Gli autori ringraziano la d. ssa Jim Lah e Allan Levey, Emory dipartimento di neurologia, per suggerimenti e commenti utili. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Partnership di medicina accelerando concessione (U01AG046161-02), la Emory Alzheimer malattia Research Center (P50AG025688) e un Istituto nazionale su invecchiamento concedere (R01AG053960-01) di N.T.S Questa ricerca è stata anche sostenuta in parte dal nucleo della neuropatologia della sovvenzione Emory neuroscienze NINDS Core strutture, P30NS055077.

etica istruzione: tutti i tessuti del cervello sono stati ottenuti da Emory Alzheimer &#39; s malattia Research Center (ADRC) Brain Bank. Tessuti umani post mortem sono stati acquisiti sotto protocolli appropriati Institutional Review Board (IRB).
 1. omogeneizzazione e frazionamento <ol><li>selezione del tessuto Nota: Frozen tessuto corteccia frontale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico casi confermati di annuncio sono stati selezionati dalla Emory Banca di cervello ADRC (n = 2). Post mortem neuropathological valutazione della distribuzione della placca dell'amiloide è stato eseguito secondo il Consorzio di istituire un registro per Alzheimer &#39; s malattia semi-quantitativa segnando criteri 24, anche se patologia neurofibrillary di groviglio è stata valutata in conformità con il sistema di stadiazione di Braak. 16 <ol><li>ottenere congelato tessuto cerebrale post mortem da sani di controllo (Ctl) e patologico confermato casi di AD. Utilizzando contenitori di ghiaccio secco, pinze e una lama di rasoio, asportare ~ porzioni di 250 mg di materia grigia da ogni campione di tessuto su monouso tarato pesano barche, avendo cura di evitare che il tessuto dallo scongelamento. Registrare il peso di ciascun pezzo di omogeneizzati.</li>
		<li>Accise ~ 250 mg di sostanza grigia utilizzando forcipe e rasoio controllando visivamente per individuare l'interfaccia tra la materia grigia esterna e interna della materia bianca. Evitare di materia bianca e ancora più importante, qualsiasi grandi vasi sanguigni o regioni sanguinose, meningi o mater aracnoide. Mantenere il tessuto congelato durante il processo di taglio lavorando rapidamente e frequentemente posizionando barca pesatura con tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco</li>
		<li>Registra il peso esatto di materia grigia asportato da ogni pezzo congelato utilizzando una bilancia analitica. Calcolare il volume di tampone di basso contenuto di sale (LS) (Vedi tabella 1) necessaria per omogeneizzazione lisata (5 mL/g o 20% w/v).</li>
		<li>Preparare 10 mL LS tampone con 1x dell'inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail e chill sul ghiaccio.</li>
		<li>Rimuovere tessuto pesato e pesatura barca da ghiaccio secco e dadi pezzetti di circa 2 x 2 mm come si scioglie. Trasferimento a una provetta da 2 mL pre-refrigerati lisata omogeneizzatore su Ice.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL/g (20% w/v) del buffer ghiacciata basso contenuto di sale (LS) con 1 X cocktail di inibitore della proteasi e fosfatasi.</li>
		<li>Omogenizzazione del tessuto di cervello sul ghiaccio con circa 10 colpi di clearance elevata pestello A e 15 colpi di pestello bassa clearance B.</li>
		<li>Trasferire tutti omogeneato ad un tubo in polipropilene da 2 mL utilizzando un pipetta Pasteur di vetro. Etichettare la provetta con &#8220; TH &#8221; (Totale omogeneato), il tessuto caso numero e volume omogeneato. aliquota 0,8 mL in una provetta con etichetta 1,5 mL. Qualsiasi omogeneato in eccesso può essere similmente aliquotati e conservati a -80 ° C.</li>
		<li>Per ogni aliquota di mL 0,8, aggiungere 100 µ l di 5 M di NaCl e sarkosyl 10% (p/v) a concentrazioni di 0,5 M e 1% w/v, rispettivamente. Tubi di mescolare bene capovolgendo e incubare in ghiaccio per 15 min. Etichettare provette con &#34; TH-S &#34; (Totale omogeneato-Sarkosyl) per indicare che gli omogeneati sono nel sarkosyl-buffer (tabella 1).</li>
		<li>Sonicare ogni tubo per gli impulsi di tre 5 s a 30% ampiezza sul ghiaccio (intensità massima = 40%) utilizzando una sonda microtip.</li> <li>determinare le concentrazioni di proteina degli omogeneati usando l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio 25 Metodo. 
