni di glucosio differenti, che suggerisce la presenza di eterogeneità funzionale tra zebrafish beta-cellule. Inoltre, la tecnica fornisce alta risoluzione temporale e spaziale, che rivela la natura oscillatoria dell'afflusso del calcio su stimolo del glucosio. Il nostro approccio apre le porte per utilizzare zebrafish come modello per studiare il contributo di fattori genetici ed ambientali alla funzione beta-cellulare e disfunzione.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, sono state analizzate le risposte del glucosio delle cellule beta in un isolotto da un 45 giorni post-fertilizzazione (dpf) zebrafish. Per questo, l'isolotto primario è stato sezionato da un animale eutanasizzato e montato nello stampo fibrinogeno-trombina in un piatto fondo di vetro. L'isolotto è stato immerso in HBSS contenente glucosio di 5 mM. La concentrazione di glucosio è stata aumentata in modo graduale per 10 mM e 20 mM. Le risposte delle beta-cellule per l'aumento delle concentrazioni di glucosio sono state registrate. Infine, le cellule beta erano depolarizzate utilizzando 30 mM KCl (Figura 1). La depolarizzazione utilizzando KCl induce voce calcio in beta-cellule sane.
Utilizzando un software di analisi dati e FIJI, l'intensità di fluorescenza GCaMP6s delle beta-cellule individuali viene estratta e normalizzato (Figura 2). Come si vede dalla traccia di intensità di fluorescenza, beta-cellule individuali Visualizza oscillazioni a fluorescenza GCaMP6s su stimolo del glucosio, che si ferma su stimolo di KCl. La tecnica fornisce una risoluzione cellulare della glucosio-reattività di beta-cellula e una finestra nella loro funzionalità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figura 1: Ex vivo live-imaging di afflusso del calcio utilizzando GCaMP6s in zebrafish beta-cellule. Un isolotto primario da Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) era montato in stampo di fibrinogeno-trombina e incubate con glucosio 5 mM (basale). Le cellule beta sono state etichettate con un pennarello rosso nucleare, mentre la fluorescenza di GCaMP6s è presente nel canale verde. L'isolotto è stato stimolato con una rampa di glucosio costituito da incubazione sequenza con 10 e 20 mM D-glucosio e depolarizzate tramite l'aggiunta di 30 mM che KCl. sagittarie contrassegno singole beta-cellule cui attività è stata analizzata. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figura 2: normalizzato GCaMP6s fluorescenza intensità-traccia per singole cellule beta. Normalizzato. GCaMP6s fluorescenza intensità-traccia per la beta-cellule contrassegnato con le frecce nella Figura 1. L'asse x indica il tempo in secondi. Nella parte superiore, bar raffigurano la concentrazione di glucosio e KCl nel medium HBSS. L'asse y indica l'intensità di fluorescenza normalizzata durante la serie temporale. Per questo, intensità della linea di base (F0) è calcolata come intensità media durante l'incubazione in glucosio di 5 mM. Questo viene sottratto da tutti i dati di serie temporali (F - F0). La previsione di intensità-over viene normalizzata dall'intensità massima visualizzato dalla cella (F - F0) / (Fmax- F0). La traccia normalizzata Mostra una risposta oscillatoria delle beta-cellule a glucosio, che si stabilizza quando le cellule sono depolarizzate con 30 mM KCl. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Funzionalità beta-cellula è importante per l'omeostasi del glucosio nel sangue, che viene valutato a cella singola risoluzione utilizzando un reporter codificato geneticamente per afflusso del calcio.

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

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Research

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Biology

14.7K Views.  TU Dresden. Funzionalità beta-cellula è importante per l'omeostasi del glucosio nel sangue, che viene valutato a cella singola risoluzione utilizzando un reporter codificato geneticamente per afflusso del calcio.

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Neuroscienze

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di pesce zebra

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autore in primo piano: Imaging in vivo dell'intero cervello di larve di pesce zebra mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Monitoraggio del comportamento e modello di attività neurale nel proencefalo del pesce zebra

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Autore in primo piano: Progressi nella ricerca sul cervello del pesce zebra adulto 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto