Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trombosi e dell'emostasi identificando soggetti più suscettibili ai processi aterotrombotici in particolare i pazienti ad alto rischio trattati con aspirina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è economica, semplice da usare, conveniente, ha un'alta efficienza e consente una rapida identificazione dei polimorfismi C924T. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul campo dell'aterotrombosi, può anche essere applicato ad altri sistemi come i polimorfismi che coinvolgono la medicina personalizzata o farmaci specifici al fine di comprendere la risposta individuale farmacologica.
A dimostrare la procedura sarà il dottor Sebastiano Ursi, tecnico del nostro laboratorio. Per preparare il tampone Tris EDTA a pH 8.0, aggiungere 200 microlitri di EDTA molare 0,5 e un millilitro di un cloruro di tris molare in un bicchiere, quindi regolare il volume a 100 millilitri con acqua sterile e conservare a temperatura ambiente. Quindi, preparare un litro di soluzione stock 10X di tampone di elettroforesi aggiungendo tutti i reagenti, quindi conservare il buffer a temperatura ambiente.
Quindi, preparare il colorante di caricamento del gel aggiungendo tutti i reagenti, quindi portare il volume a 100 millilitri con acqua sterile. Una volta preparato, conservare il colorante a quattro gradi Celsius per alcuni mesi. Aggiungere 450 millilitri di acqua a 50 millilitri di tampone TBE 10X per preparare una soluzione di tampone TBE 1X.
Aggiungere quattro grammi di agarosio in 200 millilitri di tampone 1X TBE insieme in un bicchiere da 600 millilitri per preparare 200 millilitri di gel di agarosio al 2%. Il gel di agarosio solidificato conservato a temperatura ambiente può essere riassortificato su un bagno d'acqua bollente a 60 gradi per 15-20 minuti o in un forno a microonde per 35 minuti aggiungendo un piccolo volume d'acqua per compensare l'aumento della concentrazione di agarosio. Continuare a mescolare il becher su un miscelatore magnetico per circa cinque minuti fino a quando l'agarosio è sospeso, quindi riscaldare l'agarosio su una piastra calda per circa 10 minuti o in un forno a microonde per tre minuti affinché si dissolva completamente.
Dopo la purificazione del DNA, mescolare delicatamente i campioni di DNA fresco pipettando più volte i tubi. È obbligatorio ottenere da 10 a 50 nanogrammi di un DNA modello di buona qualità estratto da campioni umani. Per questo motivo, preferiamo utilizzare una purificazione automatica del DNA piuttosto che semi-automatizzata o manuale.
Per iniziare la purificazione, quantificare e calcolare prima la purezza del DNA misurando gli assorbenti a 260, 280 e 320 nanometri, quindi diluire i campioni usando acqua sterile. Quindi, calibrare lo spettrofotometro. Per costituire la reazione PCR, aggiungere tutti i reagenti per preparare 25 microlitri di miscela master PCR in un tubo di microamplificazione da 0,2 millilitri.
Quindi posizionare i tubi PCR in un termociclometro automatizzato e amplificare i campioni di DNA purificati. Una volta terminato il programma, interrompere la reazione lasciando i tubi a quattro gradi Celsius. Aggiungere 10X tampone enzimatico cinque unità per enzima di restrizione microliter nell'acqua libera del DNA ad un volume di 22,5 microlitri.
Successivamente, aggiungere 2,5 microlitri di prodotto PCR a un nuovo tubo PCR, quindi aggiungere i 22,5 microlitri di miscela di digestione di restrizione al prodotto PCR. Incubare la miscela principale di digestione della restrizione del prodotto PCR a 37 gradi Celsius per quattro ore, quindi aggiungere 0,5 microgrammi per millilitro di bromuro di Ethidium per macchiare il gel per 10 minuti. Versare il gel sul vassoio del gel con il pettine del pozzo in posizione affinché il gel si solidifichiamo.
Ora versare la scatola di gel con 1X TBE buffer fino a quando il gel è coperto. Utilizzare punte fini per caricare sei microlitri del DNA digerito amplificato nei pozzi formati nel gel, quindi aggiungere anche un marcatore di DNA in un pozzo separato parallelo al campione. Quindi, accendere l'unità di elettroforesi.
Al fine di identificare il polimorfismo genetico C924T nel gene TBXA2R, viene eseguita l'analisi RFLP. Nel gel, mostra due bande a 395 e 144 coppie di basi per la versione di tipo selvaggio dell'allele maggiore, mentre una singola banda a 539 coppie di basi per la versione mutante dell'allele minore non indica alcun taglio da parte dell'enzima di restrizione. È interessante notare che tre bande a 395, 144 e 539 coppie di basi sono presenti per l'allele eterozigote.
Successivamente, il polimorfismo C924T viene confermato utilizzando l'analisi della sequenza. La sequenza evidenziata rappresenta il polimorfismo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se viene eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che questo metodo può essere utilizzato solo per un numero limitato di snip e per pochi esempi in una sessione di lavoro. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi snip possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'importanza di altri percorsi che coinvolgono processi aterotrombotici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia molecolare per esplorare le variazioni genetiche eccezionali in questo sviluppo e progressione iniziale.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare il genotipo del recettore Thromboxane A2 per quanto riguarda il polimorfismo C924T utilizzando l'analisi dell'elettroforesi del gel dei campioni PCR-RFLP. Non dimenticare che lavorare con bromuro di etidio e sorgenti luminose UV può essere estremamente pericoloso e precauzioni come guanti, occhiali di sicurezza o una maschera facciale e altri dispositivi di protezione devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