		Nota: La concentrazione media di proteine degli omogeneati TH-S preparati alle LS da 5 mL per grammo di tessuto è 15-20 mg/mL. Gli omogeneati possono essere frazionati immediatamente o conservati a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Omogeneati diluire TH-S a 10 mg/mL utilizzando ghiacciata sark buffer (tabella 1) con inibitori di proteasi e fosfatasi: 1x.</li>
		<li>Trasferire 5 mg proteina (0,5 mL) di ogni omogeneato TH-S in 500 µ l in policarbonato ultracentrifuga provette e coppia-equilibrio con buffer di sark. Caricare i tubi in un rotore pre-refrigerato e ultracentrifuga a 180.000 x g per 30 min a 4 surnatanti di trasferimento sarkosyl-solubile ° C. (S1) per provette da 1,5 mL e conservare a -80 ° C. 
		Nota: (Lavaggio facoltativo) aggiungere 200 µ l di sark-tampone per l'ultracentrifuga tubi contenenti le frazioni di detersivo-insolubili (P1) e sloggiare i pellet (P1) dalla parte inferiore dei tubi ultracentrifuga utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.</li>
		Tubi di <li>brevemente impulso-spin invertito per 2-3 s (&#8804; 2.500 x g) in una microcentrifuga per trasferire il pellet (P1) e il buffer nelle provette da 1,5 mL qui sotto. Risospendere il pellet insolubile (P1) nel buffer di sark pipettando su e giù per assicurare il pellet è perturbato.</li>
		<li>Coppia-equilibrio e centrifugare a 180.000 x g per altri 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante di lavaggio opzionale (S2) e incubare i pellet sarkosyl-insolubile (P2) in 50-75 µ l di tampone di urea (tabella 1) con 1 x PIC (inibitore di proteasi e fosfatasi cocktail) per 30 min a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet. 
		Nota: Buffer di urea calda a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare la precipitazione di SDS. Per le applicazioni sensibili al detersivo, omettere SDS dal buffer di urea e considerare lavare il precipitato insolubile (P2) in basso tampone salino prima ematico nel buffer di urea.</li>
		<li>Trasferire il sedimento pellet (P2) in 0,5 mL provette e utilizzare breve (1 s) microtip sonicazione a 20% ampiezza (intensità massima = 40%) per solubilizzare completamente il pellet.</li>
		<li>Determinare le concentrazioni di proteina di sarkosyl-solubile (S1) e - metodo di analisi insolubile (P2) frazioni utilizzando la BCA. Utilizzare queste frazioni immediatamente o conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western blotting Nota: macchiare occidentale è stato eseguito secondo le procedure precedentemente segnalate con lievi modifiche. 5 , 10 <ol><li>preparare 40 µ g campioni di totali omogeneati (TH-S), sark-solubile (S1) e le frazioni (P2) di sark insolubile nel buffer del campione di 1 X Laemmli SDS-page con pH compreso tra 5 mM TCEP 7. Incubare i campioni a 95 ° C per 5 min.</li>
		<li>Carico campione su una Bis-Tris 10 pozzetti prefabbricati 4-12% SDS-PAGE gel. Elettroforesi a 80 V per il primo centimetro (10 min) e 120 V per il resto (60 min) o fino a quando la tintura di rilevamento raggiunge il fondo del gel.</li>
		<li>Utilizzare una lama di rasoio fresco e gel coltello per Spalato-Apri il vassoio del gel prefabbricato. Tagliare delicatamente i pettini e il fondo del gel con una lama di rasoio fresco.</li>
		<li>Risospendere il pellet insolubile (P1) in 200 µ l di sark-tampone con 1 x PIC pipettando su e giù.</li>
		<li>Trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa 0,2 µm utilizzando un metodo di trasferimento asciutto su una macchina macchiante (Vedi materiali tavolo).</li>
		<li>Bloccare la membrana in tampone bloccante (BB) senza Tween 20 per 30 min, seguita con BB con 0.05% Tween 20 (BB/T) per 30 min. Dopo il blocco, risciacquare la membrana in TBS/T (0.1% Tween 20) per 5 min rimuovere l'eccesso tampone bloccante.</li>
		<li>Preparare diluizioni di 1:1,000 della pT231 di anticorpi primari, Tau-2 (pan tau), AT8 ed EEA1 in BB/T (0.05% Tween 20).</li>
		<li>Incubare le membrane in soluzione di anticorpo primario durante la notte a 4 ° C con agitazione circolare. Lavare la membrana in TBS/T per un minimo di 3 x 15</li>
		<li>Sonda la membrana con una diluizione di 1: 20,000 di fluorescente-identificato vicino-IR anticorpo secondario in BB/T per 60 min a temperatura ambiente al buio su agitatore. Risciacquare la membrana per 3 x 10 min in TBS/T e 2 x 5 min in TBS.</li>
