Name: induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells
Uploaded: 2017-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Max Planck.

1. Preparazione delle cellule V. parahaemolyticus elettrocompatibili e elettroporazione del DNA plasmidico nelle cellule nuotatori NOTA: La seguente sezione del protocollo consente la preparazione di celle elettro-competenti e la successiva elettroporazione del plasmide DNA in cellule nuotatori. Questo passo è importante se le proteine ​​fluorescenti vengono espresse ectopicamente da un plasmide. <ol><li> Sradicare le cellule V. parahaemolyticus da una riserva di glicerolo da -80 ° C su una piastra di LB agar fresca contenente 100 μg / mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Il giorno seguente, inoculare 200 ml di mezzo LB con una singola colonia di V. parahaemolyticus e incubare a 37 ° C in condizioni di agitazione fino a raggiungere un OD 600 di 1,0. Richiede solitamente 5-6 h di incubazione per la coltura cellulare per raggiungere la densità ottica desiderata. </li><li> Trasferire immediatamente le celle su ghiaccio e perfTutte le ulteriori tappe su ghiaccio e in centrifughe pre-raffreddate a 4 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule a 4 ° C per 10 minuti a 2.000 x g. </li><li> Scartare il surnatante decantando e ri-sospendere il pellet cellulare in 25 ml di soluzione fredda di saccarosio 273 mM (pH 7.4, tamponata con KOH). </li><li> Raccogli le cellule di nuovo a 4 ° C per 10 minuti a 2000 x g. Ripetere due ulteriori volte. </li><li> Riassemblare il pellet di cellule lavate in 400 μl di soluzione fredda di 273 mM di saccarosio. Successivamente aggiungere il glicerolo ad una concentrazione finale del 15% vol / vol. Le cellule sono pronte per l&#39;elettroporazione, ma possono anche essere congelate in aliquote di 70 μl a -80 ° C per un uso successivo. </li><li> Per l&#39;elettroporazione, mescolare una aliquota di elettrocompatibili da 70 μl con 100-1000 ng di DNA plasmidico e trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata (intervallo di elettrodo 0,2 cm). Effettuare l&#39;elettroporazione con le seguenti impostazioni: 25 μF, 2400 V e 200 Ω. </li><li> Sospendi laLe cellule nella cuvetta di elettroporazione in 600 μL di brodo LB, trasferire in un tubo da 2 ml e incubare agitando a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Spin giù le cellule a 2.000 xg per 5 min e ri-sospendere il pellet in 100 μL di brodo LB. Distribuire la sospensione cellulare su piastrine selettive di agar LB contenenti gli antibiotici necessari e incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Il giorno seguente, controllare le piastre per la formazione della colonia. Le colonie che crescono portano il gene di resistenza antibiotica corretta codificato sul plasmide e ora può essere utilizzato per ulteriori esperimenti. </li></ol> 2. Induzione della differenziazione delle cellule Swarmer NOTA: Le seguenti fasi descrivono come indurre la differenziazione del V. parahaemolyticus nel suo ciclo vitale della cellula swarmer e come stimolare la proliferazione sulle superfici solide. <ol><li> Sospendere 4 g di agar cuore infusione (HI) in 100 mL ddH 2 O per preparare le piastre di swarming. </li><li>Mescolare accuratamente la soluzione agar HI nel forno a microonde e scuotere la bottiglia di tanto in tanto finché la polvere non viene sciolta. Autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Dopo l&#39;autoclave, raffreddare l&#39;agar HI a 60-65 ° C. Aggiungere 2,2&#39;-Bipyridyl ad una concentrazione finale di 50 μM (soluzione di riserva di 50 mM in etanolo al 100%). Aggiungere CaCl 2 ad una concentrazione finale di 4 mM (soluzione di riserva di 4 M in ddH2O). Se necessario, aggiungete gli antibiotici nella soluzione per mantenere i plasmidi. NOTA: Se si prevede di utilizzare un plasmide inducibile, aggiungere agente induttivo alla sua concentrazione finale. ATTENZIONE: 2,2&#39;-Bipyridyl: tossicità acuta (orale, dermico, inalazione). Usare guanti e occhiali di protezione durante la manipolazione di questa sostanza chimica. </li><li> Versare 30 - 35 ml della soluzione finale agar HI in un piatto rotondo da 150 mm di Petri e lasciare che l&#39;agar si solidifichi. </li><li> Prima di individuare la coltura cellulare, asciugare la piastra agar a 37 ° C per almeno 10 minuti (o fino a quando nessun residuo liquidoSi avvicinò, ma non più) a destra con un coperchio aperto. NOTA: I tempi di essiccazione dipendono fortemente dall&#39;incubatrice utilizzata e le piastre asciutte non consentono lo scoramento di V. parahaemolyticus . (Questo passo è molto importante!) Le piastre devono essere utilizzate fresche e non devono essere più vecchie di 2 - 3 ore. Le vecchie lastre saranno troppo asciutte per stimolare lo swarming. </li><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C fino a raggiungere OD 600 = 0.8, richiede solitamente circa 2-3 ore. Successivamente, le cellule sono pronte per essere individuate sulle piastre agar HI swarming. </li><li> Posizionare 1 μl di coltura cellulare al centro di una piastra di brigatura agar HI ( Figura 1A ). </li><li> Lasciare asciugare il punto ( Figura 1B ). </li><li> Sigillare la piastra con un nastro di plastica trasparente e assicurarsi che sia saldamente attaccato, altrimenti potrebbe staccarsi durante l&#39;incubazione durante la notte ( Figura 1C ). NOTA: ÈMolto importante che il sigillo sia perfetto. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria e pieghe al nastro quando viene applicata. </li><li> Incubare la piastra a 24 ° C per una notte. Ciò comporterà la formazione di una colonia di V. parahaemolyticus con fasci di razza che si estendono dalla periferia della colonia ( Figura 2 ). </li></ol> 3. Preparazione delle cellule Swarmer V. parahaemolyticus per la microscopia a fluorescenza NOTA: Il seguente protocollo descrive come preparare le diapositive di agarosio a microscopia e la successiva imprinting di flaresci di swarming su un tampone di agarosio per ottenere singole cellule swarmer per la microscopia. <ol><li> Per preparare le diapositive agarose per microscopia aggiungere 1 g di agarosio a 100 ml di un 20% vol / vol PBS e 10% vol / vol LB broth solution. Mescolare accuratamente la soluzione nel forno a microonde per sciogliere l&#39;agarosio e lasciarlo raffreddare a 65-70 ° C mentre si mescola con un agitatore magnetico. </li><li> Luogo acScivolare il microscopio magro su una sezione perfettamente livellata di una panchina di lavoro. Coprire entrambe le estremità dello scivolo con due strati di nastro adesivo di laboratorio di uso generale, fissando la slitta alla panca di lavoro. La distanza tra i due pezzi di nastro dovrebbe essere di circa 3 cm. NOTA: i due strati di nastro creano una elevazione molto piccola, che determinerà l&#39;altezza del rilievo agarosio. È importante che lo spazio di lavoro sia livello per assicurarsi che le celle saranno nello stesso piano per l&#39;analisi microscopica. </li><li> Pipettare ~ 250 μL della soluzione di agarosio preparata in precedenza sulla superficie di vetro non coperta. </li><li> Ora posizionare una seconda scivola a microscopio nello stesso orientamento del fondo in alto e premere leggermente verso il basso in modo che l&#39;agarosio residuo possa scorrere verso i lati. </li><li> Lasciare che l&#39;agarosio si solidifichi per 1-2 min e poi tirare lentamente la scaletta di vetro superiore dal basso in un movimento orizzontale. </li><li> Utilizzando un bisturi, tagliare qualsiasi agarosio residuo che è attaccato alI lati dello scivolo del microscopio e rimuovere lentamente il nastro dalle estremità del vetrino del microscopio. NOTA: La scocca di agarosso è pronta e deve essere utilizzata il più presto possibile in quanto si inizia lentamente a seccare. </li><li> Per eseguire la microscopia su cellule swarmer, tagliare un pezzo di agarro da 3 mm x 10 mm dal bordo più esterno di una colonia di scorrimento ( Figura 1D ). E &#39;molto importante non rompere la guarnizione a nastro della piastra a scoppio fino immediatamente prima del trasferimento di cellule swarmer al vetrino del microscopio. Una volta che il nastro viene rimosso, le cellule V. parahaemolyticus innescano la differenziazione in cellule nuotatori. NOTA: Assicurarsi di indirizzare i tagli dall&#39;esterno del bordo della colonia di scorrimento verso l&#39;interno della colonia ( Figura 1D ). In questo modo è possibile impedire la &quot;contaminazione del nuotatore&quot; nel bordo della colonia di swarming. </li><li> Trasferire il pezzo di agar di scorrimento su un microscopio scivolo agaroso con le cellule affacciate sul agarosio paD ( figura 1E ). Questo imprime le cellule swarming sul tampone agarosio. </li><li> Dopo aver aspettato ~ 30 s, rimuovere attentamente il pezzo agar dal tampone agarosio ( Figura 1F ). </li><li> Mettere un coperchio di vetro sul tampone di agarosio dove le cellule sono state imprintate. Le cellule sono pronte per la microscopia. NOTA: è importante immaginare immediatamente le cellule swarmer, poiché le cellule swarmer iniziano lentamente la differenziazione allo stato nuotatore. </li></ol> 4. Preparazione di V. parahaemolyticus Swimmer Cell-cultures per microscopia a fluorescenza NOTA: Questa sezione del protocollo descrive come preparare una coltura di V. parahaemolyticus per eseguire la microscopia a fluorescenza sul tipo di nuotatore. <ol><li> Inoculare una piccola quantità di cellule dal bordo di una singola colonia in 5 ml di brodo LB. Incubare la coltura agitando a 37 ° C per 1 ora o fino a quando la leggera crescita cellulare diventa visibile. </li><li> AQuesta fase, se necessario, aggiungerà agente induttivo per l&#39;espressione di proteine ​​di interesse. In questo esempio, L-arabinosi è stata aggiunta ad una concentrazione finale dello 0,2% (w / vol) per indurre l&#39;espressione di YFP-CheW 9 . </li><li> Incubare la coltura agitando per altri 2 h a 37 ° C. </li><li> Seguire le fasi 3.1-3.7 per preparare le diapositive a microscopio agarosio. </li><li> Spot 1 μL di coltura cellulare al centro del tampone agarosio e lasciare incubare il punto fino a secco. </li><li> Posizionare una copertura in vetro sul rilievo di agarosio dove le cellule sono state individuate. Le cellule sono ora pronte per essere riprese sotto il microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Analisi delle immagini Questa parte del protocollo descrive un flusso di lavoro per l&#39;analisi delle immagini, in particolare come estrarre i dati di fluorescenza delle singole celle per l&#39;analisi demografica. <ol><li> Prima di iniziare l&#39;analisi delle immagini assicurarsi che tutte le immagini di microscopia vengano salvate in formato TIF a 16 bit. </li><li> Caricare il DIC (o il contrasto di fase) e le corrispondenti immagini del canale fluorescente nel software. </li><li> Genera un&#39;immagine di sovrapposizione di entrambi i canali selezionando &quot;Mostra / Sovrapposizione immagini&quot;. Impostare il numero di immagini (&quot;# Immagini:&quot;) a due e selezionare l&#39;immagine DIC nel primo canale e l&#39;immagine fluorescente nel secondo canale. </li><li> Selezionare lo strumento &quot;Multi-Line&quot; dalla barra degli strumenti e contrassegnare le celle da un polo all&#39;altro attraverso la metà della cella. Per ottenere un elenco di tutte le linee generate (oggetti di linea), aprire &quot;Measure / Region Measurements&quot;. Configurare le misure della regione per visualizzare solo l&#39;etichetta della regione, la distanza e l&#39;intensità media. </li><li> Calibrare la dimensione dei pixel sotto &quot;Misura / calibrazione delle distanze&quot; alla dimensione del pixel specificata per la configurazione del microscopio e fare clic su &quot;Applica a tutte le immagini aperte&quot;. </li><li> Trasferisci tutte le regioni (oggetti di linea) all&#39;immagine del canale fluorescente. Sotto &quot;Regioni / TrasfEr Regions &quot;selezionare l&#39;immagine di origine (l&#39;immagine di sovrapposizione) e l&#39;immagine di destinazione (l&#39;immagine del canale fluorescente). Selezionare&quot; Tutte le regioni &quot;e premere&quot; OK &quot;. NOTA: Per riuscire a riprodurre le righe esatte (oggetti di linea, regioni, ROI), aprire &quot;Regioni / Salva regioni&quot; e salvare le regioni. </li><li> Esportare le misurazioni di tutte le regioni in un foglio di calcolo aprendo &quot;Measure / Measurements Region&quot; e premendo &quot;Open Log&quot;. Confermare di aprire ed esportare i dati. Una volta aperto il foglio di calcolo in background, esportare i dati premendo &quot;F9: Log Data&quot;. </li><li> Per determinare la posizione dei foci fluorescenti lungo la cella, aprire &quot;Measure / Linescan&quot;. Impostare &quot;Linescan Width&quot; in un valore in modo che l&#39;intera larghezza di una cella sia coperta dalla regione creata in precedenza. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico di scansione di linea e selezionare &quot;Mostra dati grafico&quot;. Cliccando con il tasto sinistro e trascinando il cursore del mouse lungo la linea di scansione sullo schermoPunto di interesse, la finestra &quot;Grafico dati&quot; visualizzerà la corrispondente pixel / distanza tra i due punti. Selezionare la riga evidenziata blu e quindi copiare il contenuto. NOTA: L&#39;intero profilo di intensità della scansione di linea può essere registrato in un foglio di calcolo premendo &quot;Log Data&quot; nella finestra &quot;Linescan&quot;. I dati estratti possono ora essere utilizzati per la visualizzazione in grafici o ulteriori analisi statistiche. I modelli di localizzazione del ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza delle cellule e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute utilizzando lo stesso ROI precedentemente selezionato. Le seguenti fasi forniranno un esempio di come generare demografia simile a quelle riportate nelle figure 3C e 4C . <ol><li> Nelle mappe di regione di caricamento di Figi / ImageJ (.rgn) precedentemente create nel software (passo 5.6) utilizzando il &quot;importatore di file Metamorph nd &amp; ROI&quot;;. In alternativa, le regioni di interesse (ROI) delle cellule da analizzare possono essere create direttamente in Figi / ImageJ utilizzando lo strumento &quot;Segmented Line&quot;. </li><li> Apri &quot;Analizza / Strumenti / Gestione ROI&quot; e segnala tutte le voci di elenco attivo &quot;. </li><li> Successivamente, fare clic su &quot;Altro / Multiplot&quot; e selezionare &quot;Elenco&quot; nella nuova finestra &quot;Multi Plot&quot;. Fare clic su una voce di tabella, quindi selezionare e &quot;copiare tutto&quot;. Successivamente, incollare in un nuovo foglio di lavoro. NOTA: Assicurarsi che i dati della cella più lunga (due colonne X e Y corrispondenti con il maggior numero di righe) siano l&#39;ultima a destra nel foglio di calcolo. </li><li> Salva il foglio di calcolo come &quot;CSV (delimitato da virgole) (* .csv)&quot;. </li><li> Scaricare gli script R qui da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10. Gli script gestiscono le celle per lunghezza e normalizzano i profili di intensità fluorescenti di tutte le celle come una media della fluorescenza di ciascuna cellae. </li><li> Esegui l&#39;intero script &quot;profili di cella function.R&quot; in R [versione 3.0.1; 11 ]. </li><li> Modificare lo script &quot;example plots.R&quot; nella riga 30 in modo tale che il percorso del file si riferisca alla cartella in cui viene salvato il file .csv generato in precedenza. Inoltre, modificare il nome del file &quot;profile.csv&quot; nella riga 31 al nome del file scelto per il file .csv generato nel passaggio 5.9.4. Successivamente, eseguire &quot;esempio plots.R&quot; e seguire la documentazione da &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; nonché i commenti del file di script per generare l&#39;analisi demografica. </li></ol></li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Questo documento descrive un metodo per l&#39;imaging microscopico delle cellule swarmer V. parahaemolyticus seguito da analisi a valle destinate a risolvere e quantificare la localizzazione subcellulare e altre caratteristiche delle proteine ​​studiate fluorescenti. Sebbene esistano diversi strumenti per l&#39;elaborazione e l&#39;analisi di immagini microscopiche 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , l&#39;analisi delle cellule di swamping V. parahaemolyticus rimane impegnativa soprattutto perché normalmente esistono all&#39;interno di una comunità cellulare densa e vi è un&#39;elevata variazione della lunghezza cellulare ( Figura 2 ). Pertanto, la rilevazione automatica delle celle è talvolta difettosa e quindi i risultati sono in qualche modo inaffidabili. Questo protocollo descrive una pipeline progettata per coltivare , immaginare e analizzare le cellule di V. parahaemolyticus , che è adattata alle specificheLe necessità efficaci di queste cellule, ad esempio un ambiente di crescita controllato su un&#39;analisi di immagini a livello e a valle che accolgono la presenza di celle di lunghezze variabili che crescono in stretta vicinanza. La capacità di esprimere ectopicamente una proteina di interesse da un plasmide può essere importante per diversi esperimenti, ad es. Espressione di proteine ​​etichettate con fluorescenza per studi di microscopia o complementazione delle delezioni geniche. Qui viene descritto anche il processo di preparazione delle cellule chimicamente competenti e l&#39;elettroporazione del plasmide DNA in V. parahaemolyticus. Il vantaggio dell&#39;elettroporazione sulla coniugazione, spesso usato per V. parahaemolyticus , è che la spina dorsale del plasmide non deve essere modificata per consentire la coniugazione. Tuttavia, occorre adottare alcune precauzioni; Come descritto nel punto 1.2, è molto importante raggiungere una densità di cella di OD 600 = 1,0. Alle densità ottiche più basse le cellule si lenti su elettroporatiSu e alle densità più elevate il plasmide non viene assorbito dalle cellule. Inoltre, la centrifugazione troppo dura delle cellule di V. parahaemolyticus (punti 1.4-1.6) diminuisce drasticamente l&#39;efficienza dell&#39;elettroporazione. È anche importante riposizionare attentamente la pellicola cellulare durante i passi di lavaggio per generare celle elettro-competenti. Sebbene la preparazione di una coltura delle cellule sembrasse banale, la densità della cultura è molto importante per le prestazioni di brulicante. In genere, una coltura cellulare nella fase di crescita iniziale esponenziale (OD 600 &lt;0,5) produrrà una colonia di scorrimento più grande durante l&#39;incubazione di una notte che una coltura in fase tardiva esponenziale o stazionaria precoce. A seconda dell&#39;esperimento, una colonia di rocciosa più grande potrebbe essere utile. Tuttavia, per confrontare l&#39;espansione della colonia e la morfologia tra vari ceppi cresciuti sulla stessa piastra di agar HI, è importante avere spazio sufficiente tra le singole colonie di brulicante. Questo può essere achOsservato da una coltura di cellule di densità ottica superiore che di solito provocherebbe piccole colonie di brulicante. L&#39;induzione del fenotipo di swarming varia notevolmente tra le specie batteriche e la riproducibilità è fortemente influenzata da fattori quali l&#39;agar e la composizione nutritiva, la temperatura ambiente e il contenuto di umidità sia dell&#39;ambiente che del medium di crescita. Di conseguenza, piccoli cambiamenti nel protocollo e nell&#39;ambiente esterno influenzano in modo significativo i risultati del sondaggio e l&#39;induzione della differenziazione del swarmer. Sono stati riportati protocolli per indurre lo swarming di altre specie batteriche come Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis 19 . Le fasi descritte in questo protocollo produrranno in modo affidabile la tipologia di cellule swarmer di V. parahaemolyticus e mantenerle sotto forma di colonie che scottano che producono singoli strati di brulicante a bordo della colonia. Per eseguire stabili eSperimentali riproducibili sul tipo di cellule swarmer di V. parahaemolyticus , la preparazione delle piastre di agar HI swarming è la parte più importante di questo protocollo. In particolare, la fase di asciugatura potrebbe richiedere l&#39;ottimizzazione, in quanto ogni incubatore esegue in modo diverso. Un altro fattore che può influenzare il comportamento dello swarming è il tipo di plastica utilizzata nei piatti di Petri. I piatti tipici di Petri utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire esperimenti di brulicante sono realizzati in polistirene (PS). Tuttavia, utilizzando piatti di Petri realizzati in polietilene a bassa densità (PE LD) hanno prodotto risultati misti in sondaggi di swarming. E &#39;fondamentale seguire le fasi descritte, perché solo le colonie di swarming riproducibili che mostrano una distinta formazione di flare periferiche, consentono la microscopia delle cellule singole swarmer. Indubbiamente, si possono adottare approcci diversi per visualizzare i risultati ottenuti mediante studi microscopici a fluorescenza delle cellule di rottura di V. parahaemolyticus . Per instancE, il programma ampiamente utilizzato MicrobeTracker 16 rappresenta un&#39;alternativa plausibile. L&#39;applicazione recentemente disponibile di MicrobeTracker Oufti 20 , che non richiede MATLAB, è anche un&#39;altra alternativa. Tuttavia, l&#39;uso di immagini di differenza di interfaccia differenziale (DIC) non è possibile in Oufti, e l&#39;imaging di contrasto di fase non è idoneo a distinguere la segmentazione cellulare nelle cellule swarmer. Inoltre, non tutti i microscopi sono equipaggiati per l&#39;imaging a contrasto di fase e, a sua volta, l&#39;imaging a contrasto di fase non è adatto a tutti i tipi di analisi di microscopia. Un altro strumento promettente, gratuito e basato su ImageJ, è MicrobeJ 17 , ma ancora di più può essere utilizzato solo il contrasto di fase e le immagini fluorescenti. Inoltre, questo protocollo consente solo l&#39;imaging e l&#39;analisi delle cellule in momenti specifici del loro ciclo di vita. Tuttavia, un ottimo protocollo che descrive l&#39;imaging di tempo e l&#39;analisi di immagine successiva, che consente di seguire singoliLe traiettorie delle cellule e le dinamiche proteiche 21 possono anche essere applicate a V. parahaemolyticus . Seguendo le fasi descritte in questo protocollo, gli scienziati consentiranno di eseguire microscopia a fluorescenza a cellule singole affidabili e riproducibili sia per il nuotatore che per il tipo di cellule swarmer di V. parahaemolyticus . Questo protocollo illustra un modo robusto per trasformare V. parahaemolyticus dal suo nuotatore nel suo tipo di cellule swarmer. Imprimendo il monostrato di cellule swarmer dai perturbatori periferici di colonie di swarming su un tampone di agarosio, si può osservare la localizzazione intracellulare di proteine, la pipeline per l&#39;analisi delle immagini può essere applicata ad altre specie batteriche che esistono all&#39;interno delle comunità batteriche dove le cellule crescono Vicinanza molto vicina e situazioni in cui l&#39;analisi automatica delle immagini potrebbe non essere un vantaggio.

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l&#39;ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell&#39;organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell&#39;ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell&#39;uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all&#39;antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l&#39;inibizione della divisione cellulare e l&#39;induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori. Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l&#39;inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene 1 . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l&#39;aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer 2 . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell&#39;induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l&#39;accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all&#39;interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . Tuttavia, l&#39;identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l&#39;eccesso di disponibilità del calcio 6 e della limitazione di ferro 7 aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2&#39;-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer 8 . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide. V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi - processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine ​​secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine ​​è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido 8 . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine ​​etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l&#39;analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>For preparation of LB agar with LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra quality</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>For preparation of microscopy agarose pads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Used to induce pBAD derivatives</td></tr><tr><td>2,2`-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>-</td><td>-</td><td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>D(+) Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hardware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 mm x 20 mm with cams</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus</td><td>-</td><td>Used for drying HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Used for microscopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Used for microscopy data analsis</td></tr></tbody></table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

La capacità di studiare la localizzazione intracellulare delle proteine ​​è essenziale per la comprensione di molti processi cellulari. A sua volta, questo richiede la possibilità di ottenere singole celle per la microscopia a fluorescenza, che può essere particolarmente impegnativa quando le cellule di immagini che esistono all&#39;interno delle comunità batteriche. Ad esempio, il patogeno umano Vibrio parahaemolyticus esiste come brevi cellule nuotatori a forma di bastoncino in condizioni liquide che, al contatto con la superficie, si differenziano in una sottopopolazione di cellule swarmer altamente allungate specializzate per la crescita su superfici solide. Questo articolo presenta un metodo per eseguire un&#39;analisi microscopica di una singola cellula di V. parahaemolyticus nei suoi due stati differenziali. Questo protocollo produce molto riproducibilmente la differenziazione del V. parahaemolyticus in un ciclo vitale della cellula swarmer e facilita la loro proliferazione su superfici solide. Il metodo produce fasci di cellule swarmer differenziate che si estendono da tÈ il bordo della colonia. Notevolmente, alla punta delle bruciature di swarm, le cellule swarmer esistono in un unico strato di cellule, che consente loro facile trasferimento a una diapositiva del microscopio e successiva microscopia a fluorescenza di singole cellule. Inoltre, viene presentato il flusso di lavoro dell&#39;analisi delle immagini per la rappresentazione demografica delle società batteriche. Come prova del principio, è descritta l&#39;analisi della localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione chimotassie in nuotatori e cellule swarmer di V. parahaemolyticus.

