Introduzione alla spettrometria di massa

Fonte: Laboratorio del Dr. Khuloud Al-Jamal - King's College London

La spettrometria di massa è una tecnica di chimica analitica che consente l'identificazione di composti sconosciuti all'interno di un campione, la quantificazione di materiali noti, la determinazione della struttura e delle proprietà chimiche di diverse molecole.

Uno spettrometro di massa è composto da una sorgente di ionizzazione, un analizzatore e un rivelatore. Il processo prevede la ionizzazione di composti chimici per generare ioni. Quando si utilizza plasma accoppiato induttivamente (ICP), i campioni contenenti elementi di interesse vengono introdotti nel plasma di argon come goccioline di aerosol. Il plasma asciuga l'aerosol, dissocia le molecole e quindi rimuove un elettrone dai componenti che devono essere rilevati dallo spettrometro di massa. Altri metodi di ionizzazione come la ionizzazione elettrospray (ESI) e la ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) vengono utilizzati per analizzare campioni biologici. Seguendo la procedura di ionizzazione, gli ioni vengono separati nello spettrometro di massa in base al loro rapporto massa-carica (m / z) e viene misurata l'abbondanza relativa di ciascun tipo di ione. Infine, il rivelatore consiste comunemente in un moltiplicatore di elettroni in cui la collisione di ioni con un anodo carico porta a una cascata di un numero crescente di elettroni, che può essere rilevato da un circuito elettrico collegato a un computer.

In questo video, la procedura di analisi ICP-MS sarà descritta dal rilevamento di ⁵⁶Fe come esempio.

ICP-MS combina una sorgente ICP (plasma accoppiato induttivamente) ad alta temperatura con uno spettrometro di massa.

I campioni devono essere in forma ionica prima di entrare nell'analizzatore di massa per essere rilevati. Il processo di digestione di campioni solidi consiste nell'incubazione di campioni solidi in acido forte e ossidante ad alta temperatura e per un periodo di tempo prolungato a seconda dell'analita metallico. Il campione viene introdotto come aerosol nel plasma ICP (temperatura di 6.000-10.000 K) per essere convertito in atomi gassosi, che sono ionizzati.

L'analizzatore di massa più comunemente usato è il filtro di massa a quadrupolo. Funziona come un filtro elettrostatico che consente solo agli ioni di un singolo rapporto massa-carica (m / z) di raggiungere il rivelatore in un dato momento. Può separare fino a 15.000 dalton (Da) al secondo e quindi è considerato avere proprietà di analisi multi-elementare simultanee. ICP-MS è un metodo molto sensibile che consente il rilevamento di elementi con concentrazioni inferiori a particella per miliardo (ppb) e inferiori a particella per trilione (ppt) per determinati elementi.

Infine, il sistema di rilevamento converte il numero di ioni che colpiscono il rilevatore in un segnale elettrico. Utilizzando standard di taratura (campioni di concentrazione nota per un determinato elemento), è possibile valutare la concentrazione di un campione per uno o più elementi di interesse.

1. Pulizia dei tubi in policarbonato

1. Utilizzare tubi in policarbonato resistenti alle soluzioni acide per la digestione dei campioni. Al fine di rimuovere qualsiasi traccia contaminante di ferro, riempire tutti i tubi con 5 ml di 0,1 M HCl.
2. Mettere i tubi a bagnomaria per 1 ora a 50 °C.
3. Lavare i tubi con 5 ml di acqua Milli-Q e asciugare i tubi in un forno o in una cappa chimica.

2. Preparazione e digestione del campione

1. Inserire 200 μL di campione in 1,8 mL di acido nitrico concentrato (65%).
2. Mettere i tubi a bagnomaria durante la notte a 50 °C. Regolare il protocollo aumentando la temperatura se è necessaria una riduzione del tempo di digestione complessivo.
3. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente.
4. Diluire i campioni aggiungendo 8 ml di acqua Milli-Q per ottenere una concentrazione finale di acido nitrico inferiore al 20% (v/v).
5. Centrifuga tubi a 3.000 x g per 10 minuti per pellettizzare eventuali residui macroscopici rimanenti.

3. Preparazione dello strumento

1. Pulire la torcia ICP utilizzando l'ultrasonicazione in acido nitrico al 5% per 15 minuti. Pulire i coni con il 5% di acido nitrico. Cambiare il tubo peristaltico. Controllare il livello dell'olio della pompa.
2. Accendere l'argon e il refrigeratore, avviare il plasma. Avviare il flusso di liquido nel plasma e attendere che lo strumento si stabilizzi, circa 20 minuti.
3. Ottimizza le tensioni dell'obiettivo. Eseguire il controllo giornaliero delle prestazioni misurando soluzioni di test contenenti Mg, In e Your per confermare la sensibilità dello strumento ICP-MS. Misurare Ce e Ba dove la forma di ossido e gli ioni a doppia carica dovrebbero rimanere al di sotto del 3%. Controllare la massa a 8 e 220 Da per misurare il segnale di fondo.
4. Lo strumento è ora pronto per l'uso.

4. Selezione del metodo dell'utente e dell'elenco dei campioni

1. Selezionare l'elemento e gli isotopi di interesse.
2. Selezionare la modalità di scansione come salto di picco.
3. Scegli un tempo di permanenza di 100 ms (minimo 50) con 40 sweep (minimo 15) per lettura. Selezionare una lettura per replica e 5 repliche (minimo 3). Il tempo totale di integrazione è di 4.000 ms. Se la quantità di campione è limitata, ridurre il tempo di permanenza, il numero di sweep e repliche mantenendo i valori superiori ai valori minimi sopra definiti.
4. Utilizzare una portata di ammoniaca (NH₃) a 0,7 ml/min per evitare l'interferenza di ⁴⁰Ar¹⁶O sulla determinazione di ⁵⁶Fe.
5. Preparare la curva di calibrazione per gli elementi scelti.
6. Eseguire gli esempi.

L'analisi ICP-MS di campioni contenenti nanoparticelle di ossido di ferro è mostrata di seguito. Una curva standard è stata effettuata utilizzando la concentrazione nota di ⁵⁶Fe (Figura 1). Il coefficiente di correlazione vicino a 1 (R² = 0,999989) ha mostrato la buona relazione lineare tra le concentrazioni del campione e l'intensità misurata dal rivelatore. I campioni di interessi hanno mostrato valori all'interno dell'intervallo di calibrazione (Figura 2). Le concentrazioni calcolate dal software sono state poi regolate in base alla diluizione effettuata durante il protocollo. Il presente protocollo descriveva una diluizione di 1/50 a seguito della diluizione in acido (1/10) e in acqua Mili-Q (1/5). Ad esempio, è stata misurata una concentrazione di 51,427 μg/L per il numero di campione 51 (Figura 2). La concentrazione del campione originale era 50 volte superiore corrispondente a 2,57 mg/L.

Figura 1. Curva di calibrazione per ⁵⁶misurazioni Fe. Quattro punti standard (0,01, 0,1, 1 e 10 μg/mL) mostrano un coefficiente di correlazione (R²) di 0,999989. Ciò conferma la buona relazione lineare tra l'intensità del segnale rilevata e le concentrazioni di riferimento.

Figura 2. Risultati rappresentativi a seguito di misurazioni ICP-MS su campioni di nanoparticelle di ossido di ferro. La concentrazione di ciascun campione diluito viene calcolata automaticamente in base alla curva di calibrazione definita.

I campi ambientali e geologici rappresentano il primo utilizzo per ICP-MS ad esempio per misurare i contaminanti presenti nell'acqua, nel suolo o nell'atmosfera. La presenza di contaminanti ad alta concentrazione nell'acqua del rubinetto come Fe, Cu o Al può essere monitorata utilizzando ICP-MS.

Anche i campi delle scienze mediche e forensi utilizzano il rilevamento ICP-MS. In caso di sospetto di avvelenamento da metalli come l'arsenico, campioni come sangue e urina possono essere analizzati utilizzando ICP-MS. Questa tecnica può anche fornire preziose informazioni in caso di patologia che coinvolge preoccupazioni metaboliche o problemi epatologici con conseguente scarsa escrezione di alcuni elementi.

ICP-MS consente la quantificazione dei metalli in qualsiasi materiale. Nella Figura 3,la concentrazione di Fe è stata misurata in nanoparticelle e correlata alle loro proprietà di risonanza magnetica (MRI). ICP-MS fornisce una quantificazione affidabile di Fe di diverse nanoparticelle per discriminare quali nanoparticelle sono le più efficienti per l'applicazione di imaging.

Un'altra applicazione è quella di studiare la biodistribuzione delle nanoparticelle associate ai metalli. La Figura 4 presenta la biodistribuzione d'organo di nanoparticelle contenenti ossido di ferro nei topi dopo iniezione endovenosa. A 24 ore, ogni organo è stato raccolto e digerito in acido nitrico concentrato fino a raggiungere la digestione completa degli organi. La concentrazione di ⁵⁶Fe è stata quantificata da ICP-MS. I risultati mostrano una maggiore concentrazione di ⁵⁶Fe nel fegato e nella milza per i topi iniettati con nanoparticelle rispetto agli organi di animali naïve. Pertanto, si è concluso che le nanoparticelle si accumulano principalmente negli organi epatici e della milza.

Figura 3. Misurazione della risonanza magnetica (MRI) della funzione delle nanoparticelle della loro concentrazione di Fe. Sono state utilizzate cinque concentrazioni di ferro (0,25, 0,5, 0,75, 1 e 1,25 mM) che sono state utilizzate per le loro proprietà MRI (tasso di rilassamento, R₂*).

Figura 4. Biodistribuzione di nanoparticelle di ossido di ferro a seguito di iniezione endovenosa nei topi. Campioni naïve mostrano il livello basale dell'organo di ferro nei topi non trattati. Dopo l'iniezione di nanoparticelle contenenti ossido di ferro, aumenta la quantità di ferro in alcuni organi che è associata all'accumulo di nanoparticelle.