		<li>Scan la membrana utilizzando una porta a infrarossi imaging sistema alla lunghezza d'onda di eccitazione appropriato (ad es. 700 nm (canale rosso) per tintura infrarosso 680 capra anti-topo IgG (H + L) secondaria e 800 nm (canale verde) per tintura infrarosso 790 asino anti-rabbit IgG (H + L secondaria)).</li>
		<li>Utilizzare il software di imaging per quantificare l'intensità del segnale ed eseguire misurazioni densitometria secondo il produttore &#39; s istruzioni, assicurando auto-sfondo impostazione è impostata su media l'intero sfondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui introduciamo e discutere un protocollo di detersivo-frazionamento passo singolo abbreviato che è applicabile a una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno dall'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica funzionale proteina misfolding saggi e western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 questa metodologia è forse più efficace quando usato per studiare proteinopathies neurodegenerative come l'Alzheimer, ALS, la malattia di Huntington, malattie da prioni e le taupatie vari. Rispetto al protocollo originale di frazionamento sequenziale di cinque fasi, questa procedura a passo singolo può essere completato in un solo giorno e offre risultati molto simili. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Un aspetto importante di questo protocollo è l'utilizzo di sarkosyl come il detersivo di frazionamento. In contrasto con altri detergenti come Triton X-100 o sodio dodecil solfato (SDS), sarkosyl sembra essere adatto a questo compito; in termini di rigore e solubilizzanti forza, è abbastanza forte per solubilizzare la maggior parte delle proteine in modo nativo piegati, preservando il detersivo-insolubilità, la struttura e la funzione degli aggregati proteici rilevanti per la malattia che sono intrinsecamente sensibili alla SDS. 5 , 9 inoltre, a differenza di SDS, sarkosyl rimane solubile a basse temperature e in condizioni di elevata sale.
Un'altra caratteristica fondamentale di questo protocollo è la risospensione del primo pellet sarkosyl-insolubile (P1) dopo il primo di ultracentrifugazione. Questo passaggio di lavaggio permette il pellet iniziale (P1) essere accuratamente estratte e lavato di qualsiasi cross-contaminazione residua proteine solubili o totale omogeneato, che offrano una frazione della proteina pura e ben definito di detersivo-insolubili. Senza il passaggio di risospensione e lavaggio pellet opzionale (P1), proteine solubili residue possono protrarsi nella frazione del detersivo-insolubili, possibilmente confondendo i risultati successivi ed esperimenti (ossia analisi immunoblotting o proteomica).
La natura insolubile e alto peso molecolare di sfide uniche presenti di proteine misfolded patologica aggregati (cioè tau phospho-tau e specie Aβ) verso il loro isolamento e analisi mediante tecniche biochimiche tradizionali. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 a differenza di proteine solubili, insolubili aggrega come amiloidi (Aβ) e i grovigli neurofibrillary tau iperfosforilata (NFTs) non possono essere facilmente purificato dal tessuto post mortem da metodi tradizionali quali immunoprecipitazione o veloce cromatografia liquida di proteine (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 in tal senso, il protocollo abbreviato sarkosyl-frazionamento è una delle tecniche uniche che permette il facile arricchimento e l'isolamento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello entro un lasso relativamente breve periodo di tempo. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Mentre ulteriori passaggi possono essere impiegati per isolare un campione omogeneo, puro di aggregati della proteina, il protocollo di frazionamento sarkosyl consente il facile arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili con relativamente poco impegno di tempo. 5 , 6 a sostegno di questa ipotesi, studi di proteomica del proteoma sarkosyl-insolubile confermano che la stragrande maggioranza delle proteine note di aggregazione-incline patologiche partizione sarkosyl-insolubile frazione-in entrambi tradizionali multi-step 6 , 11 , 21 così come il nostro approccio di romanzo singolo passaggio frazionamento. 5 , 7 , 9 , 10

Malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e le malattie da prioni strettamente correlati sono proteinopathies caratterizzata dall'accumulo graduale di aggregati di detersivo-insolubili della proteina nel cervello con l'accompagnamento conoscitivo declino. 1 , 2 questa caratteristica patologica comune è pensata per svolgere un ruolo centrale nell'eziologia e patofisiologia di queste malattie neurodegenerative. 2 questi aggregati consistono tipicamente di fibre amiloidi polimeriche, che sono composti da unità di proteine misfolded espositrici Croce βripetute-struttura. 1 , 2 , 3 , 4 biochimicamente, aggregati amiloidi sono altamente resistenti alla denaturazione termica o chimica e solubilizzazione,3 che presenta sfide uniche per la loro purificazione, analisi e studiano tramite tecniche biochimiche tradizionali. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 non sorprende, la frazione di detersivo-insolubili della proteina è stato al centro di molte ricerche nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative che coinvolgono l'accumulo di proteine misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
Tecniche di frazionamento biochimici sono stati utilizzati spesso per arricchire la frazione di detersivo-insolubili da omogenati di cervello post mortem. 6 , 12 , 13 , 14 uno dei metodi più comuni comporta l'estrazione sequenza degli omogeneati del tessuto con buffer e detergenti di crescente rigore, seguita da ultracentrifugazione di partizionare le frazioni solubili e insolubili. Un frazionamento sequenziale comunemente usato protocollo6,14 comporta l'omogeneizzazione di campioni di tessuto congelato in un buffer senza detersivo basso contenuto di sale (LS) e i pellet insolubili risultanti quindi vengono estratte in sequenza con buffer contenente sale alto, detergenti non ionici, alta saccarosio, detergenti ionici e infine chaotropes come urea. 6 , 14 un evidente svantaggio di tali protocolli di un frazionamento sequenziale è la notevole di tempo e l'impegno di lavoro necessario per completarle. Omogeneizzazione e ultracentrifugazione, un protocollo tipico cinque fasi frazionamento può richiedere diverse ore o anche giorni per completare. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 inoltre, aggregati di proteine patologiche come molti rimangono insolubili in tutti, ma le più dure condizioni19,20 la maggior parte delle frazioni generate sono di scarso valore. Così, i passaggi di meno-rigorosi frazionamento che utilizzano alte concentrazioni saline e detergenti non ionici sono in gran parte ridondanti.
Gli studi precedenti hanno dimostrato che il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) è un candidato eccellente per un protocollo semplificato passo singolo detergente frazionamento. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 come un detergente denaturante, sarkosyl è sufficientemente rigorosi per solubilizzare la stragrande maggioranza delle proteine in modo nativo piegati nel cervello senza solubilizzanti aggregati di proteine misfolded composti di beta-amiloide (Aβ),6,11 tau fosforilata (pTau),6 TAR DNA-proteina 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 scrapie,23 o U1 piccole ribonucleoproteine nucleari (U1 snRNPs) come U1 - 70K. 5 , 21 , 22 Come sarkosyl è meno rigorose rispetto l'onnipresente anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS), conserva meno robuste forme oligomeriche di aggregati di proteine misfolded che non possono sopportare un trattamento di SDS. 9
In precedenza, abbiamo descritto un protocollo di detersivo-frazionamento abbreviato che ha raggiunto risultati paragonabili alle metodologie di frazionamento sequenziale più laboriose. 5 omettendo i passaggi meno rigorosi di frazionamento, siamo stati in grado di sviluppare un protocollo facile passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da post mortem del cervello umano. 5 questo protocollo dettagliato qui descritto è adatto per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e saggi basati sulla spettrometria di massa proteomica a funzionale misfolding e aggregazione semina. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>protease &amp;amp; phosphatase inhibitor cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>microtip ultrasonicator</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>refrigerated ultracentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ultracentrifuge rotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td></tr><tr><td>4X SDS sample buffer</td><td>Home-made</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP solution, neutral pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>blocking buffer</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>blocking buffer and antibody diluent</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>precast SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel transfer</td></tr></tbody></table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