Induzione della differenziazione e della generazione di colonie di brulicante La figura 1 fornisce uno schema delle fasi importanti per la produzione di colonie di V. parahaemolyticus ( Figura 1A-C ). Una cultura del nuotatore è stata individuata su agar aghi e incubata a 24 ° C, inducendo una differenziazione e una proliferazione del swarmer sulla superficie del solido agar. Una rappresentazione stereo-microscopia immagine di una colonia di swarming è presentata in Figura 2 . L&#39;imaging stereo-microscopico indica chiaramente i brillamenti che si estendono verso l&#39;esterno della periferia della colonia. L&#39;ingrandimento più alto rivela che nelle cellule di brughiera, le cellule sono raggruppate solo in mono o bi-strati, mentre in mezzo le cellule di colonie sono sovrapposte in più strati ( Figura 2A ). I bastoni a scoppio possono essere facilmente trasferiti (come descritto nei passaggi 3.8-3.11, <stronG&gt; Figura 1) ad una diapositiva del microscopio. Importante, i brillamenti consistono solo in una popolazione completamente differenziata di cellule swarmer ( Figura 2B ). Ciò è in contrasto con le cellule del centro della colonia, che sono significativamente più brevi e probabilmente rappresentano una miscela di nuotatori e cellule swarmer ( Figura 2B ) 9 . Inoltre, un attento trasferimento del flare allo scivolo del microscopio lascia intatte la struttura complessiva e l&#39;estremità dello swarm-flare, dando luogo a un mono strato di cellule swarmer accessibili per la microscopia a cella singola. Quando si esegue l&#39;impronta dei diaframmi sullo scivolo del microscopio, è molto importante effettuare il trasferimento il più dolce possibile e non aggiungere troppa pressione - altrimenti le cellule provenienti da fasci di razza si spargeranno sul mix di diapositive con le cellule non swarmer provenienti da Al centro della colonia. Microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini <pPer dimostrare il principio della microscopia a cellule singole di nuammatori e cellule swarmer del parahaemolytic differenzialmente distinte, è stata eseguita un&#39;analisi dettagliata di YFP-CheW espressamente ectopicamente. CheW è una proteina chimotassiale essenziale e può essere utilizzata come marcatore per la localizzazione intracellulare di array di segnalazione chemotatiche 9 , 12 . Un plasmide che codifica YFP-CheW sotto un promotore indottabile da L-arabinosi è stato elettroporato in V. parahaemolyticus come descritto nella sezione 1 del protocollo. Per microscopia, le nuotatrici e le cellule swarmer sono state preparate come descritto rispettivamente nelle sezioni 4 e 3. Come precedentemente descritto, YFP-CheW è localizzato in un unipolare ( figura 3A , frecce rosse) e bi-polare ( figura 3A , frecce gialle) 12 , 13 . Di conseguenza, l&#39;identificazione del polo cellulare anLa variazione della localizzazione di proteine ​​YFP a diverse lunghezze offre una grande comprensione di come il modello di localizzazione si evolve quando il ciclo cellulare procede. Questi dati possono quindi essere visualizzati in diagrammi di dispersione che correlano le variabili &quot;lunghezza cellulare&quot; e &quot;distanza dei foci al polo cellulare&quot; (Figura 3B). Per evitare imprecisioni nel rilevamento dei contorni, che è comune quando si utilizzano strumenti di rilevamento automatico delle celle, le celle vengono selezionate mediante la traccia manuale di una linea da un polo all&#39;altro utilizzando l&#39;opzione &quot;Multi-line&quot; in MetaMorph o &quot;Linea segmentata&quot; nel Piattaforma open-source ImageJ. Successivamente, i profili di intensità della regione di interesse selezionata (ROI) possono essere raccolti, permettendo l&#39;identificazione del punto in cui la proteina YFP ha mostrato la sua massima intensità e anche la lunghezza totale della cellula. I profili di fluorescenza delle singole cellule sono stati analizzati come descritto nella sezione 5 e sono stati presentati plottando la distanza dei foci ai poli di celluleIn funzione della lunghezza della cella ( Figura 3B ). Questa analisi dimostra chiaramente che le celle corte mostrano solo un modello di localizzazione unipolare di YFP-CheW, mentre nelle celle più lunghe YFP-CheW è localizzato bi-polarmente. Inoltre, i pattern di localizzazione sul ciclo cellulare possono essere facilmente visualizzati in una rappresentazione demografica della lunghezza cellulare e delle intensità fluorescenti lungo il corpo cellulare. Queste rappresentazioni possono essere ottenute usando gli stessi ROI precedentemente selezionati quando si preparano i diagrammi di dispersione. Di conseguenza, è stata eseguita un&#39;analisi demografica dell&#39;intero profilo di fluorescenza cellulare come descritto al punto 5.9 ( figura 3C ). Questa analisi mostra chiaramente un modello simile di localizzazione YFP-CheW, con YFP-CheW localizzato unipolarmente in celle corte e bi-polarmente localizzato in celle più lunghe. Quindi, indicando un modello di localizzazione dipendente dal ciclo cellulare, dove YFP-CheW è localizzato unipolarmente nelle celle recentemente divise (breve) e quindi ottiene rEcruited al polo opposto più tardi nel ciclo cellulare (celle lunghe), con conseguente localizzazione bi-polare. Un&#39;analisi analoga è stata effettuata su cellule swarmer ( Figura 4 ). L&#39;analisi basata sulla popolazione mostra differenze significative nella localizzazione della YFP-CheW in cellule swarmer rispetto a quella del tipo di nuotatore. YFP-CheW è sempre localizzato bi-polarmente ( figura 4A , frecce gialle) e soprattutto YFP-CheW forma anche i cluster situati casualmente lungo la lunghezza della cella ( Figura 4A , frecce arancione). Pertanto, ci sono importanti cambiamenti nella localizzazione intracellulare delle matrici di segnalazione di chemotaxis durante la differenziazione di V. parahaemolyticus . Questo esempio mostra che il metodo descritto consente di produrre una popolazione cellulare swarmer facilmente accessibile per la microscopia a fluorescenza a cellule singole. Inoltre, dimostra che la pipeline descritta per l&#39;analisi delle immagini consente l&#39;analisi demografica dell&#39;organizzazione intracellulareDelle cellule swarmer di V. parahaemolyticus . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig1.jpg" /> Figura 1: Induzione della differenziazione swarmer e preparazione delle cellule per la microscopia. Visualizzazione semplificata del flusso di lavoro per produrre le cellule swarmer V. parahaemolyticus e la preparazione di diapositive a microscopio per l&#39;analisi microscopica di singole cellule swarmer. ( A ) Individuare 1 μL di una coltura di cellule di V. parahaemolyticus OD 600 = 0,8 al centro di una piastra di brigatura HAR agar. ( B ) Incubare il punto fino ad essere asciugato e le cellule sono fissate alla superficie del agar. ( C ) Sigillare il piatto di Petri con nastro trasparente. Incubare la piastra a 24 ° C per 16 ore. ( D ) Acciai accuratamente un piccolo pezzo di agar HI dal bordo esterno della colonia di swarming. ( E ) Trasferire l&#39;escissione su un micrOscopio di agarosio con le cellule swarmer rivolte al tampone agarosio. Dopo un breve periodo di incubazione di 30 sec, le cellule swarmer vengono imprimate sul tampone agarosio. ( F ) Rimuovere accuratamente l&#39;agar escassato dal tampone agarosio e posizionare una copertura microscopica sulla parte superiore. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55842/55842fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig2.jpg" /> Figura 2: L&#39;organizzazione delle cellule in una colonia di rovina V. parahaemolyticus . ( A ) Stereomicroscopia di una colonia di V. parahaemolyticus swarmer. I pannelli superiori visualizzano il bordo esterno di una colonia di swarming in ingrandimento crescente. I pannelli inferiori mostrano un&#39;area della colonia di scorrimento tra il centro e il bordo aumentando l&#39;ingrandimento. Gli sparatorie si estendono dalla periferia diLa colonia. ( B ) Immagini rappresentative di microscopia DIC del bordo della colonia swarmer (pannello superiore) e una zona tra il centro e la periferia (pannello inferiore) dopo il trasferimento di celle dalle rispettive posizioni indicate della colonia di scorrimento. I brillanti sono stati imprinti direttamente su un microfilo di agarosio come descritto nei passaggi 3.8-3.11. Le cellule della zona tra il centro e la periferia sono state prima strappate fuori dalla colonia di swarm e ri-sospese nel brodo LB, prima di essere individuate su un micro agglomerato di agarosio. Barra di scala = 7,5 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55842/55842fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig3.jpg" /> Figura 3: Localizzazione di array di Chemotaxis nelle cellule nuotatori di V. parahaemolyticus. ( A ) DIC e immagini microscopiche fluorescenti delle cellule nuotatori del parahaemolyticus selvatico di tipo V. Ectopicamente esprimono YFP-CheW. ( B ) Grafico che mostra la distribuzione di foci YFP-CheW plottando la distanza dei foci dai poli della cellula in funzione della lunghezza delle celle nelle nuotate. ( C ) Analisi demografica dei profili di intensità della fluorescenza delle cellule nuotatori V. parahaemolyticus che esprimono YFP-CheW. Le cellule sono ordinate per lunghezza cellulare e mostrano un&#39;intensità fluorescente relativa. Barra di scala = 5 μm. I pannelli B e C sono adattati dal riferimento 9 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55842/55842fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55842/55842fig4.jpg" /> Figura 4: Localizzazione di array di Chemotaxis in cellule Swarmer di V. parahaemolyticus. </strOng&gt; ( A ) DIC e immagini microscopiche fluorescenti delle cellule swarmer di tipo V. parahaemolyticus selvatiche che esprimono ectopicamente YFP-CheW. ( B ) Grafico che mostra la distribuzione di foci di YFP-CheW plottando la distanza dei foci dai poli della cellula in funzione della lunghezza delle cellule in cellule swarmer. ( C ) Analisi demografica dei profili di intensità di fluorescenza delle cellule swarmer di V. parahaemolyticus che esprimono YFP-CheW. Le cellule sono ordinate per lunghezza cellulare e visualizzano l&#39;intensità fluorescente relativa. Barra di scala = 5 μm. I pannelli B e C sono adattati da riferimento 9 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55842/55842fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l&#39;analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l&#39;induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l&#39;analisi delle immagini.

Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K Views.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  Questo protocollo consente la microscopia a cellule singole del nuotatore diverso Vibrio parahaemolyticus e delle cellule swarmer. Il metodo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili per l'analisi delle cellule singole e copre la preparazione delle colture cellulari, l'induzione della differenziazione swarmer, la preparazione del campione e l'analisi delle immagini. 

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Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Il monitoraggio spaziale segregazione in superficie Colonizzare microbiche Popolazioni

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

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Genetica

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochimica

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Bioingegneria

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Immunologia e infezioni

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

Analisi automatizzata dei fenotipi intracellulari di Salmonella con ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biologia

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. Therefore, it is considered a living antibiotic. To apply B. bacteriovorus as a living antibiotic, it is first necessary to understand the major stages of its complex life cycle, particularly its proliferation inside prey. So far, it has been challenging to monitor successive stages of the predatory life cycle in real-time. Presented here is a comprehensive protocol for real-time imaging of the complete life cycle of B. bacteriovorus, especially during its growth inside the host. For this purpose, a system consisting of an agarose pad is used in combination with cell-imaging dishes, in which the predatory cells can move freely beneath the agarose pad while immobilized prey cells are able to form bdelloplasts. The application of a strain producing a fluorescently tagged &#946;-subunit of DNA polymerase III further allows chromosome replication to be monitored during the reproduction phase of the B. bacteriovorus life cycle.

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Presented here is a protocol that describes monitoring of the complete life cycle of predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy in combination with an agarose pad and cell-imaging dishes.

Imaging a cellule vive del ciclo di vita del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza Time-Lapse

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di

Riepilogo

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