Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l'Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l'utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. e C.H.B. sono grato per il sostegno del Warren Y. Soper Charitable Trust e la Fondazione di famiglia di Alvin Segal per l'ospedale generale ebreo (Montreal, Quebec, Canada).

gli importi dei reagenti descritti di seguito si basano sulla misurazione di 20 campioni di plasma paziente. Il protocollo presentato di seguito segue le linee guida dell'Università di Victoria &#39; Comitato etico ricerca umana di s.
 1. generazione di Ang I nel Plasma umano <ol><li>scongelare i campioni di plasma (&#8805; 200 µ l) in una stanza temperatura dell'acqua del bagno per 5 min e poi mettere i campioni su ghiaccio fino a quando completamente sciolto.</li>
	<li>Trasferire 200 µ l di ogni campione di plasma manualmente per separare pozzetti di una piastra di profondo-pozzo (piatto del campione), di 1,1 mL e centrifugare la piastra in una centrifuga per 10 min a 2 ° C e 1278 x g.</li>
	<li>Utilizzare un liquido automatizzato sistema di movimentazione in serie diluire una soluzione standard di 500 fmol / µ l Ang I NAT per preparare sei calibratore soluzioni con l'albumina del bianco d'uovo di pollo (0,1, 0,2, 0,6, 1,9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).</li>
	<li>Pipetta 200 µ l di ciascun calibratore a un bene e 125 µ l di generazione buffer per piastra campione. 
	Nota: Il CIPRACCA in fosfato tampone soluzione salina tamponata (PBS) deve essere preparata il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Usa un liquido automatizzato sistema di movimentazione, in una nuova piastra mescolare 125 µ l di plasma surnatante o 125 µ l di CIPRACCA in PBS con 25 µ l di Ang I buffer di generazione, che contiene 1 M Tris, acido etilendiamminotetracetico 0,2 mM (ed) e 1 mM fluoruro di phenylmethylsulfonyl (PMSF). 
	Nota: Preparare il Ang I buffer di generazione mescolando un tampone acquoso 1m Tris/0,2 mM EDTA (regolare a pH 5.5 utilizzando acido acetico) e una soluzione PMSF (100 mM in metanolo). Entrambe le soluzioni possono essere conservate fino a 1 mese a soluzioni di mescolare i due 4 ° C. il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra a 96 pozzetti, 3 ripetizioni per soluzione, 34 µ l per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h.</li>
</ol> 2. Immuno-arricchimento di Ang ho perline rivestite con anticorpo usando <ol><li>coniugazione dell'anticorpo su biglie magnetiche di proteina G Nota: coniugazione dell'anticorpo con le perline viene eseguita manualmente durante i 3 h Ang I periodo di generazione sul giorno dell'esperimento. Per altri analiti, i branelli coniugati potrebbero essere in grado di essere memorizzati nel buffer di PBS contenente 0.015% CHAPS (PBSC) a 4 ° C per tre mesi o più, a seconda della proprietà e la stabilità dell'anticorpo.
	<ol><li>Trasferimento 110 µ l di liquami perlina (sufficiente per 20 campioni di misura e facendo una curva standard di 6 punti) in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle sette volte con 1 mL di acetonitrile/PBSC 25% e tre volte con 1 mL di PBSC. Utilizzare un supporto magnetico per appallottolare le perline tra ogni fase di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio dopo l'ultimo nello stato di Washington 
		Nota: Lavaggio 7 volte con 25% acetonitrile/PBSC è critico per la rimozione degli additivi di MS-incompatibile nel liquame tallone, come Tween-20. Se non esistono nessun tali additivi nelle perle selezionate, questa fase di lavaggio estesa potrebbe non essere necessaria.</li>