In questo studio, descriviamo un protocollo abbreviato passo singolo frazionamento per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem. Il detergente ionico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) solubilizza efficacemente nativamente piegati proteine nel tessuto cerebrale permettendo l'arricchimento degli aggregati della proteina detersivo-insolubili da una vasta gamma di proteinopathies neurodegenerative, come Morbo di Alzheimer (annuncio), morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica e malattie da prioni. Controllo umano e tessuti di cervello post mortem AD sono stati omogeneizzati e sedimentato di ultracentrifugazione in presenza di sarkosyl per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili tra cui tau fosforilata patologica, il componente principale di neurofibrillary grovigli in annuncio. Macchiarsi occidentale ha dimostrato la solubilità differenziale aggregati fosforilato-tau e la proteina detergente solubile, presto 1 antigene Endosome (EEA1) in controllo e cervello dell'annuncio. Analisi proteomica ha rivelato anche arricchimento di β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e l'apolipoproteina E (APOE) nelle frazioni sarkosyl-insolubile del cervello dell'annuncio rispetto a quelli di controllo, coerenza con le precedenti strategie di frazionamento del tessuto . Così, questo protocollo semplice arricchimento è ideale per una vasta gamma di applicazioni sperimentali che vanno da Western blotting e funzionale della proteina saggi co-aggregazione a basati sulla spettrometria di massa proteomica.

Il protocollo abbreviato passo singolo sarkosyl-frazionamento è stato utilizzato per arricchire di aggregati proteici di detersivo-insolubili da controllo e cervello post mortem dell'annuncio (Figura 1). Proteine da frazioni TH-S, S1, S2 e P2 sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250. Il passo di risospensione è facoltativo in quanto c'erano livelli inosservabili della proteina nella frazione di S2 (Vedi 1.1.14). L'analisi Western blot (Figura 2A e B) dimostra chiaramente che nel cervello dell'annuncio, gli aggregati di patologico alto peso molecolare tau fosforilata erano sarkosyl-insolubile e molto poco pTau rimase nella frazioni di Sarkosyl-solubili. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 al contrario, la maggior parte dei pTau nel cervello di controllo partizionato in frazione sarkosyl-solubile. 5 , 6 , 10 al contrario, EEA1 tramezzi principalmente nella frazione del S1 in sia il controllo che il cervello dell'annuncio (Figura 2). Qui, EEA1 agisce come un indicatore generale per proteine più native, non patologici che sono intrinsecamente sarkosyl-solubile5. In particolare, c'è un po' meno segnale per EEA1 nella frazione solubile (S1) rispetto alla frazione TH-S, che indica che un pool minori di EEA1 è probabile sarkosyl-insolubile, ancora sotto il limite di rilevazione mediante western blot con questo anticorpo particolare. È altrettanto possibile che la leggera diminuzione nell'intensità del segnale di EEA1 nella frazione solubile (S1) è a causa del legame non specifico di EEA1 ai tubi ultracentrifuga potrebbe anche spiegare la leggera deviazione dai risultati attesi.
Per valutare l'efficacia del protocollo abbreviato passo singolo frazionamento (Figura 3A) contro la più tradizionale metodologia di frazionamento sequenziale multi-step (Figura 3B), i livelli relativi di sarkosyl-insolubile proteina precursore dell'amiloide (APP), tau (MAPT), piccola ribonucleoproteina nucleare U1 - 70K (snRNP70) e l'apolipoproteina E (APOE) sono stati confrontati da privo di etichetta spettrometria totale (MS) basata proteomica attraverso controllo Pool (Ctl), cognitivo lieve (MCI) e AD casi da precedenti studi7,18 (Figura 3). Misurazioni di detersivo-insolubili APP rappresenta efficacemente il peptide Aβ, come tutti i peptidi APP completamente triptico quantificato mappato sulla regione Aβ del residuo APP proteina integrale 6957. Con entrambi i metodi, i livelli di sarkosyl-insolubile di tutte le quattro proteine patologiche registrato una tendenza verso l'alto in MCI e AD casi rispetto ai controlli, coerenti con la forte correlazione del declino conoscitivo e onere patologico. Nel complesso, arricchimento di queste proteine nelle frazioni detersivo-insolubili (P2) erano notevolmente coerenti utilizzando sia il singolo-passaggio18 e di protocolli di frazionamento di multi-step7.
Tuttavia, ci sono lievi differenze tra le due metodologie che possono risultare vantaggiosa o deleteri secondo la natura esatta e obiettivi di un singolo esperimento. I dati di proteomica comparativa riassunti nella Figura 3 possono informare il protocollo da utilizzare a seconda delle applicazioni e parametri sperimentali specifici. Come ci si potrebbe aspettare, c'è un bilanciamento generale tra arricchimento del campione e purezza, con il protocollo di frazionamento semplificata offrendo più i campioni arricchiti con meno perdita di proteine rispetto al metodo multi-step.
Ad esempio, le frazioni insolubili di controllo preparate utilizzando il protocollo semplificato (Figura 3A) presentano leggermente più alti livelli di fondo di malattia-relative proteine rispetto a quelli preparati tramite l'approccio multi-step. Al contrario, la tecnica di frazionamento del passo singolo può essere vantaggiosa per basso-abbondanza proteine come il campione globale le perdite sono notevolmente ridotti. Ad esempio, il relativo arricchimento di APOE sarkosyl-insolubile in casi MCI è significativamente più alta nelle frazioni insolubili preparate tramite il protocollo abbreviato (Figura 3A).
Sebbene entrambi gli approcci sono più che adeguati osservare un aumento significativo in aggregati di proteine misfolded rilevanti per la malattia o patologica, il più numeroso e vasto frazionamento e fasi di lavaggio dell'approccio multi-step possono generare un pulitore e firma di proteomica più specifica. Tuttavia, i nostri dati verificare che il metodo di frazionamento del passo singolo è coerenza con i risultati pubblicati che gli aggregati patologici quali tau grovigli neurofibrillary (NFTs), placche Aβ e prioni scrapie (PrSc) sono insolubili in sarkosyl, mentre loro controparti nativamente piegati rimangono solubili. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Calcolando la quantità relativa di proteina quella partizione nelle frazioni detersivo-insolubili di controllo (n = 3) e AD (n = 3) cervello (tabella 2), solo ~ 10% del pool proteico totale è sarkosyl-insolubile. Quando 5 mg di proteina totale di omogeneato del cervello (TH-S) è frazionato, 10,4% e all'11,3% del proteoma partizioni nella frazione del detersivo-insolubili in controllo e casi di AD, rispettivamente. Anche se la quantità totale di proteina sarkosyl-insolubile arricchita nel cervello dell'annuncio è leggermente superiore di controllo, sono state osservate differenze significative tra i due gruppi (p = 0,703). Questo indica che misfolding e aggregazione non è molto diffuse nel cervello dell'annuncio, ma piuttosto limitata a un sottoinsieme stretto e specifico di proteine quali tau, Aβ e U1 snRNPs. 7 , 21 , 22

