Name: preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dall'Ernst und Berta Grimmke Stiftung e il Deutsche del Ophthalmologische Gesellschaft (cane).

Le procedure sperimentali di questo studio sono state approvate da animale cura Comitato della Renania-Palatinato, Germania. Cura degli animali e conforme alle linee guida istituzionali e l'associazione ricerca in visione e Oftalmologia (ARVO) istruzione per l'uso di animali in oftalmica o visione. Gli animali sono stati trattati secondo la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschii (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, Stati Uniti d'America) di età compresa tra 3-4 mesi. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard (temperatura 23 ± 2 ° C, umidità gamma 55 ± 10% e 12 h cicli di luce/buio) e ha avuto accesso al mouse standard chow e acqua ad libitum.
1. isolamento di Retina di topo
<ol><li>Collocare gli strumenti di dissezione sul piano di preparazione e verifica se tutti gli strumenti sono completi per consentire una rapida preparazione.</li>
	<li>Sacrificare il mouse da inalazione di CO2 .</li>
	<li>Decapitare il mouse con le forbici in acciaio, tagliate il sagitally del cranio in due metà usando lo stesso paio di forbici e rimuovere la pelle e il cervello con le forbici dell'occhio (Figura 1).</li>
	<li>Tagliare l'osso del cranio di lasciare solo l'osso orbitale utilizzando forbici occhio.</li>
	<li>Trasferire l'orbita in un piatto di dissezione contenente tampone Krebs-Henseleit ghiacciata.</li>
	<li>Mantenere il piatto di dissezione su ghiaccio o modificare il buffer ogni 10 min.</li>
	<li>Tagliare l'osso orbitale usando le forbici occhio e rimuovere delicatamente il globo oculare insieme il tessuto orbitale usando tipo 4 precisione pinzette e forbici di primavera studente Allerød (Figura 2).</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la ghiandola di Harder, tessuto connettivo e muscoli extraocular utilizzando pinzette di precisione 5 tipo e Allerød capsulotomy forbici, facendo attenzione a non per danneggiare il ramo principale dell'arteria oftalmica.</li>
	<li>Lega i orbitale rami dell'arteria oftalmica e, infine, l'estremità prossimale del ramo principale dell'arteria oftalmica usando i suturare di Nylon 10-0 (Figura 3).</li>
	<li>Trasferire il globo oculare in una capsula di Petri contenente etanolo al 70% per 10 s con tipo 4 pinzette di precisione. Inserire nuovamente il globo oculare il piatto di dissezione e sostituire il buffer con soluzione di Krebs fresca. La cornea appare biancastra dopo esposizione all'etanolo.</li>
	<li>La cornea periferica di puntura con un ago da 30 gauge e sezionare la cornea utilizzando forbici capsulotomy Allerød. Delicatamente tagliare il tessuto dell'iride, posizionare un punto tagliente delle forbici capsulotomy Allerød tra la coroide e della retina e tagliare la coroide e sclera. Lasciare qualche tessuto sclerale intorno al nervo ottico (Figura 4).</li>
</ol>2. montaggio della Retina nella camera di perfusione
Nota: La camera di aspersione utilizzata per esperimenti di arteriola retinica è fatta in casa. Si compone di un serbatoio trasparente con un tubo di ingresso e di uscita (Figura 5). Un'estremità di un tubo di silicone è incollata alla parte inferiore dell'alloggiamento con histoacryl adesivo e l'altra estremità collegata ad un rubinetto a tre vie. Collegare una siringa contenente tampone di Krebs fresca al rubinetto a tre vie e riempire il tubo con il tampone.
<ol><li>Prendere una micropipetta di vetro con un porta-aghi e spingere l'estremità del tubo nella parte inferiore della camera di aspersione. Poi rompere la punta della micropipetta con forbici tipo 4 per ottenere una punta di 100 µm di diametro.</li>
	<li>Concentrarsi sulla punta della micropipetta e buttare via la siringa collegata al tubo. Fare attenzione che il capillare non è occluso da detriti. In caso di occlusione, rimuoverlo, svuotare il tubo e inserire un'altra micropipetta.</li>
	<li>Riempire la camera di aspersione con tampone Krebs refrigerato e mettere la vaschetta sotto un microscopio stereo.</li>
	<li>Posto una piattaforma di plastica trasparente nella camera di aspersione. Questa piattaforma ha un rientro di 1,8 mm di larghezza per il nervo ottico e l'arteria oftalmica e posti su due fili di acciaio di diametro 1,6 mm. Quindi, inserire un anello di acciaio di diametro interno 2,8 mm e 4,0 mm di diametro esterno sulla piattaforma.</li>
	<li>Trasferire la retina con il nervo ottico e dell'arteria oftalmica allegata dalla camera di dissezione nella camera di aspersione con estrema cura, utilizzando un cucchiaio. Questo passaggio è importante per prevenire potenziali stiramento dei tessuti in quanto può essere dannoso per l'esperimento.</li>
	<li>Tagliare la parte suturata dell'estremità prossimale dell'arteria oftalmica, posizionare due anelli preformati di sutura in nylon 10-0 sulla micropipetta e incannulare l'arteria oftalmica con la micropipetta. Legare l'arteria per la micropipetta (Figura 6) e posizionare la retina sulla piattaforma trasparente con belle-punto-pinzette.</li>
	<li>Delicatamente strappare aperto il capsula lenticolare anteriore con due pinzette a punta fine, tirare fuori la lente e tagliare il capsula intera lente utilizzando microforbici.</li>
	<li>Successivamente, fare quattro incisioni radiali nella retina metà della distanza dalla pars plana al nervo ottico e posizionare un anello di acciaio sulla retina per risolvere il problema di fondo. La retina è ora pronta per l'esperimento (Figura 7).</li>
</ol>3. preparazione delle arteriole retiniche per l'esperimento
<ol><li>Posizionare la camera di aspersione sotto un microscopio chiaro. L'obiettivo è una lente di obiettivo di immersione in acqua X 100.</li>
	<li>Collegare i due tubi per in - e out - flow a una pompa periciclica e circolare della camera con tampone Krebs ossigenata con 95% O2 e gassata con 5% CO2 a 37 ° C. Utilizzare una velocità di flusso tra 100 e 120 mL/min.</li>
	<li>Collegare il tubo di silicone, che è collegato alla micropipetta, di un serbatoio in silicone tubo tramite un rubinetto a tre vie. Poi, riempire il serbatoio con buffer di Krebs per un'altezza corrispondente a 50 mm Hg, ma non ancora aprire il rubinetto a tre vie.</li>
	<li>Guardare attraverso gli obiettivi del microscopio e concentrarsi sulla superficie della retina. Ricerca di vasi sanguigni o globuli rossi. È possibile che i vasi sanguigni sono completamente crollati, a volte solo che alcuni globuli rossi sono visibili.</li>
	<li>Quando viene trovato un vaso sanguigno, concentrarsi su di esso e aprire il rubinetto a tre vie. Il diametro del vaso dovrebbe aumentare immediatamente e i globuli rossi si sposteranno mediante centrifugazione, se si tratta di un'arteriola, o centripeto in caso di una venula. Le arteriole sono più piccole di diametro rispetto alle venule dello stesso ordine.</li>
	<li>Una volta trovato un vaso sanguigno con una parete ben visibile, può essere impiegato per esperimenti dopo un periodo di equilibrazione di 30 min (Figura 8). Durante il periodo di equilibrazione, le arteriole sviluppano solo debole tono intrinseco con conseguente meno il 10% di riduzione di diametro luminal.</li>
</ol>4. esecuzione dell'esperimento
<ol><li>Testare la redditività delle navi con il trombossano mimetico 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy della prostaglandina F2α (U46619) aggiungendo la soluzione del bagno. Questo agente constricts arteriole retiniche del mouse circa il 50% dal diametro di riposo alle concentrazioni di ≥ 10-6 M.</li>
	<li>Una volta che la nave è confermata praticabile, lavare l'agonista dal bagno, la pompa di circolazione e fornire fresco Krebs buffer nel bagno.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

La misurazione delle risposte vascolari nella retina di topo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici. Con la tecnica presentata, arteriole retiniche sono visualizzate da microscopia chiara trasmessa. Questo è possibile, perché la retina isolata è traslucida. Il vantaggio della tecnica è l'alta risoluzione ottica. La risoluzione spaziale calcolata è 11 px/µm. Tuttavia, la risoluzione reale per questo sistema ottico che utilizza la luce bianca è fra 200 e 300 nm, che si spiega con il limite di diffrazione di Abbe. Poiché il primo ramo delle arteriole retiniche del mouse ha un diametro interno di 20-30 µm, cambiamenti di diametro di circa l'1% sono rilevabili con questo sistema. Non c'è nessuna necessità di ulteriori dispositivi tecnici o tinture fluorescenti come riportato in altri studi di visualizzare piccole arteriole retiniche5,6,7. Uno svantaggio della tecnica è il tempo di lunga preparazione, che è compresa tra 90-120 min dagli investigatori addestrati. Se il tempo di preparazione supera 180 min, la funzione endoteliale inizia a essere attenuato.
Ci sono diversi passaggi critici principali in questa tecnica. In primo luogo, è importante legare accuratamente tutti i rami arteriosi retrobulbar. Se la legatura è incompleta, arteriole retiniche non verranno pressurizzati a causa di perdite. In secondo luogo, l'immersione in etanolo per 10 s prima di aprire il globo oculare è importante disattivare la reattività del muscolo liscio dell'arteria oftalmica. Abbiamo precedentemente dimostrato che immergendo per 10 s in etanolo al 70% disattiva completamente la muscolatura liscia dell'arteria oftalmica8. Al contrario, arteriole retiniche rischiano di essere direttamente colpiti da etanolo, poiché sono protetti da parete bulbare. Se viene omesso questo passaggio, cambiamenti di diametro nell'arteria oftalmica possono influenzare la perfusione della retina. Della nota, la reattività dell'arteria oftalmica contrassegnato potrebbe differire da quello delle arteriole retiniche in risposta alla stessa agonista9,10. In terzo luogo, evitare la torsione dell'arteria oftalmica. Soprattutto durante la preparazione della retina sulla piattaforma di montaggio, l'arteria oftalmica può diventare contorta, con conseguente occlusione del lume. Inoltre, controllare con attenzione che la punta del capillare di vetro non è occlusa per abilitare la pressurizzazione delle arteriole retiniche. Suggeriamo per non eseguire più di tre curve di concentrazione-risposta consecutivi nella stessa preparazione retinica, perché abbiamo osservato che le risposte alla acetilcolina è diventato più debole quando si ripete le curve concentrazione-risposta per più di tre volte. Tuttavia, ci possono essere differenze per quanto riguarda la ripetibilità delle curve concentrazione-risposta a seconda dell'agente applicato e, quindi, devono essere testate individualmente.
Abbiamo applicato extraluminally agenti farmacologici nei nostri studi, anche perfusione intraluminal utilizzando una pompa di controllo servo è possibile. Poiché la tecnica permette di misurare per meccanismi locali della reattività vascolare della retina di piccoli animali da laboratorio tra cui topi e ratti, i vantaggi della tecnologia di gene-targeting utilizzando animali geneticamente modificati è possibile accedere con questo metodo. .

Disturbi della perfusione retinica sono stati implicati nella patogenesi di varie malattie oculari, quali la retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva e glaucoma1,2,3. Così, gli studi volti a misurare la reattività vascolare della retina sono importanti per comprendere la fisiopatologia di queste malattie e per sviluppare il nuovo trattamento si avvicina.
Grazie alla possibilità di manipolazione del gene nel genoma murino, il mouse è diventato un modello animale ampiamente usato per gli studi del sistema cardiovascolare4. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici (≤ 30 µm), misura della reattività vascolare nella retina di topo è complessa. Ad esempio, stereomicroscopia tecniche per la misurazione in vivo sono limitati nella loro risoluzione ottica e quindi solo consentono di rilevare esattamente i cambiamenti nel flusso di diametro o di sangue nel sangue piccolo inferiore a ≤ 30 µm di diametro quando equipaggiato con sofisticati dispositivi aggiuntivi, come un microscopio confocale utilizzando coloranti fluorescenti o l'ottica adattiva che scansione oftalmoscopio luce5,6. Inoltre, l'interpretazione di in vivo misure volte ad individuare locali segnalazione meccanismi in vasi sanguigni retinici possono essere confuse di anestetici, cambiamenti nella pressione arteriosa sistemica e l'influenza dei vasi sanguigni retrobulbar.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le risposte dei vasi sanguigni retinici del mouse con alta risoluzione ottica ex vivo. La tecnica qui presentata permette la visualizzazione delle arteriole retiniche tramite trasmissione microscopia chiara. Questo metodo, che può essere utilizzato anche in ratti, fornisce l'accesso ai vantaggi del gene targeting tecnologia nella ricerca vascolare oculare.

<table><tbody><tr><td>Steel Scissors</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3576.1</td><td>1x 140 mm</td></tr><tr><td>Eye Scissors</td><td>Geuder</td><td>G-19390</td><td>1x straight, 10.5 cm</td></tr><tr><td>Precision tweezers, straight with fine tips</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH68.1</td><td>2x type 4</td></tr><tr><td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>LH53.1</td><td>2x type 5</td></tr><tr><td>Vannas capsulotomy scissors</td><td>Geuder</td><td>19760</td><td>1x straight, 77 mm</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>1x curved,</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Barraquer&lt;/em&gt; Needle Holder</td><td>Geuder</td><td>G-17500</td><td>1x curved, 120 mm</td></tr><tr><td>Needle</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305128</td><td>1x 30 G</td></tr><tr><td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-1211</td><td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td></tr><tr><td>Nylon Suture</td><td>Alcon</td><td>198001</td><td>1x 10-0</td></tr><tr><td>Nunclon cell culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>1x 35 mm diameter</td></tr><tr><td>Nunclon cell culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172931</td><td>1x 100 mm diameter</td></tr><tr><td>Discofix C</td><td>Braun</td><td>16500C</td><td>10 cm</td></tr><tr><td>Histoacryl adhesive</td><td>B. Braun Surgical, S.A.</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pericyclic pump&amp;nbsp; (CYCLO II)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>EP76.1</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td><td>Olympus</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Digital camera (TK-C1381)</td><td>JVC</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>self-made</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs and Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K928.4</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Kalium chloride (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Kalium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulphate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>261.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0965.3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>9,11-dideoxy-9&amp;alpha;,11&amp;alpha;-methanoepoxy prostaglandin F2&amp;alpha; (U-46619)</td><td>Cayman Chemical</td><td>16450</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Insufficienza vascolare e alterazioni nel normale perfusione retinica sono tra i fattori più importanti per la patogenesi di varie malattie oculari avvistare-minaccioso, quali retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva ed eventualmente il glaucoma. Di conseguenza, retiniche microvascolari preparazioni sono strumenti cardine per studi fisiologici e farmacologici delineare i meccanismi fisiopatologici sottostanti e di progettazione terapie per le malattie. Nonostante l'ampio uso di modelli murini in Ricerca oftalmica, gli studi sulla reattività vascolare retinica sono scarsi in questa specie. Delle ragioni principali per questa discrepanza è le procedure di isolamento impegnativo a causa le piccole dimensioni di questi vasi sanguigni della retina, che è ~ ≤ 30 µm di diametro luminal. Per aggirare il problema di isolamento diretto di questi microvasi retinici per studi funzionali, abbiamo stabilito una tecnica di isolamento e la preparazione che permette studi ex vivo di vasoattività retinica del mouse in condizioni di quasi-fisiologiche . Anche se i preparati sperimentali presenti in particolare farà riferimento alle arteriole retiniche del mouse, questa metodologia prontamente può essere impiegata per microvasi dai ratti.

U-46619 prodotto risposte vasocostrittori di concentrazione-dipendente in arteriole retiniche da topi wild-type dello sfondo C57Bl/6J. Ad una concentrazione di 10-6 M, riduzione del diametro luminal era ≈50% dal diametro di riposo. Figura 9A Mostra una curva di concentrazione-risposta rappresentativo di un'arteriola retinica. In arteriole preconstricted con U46619, amministrazione cumulativo di acetilcolina evocato aumenti di concentrazione-dipendente di diametro luminal ≈ 25% da a 10-5 M, indicativo di un endotelio vascolare intatto (il diametro di preconstricted Figura 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig1.jpg"> Figura 1: dissezione del cranio mouse. Pelle sulla testa decapitata del mouse viene rimosso per esporre gli occhi e la cavità orbitale. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig2.jpg"> Figura 2: isolamento del tessuto orbitale e globo dell'occhio. L'osso orbitale è stato tagliato con le forbici dell'occhio ed il globo oculare insieme i tessuti retrobulbar e del nervo ottico sono stati accuratamente isolati. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig3.jpg"> Figura 3: il globo oculare e la preparazione dell'arteria oftalmica. Una volta che i tessuti circostanti orbitali sono stati sezionati con microforbici bene, l'arteria oftalmica è stata accuratamente esposti e loro piccoli rami legati con le suture monofilamento di nylon 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig4.jpg"> Figura 4: dissezione delle strutture oculari. Per visualizzare la retina, la sclera e la coroide sono stati sezionati con le forbici di capsulotomia Allerød. Alcuni tessuto sclerale intorno al nervo ottico è stato lasciato per evitare danni dell'arteria oftalmica. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig5.jpg"> Figura 5: camera di organo per Real-Time video microscopia. La camera era fatto in casa. Ha consistito di una capsula di Petri del diametro di 100 mm con un tubo in e out flow. I tubi sono stati incollati con adesivo di histoacryl. Buffer di Krebs-Henseleit esternamente ossigenato e gassate è stato distribuito da una pompa peristaltica tramite questi tubi. Un'estremità di un tubo di silicone è stata incollata sul fondo della camera di scoppio e l'altra estremità collegata ad un rubinetto a tre vie. All'estremità del tubo, è stata inserita una micropipetta di vetro con una punta di 100 µm, che hanno servito per l'incannulamento dell'arteria oftalmica. Tramite il tubo di silicone, la circolazione oftalmica è stata pressurizzata da un tubo in silicone di riempimento con buffer di Krebs a un livello corrispondente a 50 mm Hg. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig6.jpg"> Figura 6: inserimento di una canula dell'arteria oftalmica. Arteria oftalmica era cannulato con micropipetta di vetro e suturato con una sutura in nylon 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig7.jpg"> Figura 7: inserimento di una canula dell'arteria oftalmica. Dopo aver posizionato la retina sulla piattaforma trasparente, la lente con il sacchetto capsulare è stato rimosso, quattro incisioni radiali sono state fatte nella retina e un acciaio inossidabile dell'anello di 2,8 mm di diametro interno e diametro esterno mm 4,0 è stato disposto sulla retina per fissarlo al b Ottom. La retina era quindi pronta per l'esperimento. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig8.jpg"> Figura 8: visualizzazione dei vasi sanguigni retinici. Un'esemplare arteriola retinica con globuli rossi all'interno.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig9.jpg"> Figura 9: studi funzionali mediante videomicroscopia. Curve di risposta di concentrazione rappresentativo da un singolo arteriola retinica. (A) curva di concentrazione-risposta per il vasocostrittore, U46619 (10-9 al 10-6 M) e (B) per il vasodilatatore dipendente dall'endotelio, acetilcolina (10-8 a 10-5 M). <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56199/56199fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

7.1K Views.  University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz. Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.

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Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ricerca

Neuroscienze

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilizzando virus adeno-associati come strumento per studiare le barriere della retina nella malattia

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Medicina

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Quantification of Vascular Parameters in Whole Mount Retinas of Mice with Non-Proliferative and Proliferative Retinopathies

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, gliosis&#160;and a progressive change in vascular function and structure. Although the onset of the retinopathies is characterized by subtle disturbances in visual perception, the modifications in the vascular plexus are the first signs detected by clinicians. The absence or presence of neovascularization determines whether the retinopathy is classified as either non-proliferative (NPDR) or proliferative (PDR). In this sense, several animal models tried to mimic specific vascular features of each stage to determine the underlying mechanisms involved in endothelium alterations, neuronal death and other events taking place in the retina. In this article, we will provide a complete description of the procedures required for the measurement of retinal vascular parameters in adults and early birth mice at postnatal day (P)17. We will detail the protocols to carry out retinal vascular staining with Isolectin GSA-IB4 in whole mounts for later microscopic visualization. Key steps for image processing with Image J Fiji software are also provided, therefore, the readers will be able to measure vessel density, diameter and tortuosity, vascular branching, as well as avascular and neovascular areas. These tools are highly helpful to evaluate and quantify vascular alterations in both non-proliferative and proliferative retinopathies.

This article describes a well-established and reproducible lectin stain assay for the whole mount retinal preparations and the protocols required for the quantitative measurement of vascular parameters frequently altered in proliferative and non-proliferative retinopathies.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Retinopathies are a heterogeneous group of diseases that affect the neurosensory tissue of the eye. They are characterized by neurodegeneration, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Measuring Retinal Vessel Diameter from Mouse Fluorescent Angiography Images

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. Mutations in the microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene show hypopigmentation, microphthalmia, retinal degeneration, and in some cases, blindness. In vivo imaging of the mouse retina by noninvasive means is vital for eye research. However, given its small size, mouse fundus imaging is difficult and might require specialized tools, maintenance, and training. In this study, we have developed a unique software enabling analysis of the retinal vessel diameter in mice with an automated program written in MATLAB. Fundus photographs were obtained with a commercial fundus camera system following an intraperitoneal injection of a fluorescein salt solution. Images were altered to enhance contrast, and the MATLAB program permitted extracting the mean vascular diameter automatically at a predefined distance from the optic disk. The vascular changes were examined in wild-type mice and mice with various mutations in the Mitf gene by analyzing the retinal vessel diameter. The custom-written MATLAB program developed here is practical, easy to use, and allows researchers to analyze the mean diameter and mean total diameter, as well as the number of vessels from the mouse retinal vasculature, conveniently and reliably.

Mouse retinal vasculature is particularly interesting in understanding the mechanisms of vascular pattern formation. This protocol automatically measures the diameter of mouse retinal vessels from fluorescent angiography fundus images at a fixed distance from the optic disk.

Misurazione del diametro dei vasi retinici da immagini di angiografia fluorescente di topo

It is important to study the development of retinal vasculature in retinopathies in which abnormal vessel growth can ultimately lead to vision loss. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biologia

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...