		<li>Risospendere le sfere in 110 µ l di PBSC e 110 µ l di anti-Ang ho anticorpo (concentrazione finale: 100 µ g/mL). Miscelare la soluzione e perline pipettando e poi li Incubare a temperatura ambiente per 1 h, rotante a 8 giri/min.</li>
		<li>Lavare le perle 3 volte con 1 mL di PBSC e risospendere in 1100 µ l di PBSC. 
		Nota: Se qualsiasi soluzione perlina ha fluito nel tappo del tubo durante l'incubazione, girare giù la soluzione utilizzando una centrifuga da banco a 2680 x g.</li>
		<li>Trasferire la soluzione perlina manualmente in una piastra a 96 pozzetti (piastra standard con nervature). Utilizzare il liquido automatizzato sistema ad aliquota di movimentazione le perline per la stessa piastra a 96 pozzetti, 120 µ l per pozzetto.</li></ol></li> <li>Immuno-arricchimento sui branelli <ol><li>dopo la h 3 Ang periodo di generazione, metto la piastra di incubazione su ghiaccio per 10 min terminare la generazione di I. Ang</li>
		<li>Automaticamente diluire la soluzione di riserva del peptide SIS (10 pmol/μL) 100 volte con PBS buffer e in seguito automaticamente aliquota alla diluizione standard peptide yannick2k stabile una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 1,5 µ l di una soluzione di peptide standard (SIS) di isotopo stabile (contenente 100 fmol) in ciascun pozzetto della piastra incubazione e mescolare con i campioni di plasma o CIPRACCA nei buffer di PBS.</li>
		<li>Automaticamente trasferire il contenuto della piastra incubazione alla soluzione perlina, 10ml per bene, mescolare.</li>
		<li>Incubare la piastra a 4 ° C per 1 h durante la rotazione a 8 giri/min.</li>
		<li>Lavare le perle tre volte automaticamente con soluzione di bicarbonato di ammonio (AmBic) 5 mM, 100 µ l per pozzetto a lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 7 µ l di 5mm AmBic soluzione in ciascun pozzetto. Utilizzare un magnete per tirare i talloni verso il basso dopo l'ultimo nello stato di Washington</li>
	</ol></li></ol> 3. Trasferimento di perline su una piastra MALDI e aggiunta di soluzione di Matrix <ol><li>Transfer 7 µ l del liquame perlina automaticamente su un piatto di destinazione MALDI con un formato di punto di 2.600 µm. Lasciate asciugare i branelli. 
	Nota: Un piccolo ventilatore alimentato USB può essere utilizzato per accelerare il tallone processo di secchezza.</li>
	<li>Automaticamente aggiungere 2 µ l di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (HCCA)-soluzione a matrice (che contiene 3 mg/mL HCCA, citrato di ammonio di 1,8 mg/mL, acetonitrile 70% e 0,1% di acido trifluoroacetico) dalla matrice bene su ogni campione posto sulla piastra di destinazione .</li>
</ol> 4. Acquisizione di un MALDI-TOF-MS e analisi dei dati del segnale <ol><li>analizza il campione macchie con uno strumento di MALDI-TOF utilizzando la modalità di reflector positivo. Eseguire la calibrazione interna, dati levigante e sottrazione della linea di base automaticamente con software specifici del fornitore. 
	Nota: La modalità (positivo/negativo, lineare/riflettore) selezionata per misurazione di MALDI-TOF dipende la destinazione peptidi o proteine.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di risposta relativa (rapporto di intensità di Nat/SIS) e confrontarlo con la curva standard per determinare del Ang ho concentrazione in ciascun campione. Calcolare PRA tramite l'equazione (1), dove Δt Ang ho generazione rappresenta il tempo utilizzato per la generazione di I. Ang 
	PRA = [Ang ho] / Δt Ang ho generazione (1)</li></ol>