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig1.jpg"> 
Figura 1: schema di frazionamento Sarkosyl. (A) A post mortem del cervello umano è stato omogeneizzato in basso tampone salino, dopo il quale sarkosyl e NaCl erano aggiunti a concentrazioni finali di 1% p/v e 0,5 M, rispettivamente e incubate per 15 min sul ghiaccio. Dopo sonicazione, gli omogeneati sono stati frazionati mediante ultracentrifugazione a 180.000 x g per 30 min che offrano il surnatante sarkosyl-solubile (S1) e il pellet sarkosyl-insolubile (P1). Il pellet di P1 (facoltativamente) è stato lavato con sark-buffer e re-sedimentato dall'ultracentrifugazione di permettersi il finale pellet sarkosyl-insolubile (P2). Questa frazione di P2 è stata solubilizzata in buffer di urea per 30 min a temperatura ambiente, seguita da 3 x 5 sonicazione di s con una sonda microtip pulito. (B) proteine (20 µ g) da TH-S, S1, S2 (10 µ l) e P2 frazioni sono stati risolti da SDS-PAGE, fissato per 15 min in Coomassie blu tampone fissativo seguita dalla macchiatura delicata con il buffer colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 durante la notte a temperatura ambiente.<a href="//ecsource.jove. href=""></a href="//ecsource.jove.>com/files/ftp_upload/55835/55835fig1large.jpg"target = blank" &gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig2.jpg"> 
Figura 2: arricchimento della tau fosforilata nella frazione insolubile detergente del cervello dell'annuncio. (A e B) Proteina (40 μg) del totale (TH-S), solubile (S1) e insolubili (P2) frazioni furono cancellate con un anticorpo contro tau fosforilata a treonina 231 (pT231) o AT8 (pSer202, pThr205) per dimostrare l'arricchimento della specie patologica phospho-tau nella frazione insolubile (P2) del cervello dell'annuncio. Nel cervello dell'annuncio, ad alto peso molecolare aggregati tau esclusivamente partizioni nella frazione (P2) del detersivo-insolubili. (C) EEA1 servito come un marcatore di proteina solubile e relativo caricamento controllo per il totale (TH-S) e frazioni solubili (S1) di controllo e di cervello dell'annuncio. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55835/55835fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55835/55835fig3.jpg"> 
Figura 3: analisi di proteomica di patologiche proteine AD utilizza un protocollo di frazionamento passo singolo o multi-step. Livelli relativi delle proteine sarkosyl-insolubile rappresentante APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) e APOE attraverso diverse malattie tra pool controllo, casi MCI e annuncio utilizzando il singolo passaggio (A) o multi-step (B) sarkosyl approccio di frazionamento. Per entrambi i set di dati, livello della proteina è stato valutato dal peptide spettrale partite (PSMs) di questi identificate proteine e normalizzati per impostare il numero massimo di 100. PSMs da casi di controllo, MCI e annuncio (n = 5 ogni) sono stati usati per l'insieme di singolo oggetto dataset. Per l'approccio multi-step, PSMs da replicare due piscine del controllo, casi MCI e annuncio (n = 5 ogni) sono stati analizzati. Barre di errore indicano i valori di media ± s.e.m. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55835/55835fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>soluzione al 10% w/v sarkosyl: sale di sodio 10 g N-lauril-sarcosina per 100 ml di ddH2O (mescolare a RT durante la notte)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt (LS) tampone: 50 mM HEPES pH 7.0, saccarosio 250 mM, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampone Sarkosyl (sark): Buffer di LS + 1% (p/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea tampone (conservare a -20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, urea 8 M, 2% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 tampone di caricamento X SDS: 200 millimetri Tris-HCl pH 6.8, 40% glicerolo, 8% sodio dodecil suflate (SDS), 0,4% bromofenolo (BPB) e 20mm TCEP pH 7.0 in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie fissativo buffer: 40% metanolo, acido acetico 10% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer di colorante Coomassie Brilliant Blue G-250: 25% metanolo, acido acetico al 5%, 0,1% coomassie blue G-250 a ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie decolorare buffer: 25% metanolo, acido acetico al 5% in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X Tris buffered saline (TBS): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl di ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X Tris buffered saline con Tween 20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 ddH in2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X blocco tampone (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% di proteine proprietarie (Vedi elenco dei materiali), 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 X blocco buffer con 0.05% Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl a pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% di proteine proprietarie (Vedi elenco materiali), 0.05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone in ddH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Elenco di buffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Campione</td>
			<td>Campione di volume (µ l)</td>
			<td>Concentrazione (µ g / µ l)</td>
			<td>Proteina totale (µ g)</td>
			<td>Proteina totale media (µ g) e s.e.m.</td>
			<td>% TH-S (5 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.89</td>
			<td>692.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL 2</td>
			<td>70</td>
			<td>7,38</td>
			<td>516.6</td>
			<td>518,7 (±99.63)</td>
			<td>10,4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL 3</td>
			<td>70</td>
			<td>4,96</td>
			<td>347.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANNUNCIO 1</td>
			<td>70</td>
			<td>9.77</td>
			<td>683,9</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD 2</td>
			<td>70</td>
			<td>6,67</td>
			<td>466.9</td>
			<td>567,0 (±63.20)</td>
			<td>11,3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AD 3</td>
			<td>70</td>
			<td>7.86</td>
			<td>550,2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Quantità di proteina in frazioni sarkosyl-insolubile (P2). In media, la percentuale di proteine che suddivide in frazione sarkosyl-insolubile di controllo (n= 3) e AD (n= 3) cervello era 10,4% e 11,3%, rispettivamente. Non c'era differenza statisticamente significativa della quantità di proteine sarkosyl-insolubile da controllo e cervello dell'annuncio, come testimoniano i da dello studente t-test (p = 0,703) e l'errore standard dei valori di media (s.e.m.).

