Name: in vitro polymerization of f-actin on early endosomes
Uploaded: 2017-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes at JoVE.com

Supporto è stato ricevuto da Swiss National Science Foundation; il programma svizzero Sinergia; il polacco-Swiss ricerca programma (PSPB-094/2010); il PRN in biologia chimica; e LipidX dall'iniziativa Svizzera SystemsX.ch, valutati da Swiss National Science Foundation (di J. G.). O. M. è stato sostenuto da una borsa di studio a lungo termine dell'EMBO (ALTF-516-2012).

1. soluzioni e preparazioni Nota: tutti i buffer e soluzioni devono essere preparati in bidistillata (dd) H 2 O. Poiché lo stato di idratazione di saccarosio varia, la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio deve essere determinata utilizzando un rifrattometro.
Soluzione tampone fosfato e <ol><li>preparare senza cationi bivalenti (PBS-): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Regolare il pH a 7.4. Sterilizzare in autoclave (1 ciclo a 121 ° C per 15 min) e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di riserva di imidazolo 300mm: 0,204 g di imidazolo in 10 mL di ddH 2 O.Adjust il pH 7.4 a 4 ° C, utilizzando utilizzando un 0.22 μm a sterilizzare HCl. filtro filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.</li>
	Buffer di <li>Prepare omogeneizzazione (HB; preparare circa 100 mL): saccarosio 250 mM in imidazolo di 3 mM. Regolare il pH a 7,4 a 4 ° C, utilizzando un pH-metro. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a 4 ° C. complemento l'HB appena prima dell'uso con un cocktail di inibitori della proteasi alle concentrazioni finali corrispondenti a leupeptina 10 mM, 1 mM pepstatina A e 10 ng/mL aprotinina.</li>
	<li>Per le pendenze di galleggiamento di passaggio, preparare 62%, 39% e 35% di saccarosio soluzioni in imidazolo di 3 mM, pH 7.4, come descritto di seguito. Determinare con precisione la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio usando un rifrattometro.
	<ol><li>Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio di 62% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere agitando 80,4 g di saccarosio in ddH 2 O pre-riscaldato a 35 ° C. aggiungere 1 mL di soluzione madre di imidazolo di 300 mM e riempimento a 100 mL con ddH 2 O. Adjust il pH 7.4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0,22 μm filtrante di porosità e archivio a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio del 35% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere mescolando 40,6 g di saccarosio in ddH 2 O. aggiungere 1 mL di soluzione di riserva di 300 mM imidazolo e riempire a 100 mL con ddH 2 O. regolare il pH a 7,4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0.22 μm filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 50 mL di saccarosio al 39% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Diluire la soluzione di saccarosio 62% con la soluzione di saccarosio del 35%. Conservare a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Sciogliere 3 g di paraformaldeide (PFA) in 100 mL di PBS-pre-warmed a 60 ° C, mentre l'aggiunta di 1 M NaOH goccia a goccia agitando; regolare il pH finale 7.4 usando NaOH. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a -20 ° C. 
	Attenzione: 3% PFA è un reagente tossico.</li>
	<li>Soluzione di riserva di preparare 1 M KCl. Sciogliere 3,73 g di KCl per agitazione in 50 mL di ddH 2 utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm O. filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Soluzione di riserva di preparare 50 X concentrato contenente 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 di ddH 2 parte aliquota O. e negozio a -20 ° C.</li>
	<li>Preparare mezzo di montaggio. Mescolare agitando 2,4 g di poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g di glicerolo. Aggiungere 6 mL di ddH 2 O e lasciare per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) e calore a circa 53 ° C con agitazione occasionale fino a sciolta il PVA.</li>
	<li>Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 min a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e aggiungere 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] ottano (DABCO) per evitare il photobleaching durante la rilevazione della fluorescenza. Vortice per circa 30 s a dissolversi. Aliquotare in tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 ° C.</li>
</ol> 2. Coltura di cellule <ol><li>cellule HeLa di cultura in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale del vitello, 10% non essenziali aminoacidi, 10% L-Glutammina e 1% di penicillina-streptomicina. Mantenerli a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2.</li>
	<li>Transfect le cellule 24 h prima dell'esperimento con GFP-RAB5 10, utilizzando il reagente di transfezione commerciale secondo il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	<li>Quando necessario, preparare le frazioni endosomal e citosol dalle cellule impoverito di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse.</li>
</ol> 3. Endosomal frazione preparazione Nota: il presente protocollo descrive la preparazione semplice di frazioni subcellulari contenente gli endosomi ed altre membrane di luce. Se necessario, le frazioni purificate endosoma possono anche essere usato 11. Preparare 2 piastre di Petri (diametro esterno di 10 cm; 57 cm 2) di cellule confluenti che esprimono GFP-RAB5 come materiale di partenza. Il numero totale di cellule HeLa confluenti in 2 capsule di Petri corrisponde approssimativamente a 2.5 x 10 7 cellule. Quando necessario, gli endosomi può anche essere preparati dalle cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse, sempre che esprimono GFP-RAB5.
 Attenzione: tutti i passaggi del protocollo frazionamento devono essere eseguiti su Ice.
<ol><li>Posizionare le piastre Petri su un di piastra metallico bagnato in un secchio di ghiaccio piatto e lavare immediatamente le cellule due volte con 5 mL di PBS ghiacciata-.</li>
	<li>Rimuovere tutti PBS - dall'ultimo lavaggio e aggiungere 3 mL di PBS ghiacciata-per ogni piatto. Le cellule non dovrebbero asciugarsi durante la manipolazione: se necessario, posizionare il secchio di ghiaccio su una piattaforma a dondolo per coprire adeguatamente le cellule con fluido.</li>
	<li>Rimuovere meccanicamente le cellule in PBS dai piatti Petri utilizzando un poliziotto di gomma flessibile (cioè, ruspa spianatrice di cella fatti in casa). Raschiare le cellule fuori i piatti in primo luogo in un rapido movimento circolare intorno alla parte esterna del piatto, seguito da un movimento verso il basso al centro del piatto. Raschiare delicatamente per ottenere &#34; fogli &#34; di cellule allegate. Trasferire delicatamente le celle utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura per un tubo in polipropilene conico di 15 mL su Ice.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 175 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Delicatamente rimuovere il supernatante (SN) e aggiungere 1-3 mL di HB al pellet. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura, delicatamente Pipettare su e giù una volta per risospendere le cellule.</li>
	<li>Centrifuga per 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicatamente togliere il SN.</li>
	<li>Eseguire omogeneizzazione cell. 
	Nota: Le condizioni dovrebbero essere delicate affinché le membrane plasmatiche delle cellule sono rotte ma gli endosomi rimangono intatti.
	<ol><li>Aggiungi un volume noto di HB con inibitori della proteasi sul pellet ogni cella (circa 100 μL a pellet cellulare). Utilizzando una micropipetta di 1.000-µ l, delicatamente Pipettare su e giù fino a quando le cellule sono risospese. Non introdurre bolle d'aria.</li>
		<li>Preparare una siringa per tubercolina 1 mL con ago 22G pre-risciacquato con HB e privo di aria o bolle.</li>
		<li>Riempire la siringa con la sospensione cellulare relativamente lentamente (per evitare di creare bolle d'aria), posizionare la punta smussata dell'ago contro la parete del tubo ed espellere la sospensione cellulare rapidamente al taglio fuori le membrane plasmatiche delle cellule allegate.</li>
		<li>Prendere una piccola aliquota dell'omogenato (circa 3 µ l) e diluirlo in 50 µ l di HB su un vetrino. Mix e coprire con un vetrino coprioggetti. Ispezionare l'omogenato sotto un microscopio a contrasto di fase con un 20x o obiettivo 40x. 
		Nota: In condizioni ottimali, la maggior parte delle cellule sono rotta, ma i nuclei, che appaiono come grigio scuro e rotondo strutture, non sono ( Figura 1).</li>
		<li>Ripetere il punto 3.7.3 e 3.7.4 fino alla maggior parte delle cellule sono rotti; di solito, sono necessari 3-6 colpi alti e bassi attraverso l'ago. Mantenere una piccola aliquota (10-30 µ l) dell'omogenato per la determinazione della proteina.</li>
	</ol></li> <li>Centrifuga omogeneato per 7 min a 1.355 x g e 4 ° C. 
	Nota: dopo la centrifugazione, il pellet (definito come la pallina nucleare; NP) contiene i nuclei e il surnatante (definito come il surnatante postnuclear; PNS) contiene il citosol e gli organelli rilasciati all'omogeneizzazione e in libera sospensione.</li>
	<li>Raccogliere con cura il PNS. Tenere piccole aliquote (10-30 µ l) del PNS e NP per la determinazione della proteina e scartare il NP.</li>
	<li>Regolare il PNS al 40,6% saccarosio diluendo la soluzione di saccarosio 62% con PNS utilizzando un rapporto di 1:1.1 di PNS:62% di saccarosio. Mescolare delicatamente ma a fondo, senza creare bolle d'aria. Controllare la concentrazione di saccarosio utilizzando il rifrattometro.</li>
	<li>Posto il PNS a 40,6% saccarosio nella parte inferiore di un tubo di ultracentrifugazione. Overlay attentamente con 2,5 mL di soluzione di saccarosio al 35% e riempire la provetta da centrifuga con HB. 
	Nota: Le soluzioni di saccarosio devono essere stratificate affinché le interfacce sono chiaramente visibili.</li>
	<li>Ultracentrifuga i gradienti per 1 h a ̴165, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione lo strato bianco di lipidi sopra il gradiente. Successivamente, raccogliere l'interfaccia contenente gli endosomi, tra la HB e 35% di saccarosio, utilizzando una micropipetta 200 μL con un taglio punta. 
	Nota: Le frazioni di endosomal può essere utilizzate direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni PNS ed endosomal. 
	Nota: Questa concentrazione deve essere almeno 100 µ g/mL. Circa 2,5 x 10 7 cellule sviluppate in 2 capsule di Petri sono necessari per ottenere un PNS con almeno 100 µ g/mL (vedere la nota riportata sopra).</li>
</ol> 4. Cytosol preparazione Nota: preparare 2 capsule di Petri (diametro di 10 cm; 57 cm 2) delle cellule HeLa confluenti come materiale di partenza. Quando necessario, il citosol possono essere preparati anche da cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing una wildtype o la forma mutata della proteina di interesse. Per quanto riguarda il protocollo di frazionamento endosoma, tutti i passaggi devono essere eseguiti su Ice.
<ol><li>Ripetere i passaggi da 3.1-3.8.</li>
	<li>Mettere il PNS in una provetta da centrifuga e ultracentrifuga per 45 min a ̴250, 000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Attentamente rimuovere lo strato bianco sulla parte superiore e raccogliere la SN (frazione di cytosol) senza disturbare il pellet del microsoma. Mantenere un'aliquota della frazione cytosol per la determinazione della proteina. 
	Nota: Il citosol può essere utilizzato direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteine del citosol. 
	Nota: Dovrebbe essere almeno 3 mg/mL.</li>
</ol> 5. Analisi di misurazione endosoma dipendente dalla polimerizzazione dell'actina In Vitro Nota: polimerizzazione dell'actina Endosome-dipendente può essere eseguita utilizzando due approcci alternativi. Nel primo approccio, i materiali sono mescolati in una provetta, fisso e trasferiti a un vetrino coprioggetto e analizzati. Nel secondo approccio, descritto qui, il dosaggio può essere effettuato direttamente nella camera di imaging e può essere risolto e analizzato senza perturbazione meccanica ( Figura 2). In questo secondo approccio, la miscela di analisi non viene trasferita da una provetta di un vetrino coprioggetto e così rimane imperturbata, diminuendo il pericolo delle reti di F-actina fisicamente essere perturbato durante il trasferimento. Inoltre, questo secondo approccio è compatibile con un'analisi time-lapse di polimerizzazione di F-actina. Va notato che nessuna differenza nell'analisi della polimerizzazione di F-actina è stata osservata con entrambi gli approcci. 
Nota: Uso tagliata punte in tutto il protocollo.
<ol><li>In una provetta <ol><li>delicatamente mix ghiacciata purificata GFP-RAB5 endosomi (passaggio 3) con citosol (passaggio 4) con un rapporto di 01:10 (concentrazione proteica) in una provetta conica ghiacciata 1,5 mL. 
		Nota: Un tipico esperimento effettuato con circa 40-50 µ l.</li>
		<li>Regolare la miscela di reazione ghiacciata a concentrazioni finali di 125 mM KCl (utilizzando la soluzione di riserva del KCl 1m), 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (utilizzando il 50 x soluzione di riserva). Quindi, regolare la miscela con gli inibitori di proteasi a concentrazioni finali di 10 mM leupeptina e pepstatina 1 mM A 10 ng/mL aprotinina. Mescolare delicatamente tutti i componenti.</li>
		<li>Mettere la provetta contenente la miscela di reazione a 37 ° C, senza agitarli e incubare per il tempo desiderato. 
		Nota: In genere, ci vorranno circa 3 minuti per rilevare la polimerizzazione dell'actina su endosomes e 30 min per la formazione di una vasta rete.</li>
		<li>Al momento desiderato (cioè, 3 min o 30 min), fermare la reazione ponendo la provetta sul ghiaccio e aggiungere 1/10 (soluzioni) della soluzione PFA 3% preraffreddata.</li>
		<li>Aggiungere 0.3:10 (soluzioni) di 200 unità/mL (~6.6 μM) falloidina coniugata di colorante rosso-arancione per l'actina polimerizzata.</li>
		<li>Posto 12 µ l della miscela sul 12 μL di mezzo di montaggio PVA su un vetrino micro. Mettere un piano in coverslipon vetro 2 18x18 mm.</li>
		<li>Analizzare il campione con microscopia confocal.</li>
	</ol></li> <li>Nella camera di imaging <ol><li>per rendere microscopico imaging chambers, utilizzare plasma pulitore per 1 min per pulire un vetrino coprioggetto rotondo diametro 18 mm e un diametro tondo 35 mm dotato di un fondo di vetro di 20 mm di Petri (0.16-0.19 mm).</li>
		<li>Incubare le superfici pulite con 1% β-caseina per 20 min per ridurre al minimo il legame alle proteine al vetro. Lavare due volte con imidazolo di 3 mM.</li>
		<li>Aggiungi endosoma e citosol, nello stesso dosaggio miscela come nei passaggi 5.1.1 e 5.1.2, in una provetta da 1,5 mL preraffreddato e completano la miscela di analisi con 0,1 μg/μL rodamina-actina.</li>
		<li>Regolare l'indice di rifrazione finale della miscela di 1.375 (26,5% saccarosio) utilizzando la soluzione di saccarosio al 39%. 
		Nota: In genere, il volume stesso viene aggiunto; Tuttavia, questo deve essere empiricamente ri-regolato a seconda della concentrazione di saccarosio della frazione raccolta, determinata utilizzando un refractomer, poiché la concentrazione di saccarosio può variare leggermente da esperimento a esperimento.</li>
		<li>Mettere il composto sul piatto da 35 mm pretrattato (punto 5.2.1) e coprirlo con il coprioggetto 18 mm pretrattato (punto 5.2.1).</li>
		<li>Posizionare la camera a 37 ° C, senza agitarli.</li>
		<li>Analizzare il campione mediante microscopia confocale a fluorescenza.</li>
	</ol></li></ol> 6. Immagine Acl'acquisizione e analisi di actina rete <ol><li>acquisizione immagine <ol><li>acquisire le immagini su un microscopio confocale scansione invertito. 
		Nota: Le impostazioni di acquisizione di immagine sono state ottimizzate per un microscopio confocale scansione invertito con un obiettivo di olio NA 63 X 1,25. Regolare la potenza del laser (solitamente intorno 50%) per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.</li>
	</ol></li> <li>Quantificazione della rete actina <ol><li>analizzare le micrografie fluorescente. Utilizzare il software opensource CellProfiler (v 2.1.1) 12 per misurare la quantità di actina per endosoma (software alternativo può essere utilizzato).
		<ol><li>In primo luogo, identificare gli endosomi come oggetto primario utilizzando il segnale di GFP-RAB5. Quindi, quantificare la F-actina associato con gli endosomi individuali utilizzando la propagazione del segnale dell'actina (rosso-arancio colorante coniugato falloidina) come un oggetto secondario.</li>
			<li>Medio e normalizzare il numero del materiale associato per ogni oggetto per la condizione di controllo.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).</li><li>Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+Maturation,+Transport+and+Functions.">Endosome Maturation, Transport and Functions.</a> Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).</li><li>Puthenveedu, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+sorting+of+recycling+proteins+by+actin-stabilized+endosomal+microdomains.">Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains.</a> Cell. 143 (5), 761-773 (2010).</li><li>Seaman, M. 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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Actina svolge un ruolo cruciale nell'endosoma membrana dinamica4,14. Precedentemente abbiamo segnalato che la polimerizzazione e actina nucleazione verificarsi su early endosomes, formando piccole patch di F-actina o reti. Queste reti di F-actina sono assolutamente necessari per il trasporto di membrana oltre early endosomes lungo la via di degradazione. Interferire in ogni fase di questo processo di nucleazione e polimerizzazione previene endosoma maturazione e ...

Nelle cellule eucariotiche superiori, proteine e lipidi sono interiorizzati in early endosomes dove si verifica l'ordinamento. Alcune proteine e lipidi, che sono destinati ad essere riutilizzati, sono incorporati in tubolare regioni della early endosomes e poi trasportati alla membrana plasmatica o trans-Golgi network (TGN)1,2. Al contrario, altre proteine e lipidi in modo selettivo sono confezionati in regioni della early endosomes che presentano un aspetto multivesicular. Espandere queste regioni e, al momento di distacco dai primi endosomal membrane, finalmente maturo in vescicole di vettore libero endosomal o MVB (ECV/MVB), che sono responsabili di trasporto di merci verso gli endosomi ritardato1, 2.
Actina svolge un ruolo cruciale nel processo di rimodellamento della membrana associato endosomal ordinamento capacità e biogenesi endosoma. Proteina lungo le vie di riciclaggio alla membrana plasmatica o a livello di TGN dipende il retromer complessi e proteine associate. Questo macchinario ordinamento sembra essere accoppiato alla formazione di riciclaggio tubuli tramite interazioni della retromer complessa, con WASP e cicatrice omologo (WASH) complesse e ramificate actina3,4,5 . Al contrario, molecole destinati al degrado, particolarmente attiva segnalazione recettori, sono filtrate in vescicole intraluminal (ILVs) endosomal ordinamento complessi richiesti per trasporto (ESCRT)2,6, 7. Mentre non è noto il ruolo possibile di actina processo di cernita ESCRT-dipendente, F-actina svolge un ruolo importante nella biogenesi di ECV/MVB e nei trasporti oltre early endosomes. In particolare, abbiamo trovato che Annessina A2 Lega regioni colesterolo-arricchita della endosoma precoce e insieme spire1, costituisce la polimerizzazione di F-actina. La formazione della rete ramificata actina osservata su endosomi richiede l'attività di ramificazione della proteina actina-correlate (ARP) 2/3 complesso, così come l'ERM proteina moesina e i leganti l'actina proteina cortactin8,9.
Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette. Questo test è stato utilizzato in precedenza per studiare il ruolo di Annessina A2 nella nucleazione di F-actina e moesin e cortactin nella formazione di endosomal actina reti8,9. Con questo protocollo in vitro , la complessa serie di reazioni che si verificano in endosomi durante la polimerizzazione dell'actina diventano suscettibile di analisi biochimica e molecolare dei passaggi sequenziali del processo, compresa la nucleazione di actina, lineare polimerizzazione, rami e reticolazione.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Acros Organics</td><td>196770010</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>424370025</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiun acetate tetrahydrate</td><td>Fluka</td><td>63047</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10125</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fluka</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck Millipore</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roche</td><td>11017101001</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Roche</td><td>10253286001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roche</td><td>10236624001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Polysciences. Inc</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Actin rhodamine</td><td>Cytoskeleton. Inc</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2522</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millex</td><td>SL6V033RS</td><td></td></tr><tr><td>Round 10 cm dishes for cell culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette</td><td>Assistent</td><td>569/3 40569003</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylen tube</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle 22G Black 30mm</td><td>BD Microlance</td><td>300900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Micro glass slides</td><td>Assistent</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18-mm glass coverslip</td><td>Assistent</td><td>1000/1818</td><td></td></tr><tr><td>SW60 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>344062</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 centrifuge tube</td><td>Beckman coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>200-&amp;mu;L yellow tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>1,000-&amp;mu;L Blue Graduated Tip</td><td>Starlab</td><td>S1111-6801</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL test tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C 311-04-051</td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round coverslip</td><td>Assistent</td><td>1001/18</td><td></td></tr><tr><td>35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)</td><td>In vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td>79729</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>TL-100</td><td></td></tr><tr><td>SW60 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>TLS-55 rotor</td><td>Beckman coulter</td><td>346936</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM-780</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0115</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Homemade</td><td></td><td>Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps</td></tr><tr><td>Refractometer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH Meter 691</td><td>Metrohm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td>NIH, Bethesda MD</td></tr></tbody></table>

in vitro polymerization of f-actin on early endosomes

Molte funzioni di endosoma precoce, particolarmente carico proteico ordinamento e membrana deformazione, dipendono dalla patch di brevi filamenti di F-actina nucleate sulla membrana endosomal. Abbiamo stabilito un dosaggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di genetica e biochimica manipolazioni. Endosomal frazioni vengono preparate dal galleggiamento in pendenze del saccarosio dalle cellule che esprimono la precoce endosomal proteina GFP-RAB5. Citosoliche frazioni sono preparate da batch distinti delle cellule. Endosomal sia citosoliche frazioni possono essere congelate in azoto liquido, se necessario. Nell'analisi, la endosomal e frazioni citosoliche sono mescolate, e la miscela viene incubata a 37 ° C in condizioni appropriate (ad esempio, forza ionica, riducendo l'ambiente). Al momento desiderato, la miscela di reazione è stato risolto, e la F-actina si rivela con falloidina. Polimerizzazione e nucleazione di actina vengono poi analizzati da microscopia di fluorescenza. Qui, segnaliamo che questa analisi può essere usata per studiare il ruolo di fattori che sono coinvolti sia nella nucleazione di actina sulla membrana, o nel successivo allungamento, ramificazione o reticolazione dei filamenti di F-actina.

Per approfondire la formazione di patch di F-actina sulle membrane endosoma precoce, abbiamo seguito il protocollo descritto nella Figura 2. Brevemente, le cellule sono state trasfettate con GFP-RAB5 e quindi gli endosomi precoce sono stati preparati da frazionamento subcellulare. Questi purificato endosomi precoce sono stati incubati con citosol al fine di fornire l'actina stessa, nonché altri fattori probabilmente coinvolti nella reazione. Alla fine del pe...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

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In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Views.  University of Geneva. Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

Ricerca

Biologia

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally expressed molecular guidance cues that bind growth cone receptors and regulate the dynamics and organization of the growth cone cytoskeleton3-6. The main target of these navigational signals is the actin filament meshwork that fills the growth cone periphery and that drives growth cone motility through continual actin polymerization and dynamic remodeling7. Positive or attractive guidance cues induce growth cone turning by stimulating actin filament (F-actin) polymerization in the region of the growth cone periphery that is nearer the source of the attractant cue. This actin polymerization drives local growth cone protrusion, adhesion of the leading margin and axonal elongation toward the attractant.
Actin filament polymerization depends on the availability of sufficient actin monomer and on polymerization nuclei or actin filament barbed ends for the addition of monomer. Actin monomer is abundantly available in chick retinal and dorsal root ganglion (DRG) growth cones. Consequently, polymerization increases rapidly when free F-actin barbed ends become available for monomer addition. This occurs in chick DRG and retinal growth cones via the local activation of the F-actin severing protein actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) in the growth cone region closer to an attractant8-10. This heightened ADF/cofilin activity severs actin filaments to create new F-actin barbed ends for polymerization. The following method demonstrates this mechanism. Total content of F-actin is visualized by staining with fluorescent phalloidin. F-actin barbed ends are visualized by the incorporation of rhodamine-actin within growth cones that are permeabilized with the procedure described in the following, which is adapted from previous studies of other motile cells11, 12. When rhodamine-actin is added at a concentration above the critical concentration for actin monomer addition to barbed ends, rhodamine-actin assembles onto free barbed ends. If the attractive cue is presented in a gradient, such as being released from a micropipette positioned to one side of a growth cone, the incorporation of rhodamine-actin onto F-actin barbed ends will be greater in the growth cone side toward the micropipette10.
Growth cones are small and delicate cell structures. The procedures of permeabilization, rhodamine-actin incorporation, fixation and fluorescence visualization are all carefully done and can be conducted on the stage of an inverted microscope. These methods can be applied to studying local actin polymerization in migrating neurons, other primary tissue cells or cell lines.

A method to visualize and quantify F-actin barbed ends in neuronal growth cones is described. After culturing neurons on glass coverslips, cells are permeabilized with a saponin-containing solution. Then, a short incubation with the saponin buffer containing rhodamine-actin incorporates fluorescent actin onto free actin barbed ends.

L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Neuroscienze

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Biochimica

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Bioingegneria

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces using motor proteins such as myosin II and kinesin to drive key processes such as migration, cytokinesis, adhesion, and mechanosensing. While actin-microtubule interactions are key to the cytoskeleton's versatility and adaptability, an understanding of their interplay with myosin and kinesin activity is still nascent. This work describes how to engineer tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules that undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers. Protocols for fluorescence labeling of the microtubules and actin filaments to most effectively visualize composite restructuring and motion using multi-spectral confocal imaging are also detailed. Finally, the results of data analysis methods that can be used to quantitatively characterize non-equilibrium structure, dynamics, and mechanics are presented. Recreating and investigating this tunable biomimetic platform provides valuable insight into how coupled motor activity, composite mechanics, and filament dynamics can lead to myriad cellular processes from mitosis to polarization to mechano-sensation.

This paper presents protocols for engineering and characterizing tunable three-dimensional composite networks of co-entangled actin filaments and microtubules. Composites undergo active restructuring and ballistic motion, driven by myosin II and kinesin motors, and are tuned by the relative concentrations of actin, microtubules, motor proteins, and passive crosslinkers.

Ricostituzione e caratterizzazione di compositi actina-microtubuli con dinamica e meccanica azionata da motori sintonizzabili

The composite cytoskeleton, comprising interacting networks of semiflexible actin filaments and rigid microtubules, restructures and generates forces ...

Actin Polymerization and Cell Motility

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. Actin monomers polymerize to form a complex network of polarized filaments, the actin cytoskeleton, that plays a crucial role in many cellular processes, including cell motility, division, endocytosis, and metastasis of cancer cells.
Actin cytoskeleton dynamics can produce pushing, pulling, and resistance forces that help the cell to migrate. This is achieved by forming different types of membrane protrusions, depending on the cell type and the extracellular signals. Primarily, cells move by recurrent cycles of protrusion and attachment of the cell front to the substratum, followed by detachment and retraction at their rear end.
The human genome encodes six highly conserved actin proteins&#8212;ACTC1, ACTA1, ACTA2, ACTG1, ACTG2, and ACTB; all expressed in different cell types. Mutations in any of these six actin genes or the genes encoding actin-binding proteins can lead to disease. For example, mutations in the ACTA1 gene can lead to muscle weakness, especially in the respiratory muscles, which can cause breathing difficulties &#8212; a condition called Nemaline Myopathy. Similarly, mutations in the WAS gene, a key regulator of actin filament nucleation, which is important for cell adhesion, chemotaxis, and phagocytosis of immune cells, causes Wiskott Aldrich syndrome in humans.

Polimerizzazione dell'actina e motilità cellulare

Actin is a family of globular proteins that are highly abundant in eukaryotic cells. It makes up approximately 1-5% of total cell protein concentration. ...