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients.">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li><li>Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).</li><li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI/TOF-TOF.">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li><li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome.">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li><li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis.">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation.">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate.">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics.">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies.">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li><li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow.">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li><li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast,+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry.">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li><li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device.">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li><li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective.">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li><li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+(iMALDI)+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension.">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li><li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II.">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li><li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+(iMALDI)+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension.">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+(iMALDI)+assay+for+EGFR+diagnosis.">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li><li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+(iMALDI)+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis.">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li><li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+(iMALDI).">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li><li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry.">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> US patent. , (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> Canadian patent CA. , (2011).</li><li>Wei&#223;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research.">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li><li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+fragments:+Hope+and+hype.">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS:+PCSK9+as+an+example+protein.">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li></ol>

C.H.B detiene il brevetto sulla tecnologia iMALDI.

Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l'immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell'anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe...

Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in campioni complessi alle concentrazioni ng/mL o pg/mL in presenza di alta-abbondanza di proteine, e molti candidati proteine biomarcatori trovati nel plasma umano sono all'interno di questa gamma5. Questo problema è causato in gran parte dall'intrinsecamente ampio range dinamico e dalla complessità del proteoma umano6.
Per superare queste difficoltà di rilevazione, sono stati sviluppati metodi immuno-MS per arricchire il bersaglio proteine o peptidi da soluzioni campione su una superficie solida, seguita da eluizione degli analiti e MS misura7,8 , 9 , 10. con immuno-arricchimento, gli analiti sono purificati da campioni complessi e pertanto sono ridotti al minimo gli effetti di ioni-soppressione da altre molecole. Tra i vari supporti solidi, biglie magnetiche attualmente sono più ampiamente usati come hanno i vantaggi della capacità di legame dell'anticorpo alta e maneggevolezza. Biglie magnetiche con diverse funzionalizzazioni e dimensioni sono stati sviluppati e commercializzati per esperimenti di immunoprecipitazione. Fin qui, immuno-arricchimento su perline è stato interfacciato con MALDI-MS e ionizzazione electrospray (ESI) per la misurazione della proteina e del peptide. Isotopo stabile standard e la cattura di tecnologia di anticorpi anti-peptide (SISCAPA), proteine nei campioni sono digeriti, seguita da incubazione con anticorpo-rivestite di perline per immuno-arricchimento. In SISCAPA "classica", i peptidi proteotypic catturati sono eluiti dalle perline e misurati da liquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), o infusione diretta ESI multiplo reazione monitoraggio-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-arricchimento migliorata la sensibilità del dosaggio MRM di 3-4 ordini di grandezza, raggiungendo la fascia bassa ng/mL13.
Rispetto a MS di electrospray, MALDI-MS è più veloce e non comporta la pulizia e il riequilibrio delle colonne LC così non ci sono problemi riporto e contaminazione, rendendolo più adatto per studi di alto-rendimento14. Immuno-MALDI tecnologia è stata sviluppata nel nostro laboratorio di combinare immuno-arricchimento con MALDI-MS per quantificazione sensibile e specifica di peptidi e proteine (basate sulla quantificazione dei peptidi proteotypic)15,16 ,17. Dopo immuno-arricchimento, le perle sono depositate su un piatto di destinazione MALDI, la soluzione di matrice viene aggiunta di perline e il piatto è pronto per l'analisi di un MALDI-TOF-MS dopo l'essiccazione. Eluizione dei peptidi dalle perline non viene eseguita come un passaggio separato, ma associato a affinità analiti sono eluiti dalla soluzione MALDI matrice quando viene aggiunto ai punti tallone, quindi semplificare la preparazione del campione e minimizzazione della perdita di campione. La tecnologia iMALDI è stata applicata in una varietà di applicazioni18,19e recentemente è stata automatizzata e utilizzata per la misurazione dell'angiotensina I (Ang ho) per la determinazione della renina del plasma attività (PRA)20. Questo protocollo sarà dimostrare la procedura utilizzata per eseguire un test automatizzato iMALDI. Prendendo il test PRA come esempio, Inter-giorno CVs di meno del 10% sono stati raggiunti grazie all'automazione, con la capacità di misurare 744 campioni al giorno20.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo manoscritto non richiede la digestione di proteine, come la molecola bersaglio (Ang ho) è un peptide con un peso molecolare di 1295.7 Da. In altri saggi cui digestione delle proteine è necessaria e un peptide è utilizzato come surrogato per la proteina intatta, il peptide selezionato per iMALDI deve essere univoco e specifico per la proteina dell'obiettivo, con una massa oltre 800 Da così che esso può essere facilmente distinto dal c hemical rumore dalla soluzione matrice MALDI. Gli anticorpi anti-peptide sono necessari per l'immuno-arricchimento dei peptidi. Il protocollo per un dosaggio di iMALDI PRA di misura è costituito da quattro fasi: 1) generazione di Ang I nel plasma umano; 2) immuno-arricchimento di Ang che usando le perle di anticorpo-rivestite; 3) trasferimento di perline a una piastra MALDI e aggiungendo soluzione matrix; e 4) acquisizione del segnale con una di analisi dati e MALDI-TOF-MS20.