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Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Views.  Emory School of Medicine. Un protocollo di frazionamento abbreviato per l'arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili dal cervello umano post mortem è descritto.

Video: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Medicina

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biologia

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). Collectively, these Nups function to regulate genome organization, gene expression, and nucleocytoplasmic transport (NCT). Recently, defects in NCT and alterations to specific Nups have been identified as early and prominent pathologies in multiple neurodegenerative diseases, including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Alzheimer&#39;s Disease (AD)/Frontotemporal Dementia (FTD), and Huntington&#39;s Disease (HD). Advances in both light and electron microscopy allow for a thorough examination of sub-cellular structures, including the NPC and its Nup constituents, with increased precision and resolution. Of the commonly used techniques, super-resolution structured illumination microscopy (SIM) affords the unparalleled opportunity to study the localization and expression of individual Nups using conventional antibody-based labeling strategies. Isolation of nuclei prior to SIM enables the visualization of individual Nup proteins within the NPC and nucleoplasm in fully and accurately reconstructed 3D space. This protocol describes a procedure for nuclei isolation and SIM to evaluate Nup expression and distribution in human iPSC-derived CNS cells and postmortem tissues.

<meta charset="utf8"></head><body>Microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione e isolamento dei nuclei per l'esame delle alterazioni delle nucleoporine nella neurodegenerazione umana

This protocol describes an optimized workflow for nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy to evaluate individual nucleoporins within the nucleoplasm and NPCs in induced pluripotent stem cell derived neurons and postmortem human tissues.

Microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione e isolamento dei nuclei per l'esame delle alterazioni delle nucleoporine nella neurodegenerazione umana

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

Arricchimento di aggregati proteici di detersivo-insolubili da cervello post mortem umano

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Rilevazione SDS-PAGE/Immunoblot di multimeri Aβ in Human tessuto corticale omogenati utilizzando Antigen-epitopi recupero

Isolamento di oligomeri PrP solubili e insolubili nel cervello umano normale

Nuclei di isolamento dal tessuto neuronale del cervello umano Postmortem

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione e isolamento dei nuclei per l'esame delle alterazioni delle nucleoporine nella neurodegenerazione umana

Microscopia a illuminazione strutturata a super-risoluzione e isolamento dei nuclei per l'esame delle alterazioni delle nucleoporine nella neurodegenerazione umana

Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello

Isolamento delle fibrille amiloidi dall'estratto di tessuto cerebrale