<table><tbody><tr><td>Healthy control human plasma</td><td>Bioreclamation</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (&gt;=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from chicken egg white (&gt;98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>water</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G magnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;&amp;mu;m, 30 mg/mL&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>anti-Ang I goat polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat and SIS Ang I</td><td>synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid handling system</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotic workstation</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 magnet</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 side skirted magnet</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>used to pull the beads to the bottom of the well</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF instrument</td></tr></tbody></table>

peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)

Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l'intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l'analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno - Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l'analisi di iMALDI è usata per determinare l'angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).

Una procedura automatizzata iMALDI per la misurazione Ang mi è mostrato nella Figura 1. Peptidi di destinazione (peptidi endogeni o peptidi da proteine digerite) sono arricchite il anti-peptide biglie magnetiche, e quindi le perle vengono trasferite ad una piastra di destinazione per la misura di MALDI. L'intera procedura è semplificata rispetto ad altre tecnologie di immuno-MS che richiedono ulteriori peptide eluizione passaggi. Automazione del dosaggio iM...

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Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

7.9K Views.  University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre. Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Ricerca

Chimica

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Bioingegneria

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI Imaging Mass Spectrometry dei neuropeptidi nella malattia di Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Medicina

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biochimica

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Immunologia e infezioni

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of multiplexing up to 22 or 24 samples with tandem mass tags or isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectively, in a single experiment. This enhanced sample multiplexing considerably reduces mass spectrometry acquisition times and increases the utility of the expensive commercial isobaric reagents. However, the manual process of sample handling and pipetting steps in the strategy can be labor intensive, time consuming, and introduce sample loss and quantitative error. These limitations can be overcome through the incorporation of automation. Here we transferred the manual cPILOT protocol to an automated liquid handling device that can prepare large sample numbers (i.e., 96 samples) in parallel. Overall, automation increases feasibility and reproducibility of cPILOT and allows for broad usage by other researchers with comparable automation devices.

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) is an enhanced sample multiplexing strategy that is capable of increasing the number of samples that can be analyzed simultaneously with available isobaric tags. Incorporation of a robotic platform has greatly increased experimental throughput, reproducibility, and quantitative accuracy.

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

Immunopeptidomics: Isolamento di peptidi associati A MHC di classe I e II di topi e umani per l'analisi della spettrometria di massa

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of applications. The cell surface proteome ("surfaceome") in human disease is of significant interest, as plasma membrane proteins are the primary target of most clinically approved therapeutics, as well as a key feature by which to diagnostically distinguish diseased cells from healthy tissues. However, focused characterization of membrane and surface proteins of the cell has remained challenging, primarily due to the complexity of cellular lysates, which mask proteins of interest by other high-abundance proteins. To overcome this technical barrier and accurately define the cell surface proteome of various cell types using mass spectrometry proteomics, it is necessary to enrich the cell lysate for cell surface proteins prior to analysis on the mass spectrometer. This paper presents a detailed workflow for labeling cell surface proteins from cancer cells, enriching these proteins out of the cell lysate, and subsequent sample preparation for mass spectrometry analysis.

Here, we describe a proteomics workflow for characterization of the cell surface proteome of various cell types. This workflow includes cell surface protein enrichment, subsequent sample preparation, analysis using an LC-MS/MS platform, and data processing with specialized software.

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Biologia

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Riepilogo

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La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

MALDI Imaging Mass Spectrometry dei neuropeptidi nella malattia di Parkinson

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

Immunopeptidomics: Isolamento di peptidi associati A MHC di classe I e II di topi e umani per l'analisi della spettrometria di massa

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

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Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

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"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Quantificazione delle proteine Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa