Name: precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il dottor Iain Drummond e il dottor Vladimir Korzh per la condivisione di linee transgeniche GFP del rene. Vorremmo anche ringraziare NYITCOM per fornire le risorse necessarie per condurre questo lavoro. Questo studio è stato in parte sostenuto da sovvenzioni: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), e HSCI Pilot Grant (AV).

Questo studio è stato condotto secondo le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali di osteopatia (NYITCOM IACUC). Tutte le operazioni di chirurgia e sperimentazione in vivo sono state eseguite in anestesia tricaina e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza. 1. Ottenere e mantenere embrioni <ol><li> Ottenere gli embrioni attraversando il gheppio di zebrafish fluorescente GFP. NOTA: Alcuni esempi di linee transgeniche con zebrati etichettate con fluorescenza sono elencate nella tabella 1 . </li><li> Tenere gli embrioni a 28,5 ° C in soluzione E3 durante la fecondazione post-24 h. </li><li> Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con una soluzione E3 contenente 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU). NOTA: PTU viene utilizzato perché blocca i passi dipendenti dalla tirosinasi in melanogenesiE quindi impedisce la pigmentazione. Qui, questa soluzione è denominata E3-PTU. </li><li> Sollevare gli embrioni fecondati a 28,5 ° C finché non sono&gt; 6 dpf, in questo momento i reni sono maturati. NOTA: è meglio utilizzare le larve nella finestra 7-9 dpf. </li><li> Utilizzando un microscopio a dissezione fluorescente a ingrandimento 40X e filtri di emissione di fluorescenza verde, selezionare le larve con fluorescenza GFP luminosa del rene. </li></ol> 2. Montaggio del Zebrafish per immagini in tempo reale <ol><li> Se fotofabbrando gli embrioni prima di 3 dpf, rimuova il coro da qualsiasi pesce zebra non inciso prima di montare il pesce zebra per l&#39;imaging. <ol><li> Decoltare manualmente con pinze (preferite) o utilizzare un trattamento chimico con una miscela di proteasi. NOTA: Dechorination consente di ottenere i migliori risultati dell&#39;immagine. </li></ol></li><li> Risciacquare i residui di chorion nel piatto di Petri utilizzando la soluzione E3-PTU e ricaricare il piatto con E3-PTU. </li><li> PrepaRi 1-2% agarosio a basso punto di fusione (LMP) con 0,2 mg / mL soluzione tricina per montare il pesce zebra per fotoablazione del rene e immagini in vivo. <ol><li> Se l&#39;agarosio LMP era già stato preparato in precedenza, riscaldarlo nel forno a microonde per sciogliere. </li></ol></li><li> Una volta preparato l&#39;agarosio LMP, posizionare un piatto di petri di plastica da 35 mm su un microscopio di dissezione. Posizionare una sonda di vetro tirata vicino per orientare correttamente le larve anestetizzate. NOTA: è importante fare questo passo in modo tempestivo e avere tutto in posto, poiché gli embrioni devono essere orientati prima che l&#39;agarosio si solidifichi in circa 1-3 min. </li><li> Prima di trasferire l&#39;embrione all&#39;agarose, assicurarsi che l&#39;agarosio sia fresco ( cioè a circa la temperatura corporea). Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica o vetro per posizionare l&#39;embrione nella soluzione di agarosio-tricina fuso in raffreddamento. NOTA: questo è fatto perché l&#39;agarosio troppo caldo può essere dannoso per l&#39;embrione, portando all&#39;arresto cardiacoO la morte </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, ridisegnare l&#39;embrione nella soluzione agarosa e posizionare l&#39;embrione / larva al centro di un piatto da 35 mm. </li><li> Spargere rapidamente l&#39;agarosio contenente l&#39;embrione / larva per coprire uniformemente il fondo del piatto da 35 mm; Il miglior volume di agarosio da usare è ~ 1-1.1 mL. </li><li> Utilizzare la sonda di vetro per orientare l&#39;embrione nella migliore posizione possibile per fotoablazione e imaging. NOTA: Il filmato 1 mostra l&#39;orientamento migliore dell&#39;embrione / larva per la fotoablazione unilaterale. Questo passo è il più sensibile al tempo e dovrebbe essere eseguito rapidamente prima che l&#39;agarosio inizia a gelare, in quanto qualsiasi tentativo di reorientare il pesce dopo l&#39;inizio della gelificazione è dannoso. <ol><li> Orientare la larva in modo che il segmento di interesse renale sia perpendicolare al percorso del fascio mentre il segmento contralaterale è lontano dal fascio laser (vedi film 1 ). NOTA: Ciò può essere ottenuto girando la larva come mostrato in Movie 1 . </li&gt; </ol></li><li> Lasciare circa 15 minuti per l&#39;agarosio per solidificare. Coprire il piatto di Petri per minimizzare l&#39;evaporazione. Una volta che l&#39;agarosio si è solidificato, l&#39;embrione o la larva sono pronti per la fotoablazione. </li></ol> 3. Ablazione laser <ol><li> Azionare il sistema di imaging confocale. NOTA: Quando si utilizza la piattaforma di imaging a cui si fa riferimento (vedere la tabella dei materiali), le impostazioni consigliate includono l&#39;ingrandimento 40X, una lente d&#39;immersione a 0,8 NA e il primo specchio dicroico impostato per consentire l&#39;illuminazione di 488 e 405 nm. Il rilevamento deve essere eseguito sul canale verde. </li><li> Posizionare il piatto contenente i pesci zebra immobilizzati su uno stadio confocale. NOTA: Questa procedura è ottimizzata per la configurazione verticale usando una lente d&#39;immersione 40-60X. Tuttavia, dovrebbe essere possibile modificare la procedura per un microscopio invertito. </li><li> Nella configurazione verticale, posizionare il piatto di Petri contenente l&#39;embrione in cima a un microscopioScivolare e tenerlo in posizione utilizzando l&#39;argilla modellante ( ad es. Plastilina). Posizionare lo scivolo in vetro con il piatto di Petri sullo stadio del microscopio confocale. </li><li> Aggiungere 3 ml della soluzione di imaging E3-PTU (vedere punto 1.3) con 0,2 mg / mL tricina. NOTA: la soluzione di imaging può anche essere aggiunta immediatamente prima di posizionare la diapositiva sul palco. L&#39;aggiunta di soluzione di imaging deve essere effettuata con molta attenzione per evitare che l&#39;agarosio galleggi fuori dal fondo del piatto. </li><li> Passare alla lente di immersione dell&#39;acqua (40 o 60X). Sollevare lentamente lo stadio, assicurandosi che l&#39;obiettivo sia leggermente angolato per impedire che l&#39;aria venga intrappolata nel percorso del fascio. Una volta che la lente tocca la soluzione ad un angolo, centratela in modo che sia nel campo visivo degli embrioni. </li><li> Trova il segmento di interesse utilizzando la sorgente luminosa a fluorescenza. Posizionare superficialmente il ramo mirato per lesioni per minimizzare la dispersione della luce (vedere il filmato 1 ). NOTA: il successivoT fare uso di software di riferimento (vedere la tabella dei materiali), ma la procedura può essere facilmente adattata ad altre piattaforme. </li><li> Aprire il software. Passare a &quot;Visualizza&quot; | &quot;Acquisition Control&quot; | &quot;C2plus Compact GUI&quot; e impostare &quot;tempo di spostamento dei pixel&quot; a &quot;1.9 μs&quot;, &quot;dimensione del fotogramma&quot; a &quot;512 x 512 pixel&quot; e &quot;dimensioni del pinhole&quot; a &quot;90 μm&quot;. Impostare &quot;405 nm (o 408 nm in alcuni sistemi) l&#39;intensità laser&quot; a zero e &quot;488 intensità laser&quot; a &quot;bassa&quot; (preferibilmente &lt;1%). Regolare il &quot;guadagno&quot; per ottenere una buona gamma dinamica, ma non per saturare il segnale. NOTA: Questi valori non sono critici e vengono utilizzati per la coerenza. Quando viene utilizzato un laser da 405 nm, si verificherà un aumento della fluorescenza GFP. Per evitare la saturazione del segnale durante la fotopolimerizzazione (passo 3.11), il valore del guadagno del segnale dovrebbe essere ridotto sul canale verde. Il guadagno del canale blu può essere lasciato a zero, in quanto non viene utilizzato per sampling. </li><li> Fare clic su &quot;Scan&quot; nell&#39;interfaccia software per eseguire la scansione del rene utilizzando un laser a 488 nm. Trova il segmento di interesse che è perpendicolare al percorso del fascio e che è ben visibile, con buona fluorescenza GFP. Una volta individuata la regione, disegnare una regione di interesse utilizzando una Regione di interesse (ROI) ellittica. <ol><li> Passare a &quot;ROI&quot; | &quot;Disegna il ROI Elliptico&quot;. NOTA: Questo verrà utilizzato per misurare continuamente l&#39;intensità media di GFP durante la fase di foto-bleaching, consentendo la somministrazione di una dose precisa di trattamento laser. </li></ol></li><li> Passare a &quot;Visualizza&quot; | &quot;Comandi di acquisizione&quot; | &quot;Area di scansione di C2plus&quot; e scegliere &quot;Area di scansione di banda&quot;. La maschera rettangolare apparirà all&#39;interno di tale interfaccia. Definire manualmente una finestra di scansione rettangolare utilizzando il cursore ( cioè trascinare, ridimensionare e ruotare la maschera) per coprire il segmento mirato all&#39;ablazione laser. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell&#39;oggettoArea maschera per accettare la selezione. NOTA: verrà scansionata solo la regione selezionata. </li><li> Iniziare la misurazione del tempo durante il monitoraggio del canale verde usando solo il laser da 488 nm per attivare GFP. Assicurarsi che l&#39;intensità del laser 488 sia relativamente bassa (~ 1%). Misurare l&#39;intensità media del GFP nella regione di interesse selezionando &quot;Misura&quot; | &quot;Misurazione del tempo&quot;. Utilizza le schede &quot;Grafico&quot; o &quot;Dati&quot; per monitorare i valori di intensità media all&#39;interno del ROI. NOTA: La velocità di acquisizione è definita dal tempo di dimensione del pixel e dalla dimensione della finestra rettangolare impostata al punto 3.9, ma in generale consente il monitoraggio veloce del segnale (~ 2-10 fotogrammi / s). </li><li> Indurre danni alle cellule renali con il laser violetto (405 nm) aumentando l&#39;intensità al 100% facendo scorrere il controllo &quot;potenza laser&quot; fino a destra. Il laser a 488 nm può rimanere attivo se l&#39;intensità è bassa. <ol><li> Osservare una linea gUtilizzando la scheda &quot;Grafico&quot; oppure i valori numerici dell&#39;intensità GFP utilizzando la scheda &quot;Dati&quot; e attendere che scenda a un livello desiderato, ad esempio il 50% della linea di base (come mostrato in Figura 1 ). NOTA: Un laser da 20 mW è stato utilizzato come parte dell&#39;unità laser di riferimento (vedere la tabella dei materiali ); L&#39;intensità massima può variare tra i sistemi. L&#39;intensità inferiore può essere compensata da un&#39;esposizione più lunga ( cioè usando la percentuale di sbiancamento GFP in percentuale come misura dell&#39;esposizione totale). </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;intensità del GFP all&#39;interno del ROI ellittico (passo 3.8) è scesa a un livello desiderato, diminuire immediatamente l&#39;intensità del laser violetto (405 nm) a &quot;0&quot; spostando il dispositivo di scorrimento &quot;laser power&quot; fino a sinistra in Il pannello di controllo del software. <ol><li> Ottieni una nuova linea di base della fluorescenza GFP. Confermare l&#39;ablazione ottenendo un rapporto di X / Y. NOTA: vedere la Figura1B; Y = intensità media prima dell&#39;ablazione e X = intensità media dopo l&#39;ablazione, utilizzando una media di 4 campioni consecutivi all&#39;interno del ROI. L&#39;esatto rapporto target (50%, 60%, ecc .) Dipende dalla quantità di lesioni che si desidera per un determinato esperimento. </li></ol></li></ol> 4. Microscopia a tempo trascorso con la colorazione dei propidium ioduro <ol><li> Applicare le considerazioni di intervallo di tempo generali (descritte in uno studio precedente 15 ) per visualizzare la colorazione del propidio ioduro come correlato del pregiudizio delle cellule renali dopo la fotoablazione. </li><li> Pre-incubare le larve in 30 μM soluzione di ioduro di propidium (1% DMSO in E3-PTU) per 3 ore prima dell&#39;incollaggio e fotoablazione, come descritto nei passaggi 2 e 3.7, rispettivamente. NOTA: Nell&#39;agarosio o nella soluzione di imaging non è richiesto alcun ioduro propidio aggiuntivo. </li><li> Indurre lesioni renali segmentali, come descritto nei passaggi 3.1-3.12. </li><li> Ottieni i tempi di scadenza dell&#39;immagine, come descriLetto in uno studio precedente 14, utilizzando un laser da 488 nm (GFP) e un laser da 461 nm (Propidium Iodide, PI). NOTA: I due colori sono sovrapposti in pile confocali per correlare la scomparsa di GFP e l&#39;aspetto della colorazione di propidium ioduro. </li><li> Impostare i parametri per ottenere gli stack di immagini a tempo trascorso come segue: spessore della fetta virtuale = 4 μm, intervallo z-stack = 2 μm, tempo di dimensione dei pixel = 1,9 μs, dimensioni dell&#39;immagine = 512 x 512 e media = 2. NOTA: Questi parametri permettono di registrare continuamente fino a 4 larve da 10 a 15 minuti e assicurare che esista una minima fotopolimerizzazione del campione. </li><li> Utilizzare il software di imaging compatibile con il formato di file di registrazione per visualizzare e analizzare i dati. </li></ol>

<ol>
	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Va notato che la potenza laser totale varia tra i sistemi. Tuttavia, l&#39;utilizzo di percentuale di fotopolimerizzazione GFP consente una lettura dell&#39;energia totale erogata al rene fluorescente, indipendente dalla variazione della potenza laser e compensata dalla lunghezza dell&#39;esposizione. Tenga presente, tuttavia, che la risposta di diversi tessuti a questo metodo di fotoablazione varia. Anche durante la maturazione del rene, è significativamente più difficile ottenere una riduzione del 50% della fluoresc...

La lesione acuta del rene (AKI) 1 , 2 , che può essere chiamata anche insufficienza renale acuta, è ampiamente definita come improvvisa compromissione della funzione renale 3 . Mentre il livello di comprensione di questa condizione è stato notevolmente migliorato nel corso degli anni, i tassi di morbilità e mortalità sono rimasti alti 1 , 2 . Il trattamento attuale per questa condizione è per lo più sostenuto, dato che i risultati di più studi clinici della terapia farmacologica sono stati negativi 4 , 5 . Il rene è unico in quanto ha la capacità di ripararsi. Pertanto, la terapia di supporto dopo una diagnosi precoce dell&#39;AKI è il modo migliore per limitare la morbilità 6 . Tuttavia, è difficile rilevare AKI presto, e il tasso di mortalità è un 50-80% incredibile per coloro che necessitano di dialisi 5. Con la capacità dei reni di ripararsi e la mancanza di opzioni di trattamento per questa condizione, è importante sviluppare metodi per migliorare questo processo di rigenerazione dei nefroni. Sono stati utilizzati molti modelli diversi per la ricerca AKI che include diversi agenti di lesioni e modelli animali. In termini di agenti di danno renale, la gentamicina antibiotica aminoglicosidica è stata utilizzata come agente nefrotossico che porta all&#39;AKI 7 , 8 . Tuttavia, diversi gruppi hanno riscontrato che il trattamento con gentamicina è letale per l&#39;embrione zebrafish 9 . Provoca danni tubolari troppo gravi per il recupero degli embrioni, rendendo difficile lo studio della rigenerazione senza alcun tipo di intervento. I modelli mammiferi, come il topo e il topo, sono considerati anche preziosi, ma devono affrontare molte limitazioni durante lo studio dell&#39;AK. Forse il principale svantaggio dei modelli di roditori è la difficoltà di visuaDimagrendo il rene del roditore e determinando così i precisi processi spatiotemporali che portano alla morte epiteliale e alla riparazione. Johnson et al. Hanno riportato una tecnica basata sull&#39;ablazione laser per indurre lesioni acute del rene negli zebrafish embrionali e larvali 9 . Usavano l&#39;ablazione laser pulsata per danneggiare il rene dopo un&#39;iniezione intramuscolare con coniugati di dextran. La fluorescenza dei coniugati di dextran consente la visualizzazione dei danni e la rigenerazione nell&#39;epitelio tubulare 9 . Questo modello supera le due limitazioni di cui sopra, ma non consente livelli di lesioni graduati e è difficile da svolgere su grandi gruppi arbitrari di cellule. Il nuovo modello di zebrafish basato sull&#39;ablazione laser di AKI qui descritto affronta tutte le limitazioni di cui sopra. Il rene pronebrofico in zebrafish larvale è un organo maturo e funzionante che contiene segmenti analoghi ai mammiferiPhron, inclusi un tubo glomerulus, prossimale e distale e un condotto di raccolta 10 . Le larve di zebrafish sono anche otticamente trasparenti, rendendo possibile osservare il rene attraverso tecniche di fluorescenza. Così, i pesci zebra sono un prezioso modello in vivo di AKI e il rene pronoferico larvale (5-12 giorni dopo la fecondazione (dpf)) può essere utilizzato per studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti in lesioni renali e riparazioni. Questo documento presenta un metodo attraverso il quale possono essere fotoablati specifici segmenti nefronici che esprimono GFP (Green Fluorescent Protein), utilizzando una luce laser violetta (405 nm) a basso consumo energetico (rispetto ad un impulso laser). La fluorescenza GFP consente di targetizzare un gruppo di cellule, rendendo visibili le modifiche attraverso l&#39;osservazione della fotopolimerizzazione di GFP. Inoltre, GFP (assorbendo la luce viola) serve come un dispersore energetico per potenziare il danno nelle cellule renali che esprimono GFP. Time-lapse microsLa copia può quindi essere utilizzata per studiare il processo di riparazione. Gli studi hanno trovato la proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e la metaplasia delle cellule 11 , 12 , 13 a tutti i processi potenziali che possono svolgere un ruolo importante nella riparazione del rene. Tuttavia, l&#39;importanza relativa di questi processi e i dettagli della loro interazione è stata difficile da scoprire a causa delle limitazioni dei modelli esistenti di AKI. Utilizzando questo nuovo approccio, è stato possibile dimostrare che la migrazione delle cellule gioca un ruolo centrale nella riparazione del rene dopo lesioni acute 14 .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

L&#39;infortunio acuto del rene (AKI) è una condizione medica comune con un elevato tasso di mortalità. Con le abilità di riparazione del rene, è possibile ripristinare adeguata funzione renale dopo un trattamento di supporto. Tuttavia, è necessaria una migliore comprensione del modo in cui la morte e la riparazione della nefronica si verificano a livello cellulare per ridurre al minimo la morte cellulare e per migliorare il processo rigenerativo. Il pronephros di zebrafish è un buon modello di sistema per realizzare questo obiettivo perché contiene segmenti anatomici simili al nefrone mammifero. In precedenza, il modello più comune per studiare le lesioni renali nei pesci era il modello farmacologico di gentamicina. Tuttavia, questo modello non consente un preciso controllo spatiotemporale delle lesioni e quindi è difficile studiare i processi cellulari e molecolari coinvolti nella riparazione del rene. Per ovviare a questa limitazione, questo lavoro presenta un metodo attraverso il quale, in contrasto con l&#39;approccio gentamicinico, una specifica Proteina Fuorescente Verde (GFP) -exIl segmento del nefrone premendo può essere fotografato mediante una luce laser violetta (405 nm). Questo nuovo modello di AKI offre molti vantaggi rispetto agli altri metodi di lesioni epiteliali. I suoi principali vantaggi sono la capacità di &quot;comporre&quot; il livello di lesioni e il preciso controllo spatiotemporale nel robusto modello animale in vivo . Questo nuovo metodo ha il potenziale per aumentare in modo significativo il livello di comprensione dei meccanismi di lesioni renali e di riparazione.

Si prega di notare che questo protocollo è stato utilizzato con una serie di linee transgeniche GFP renali, tra cui ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). I risultati di esempio mostrati qui sono stati ottenuti utilizzando la linea ET (krt8: EGFP) sqet11-9. La figura 1 mostra il protocollo di fotoablation di esempio. L&#39;intensità media GFP viene monitorata...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l&#39;induzione dell&#39;ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  NYITCOM.  Questo lavoro presenta un nuovo modello in vivo di lesioni segmentali del rene utilizzando gengive transgenici GFP reni. Il modello permette l'induzione dell'ablazione mirata delle cellule epiteliali del rene per mostrare i meccanismi cellulari di lesioni nefroniche e di riparazione. 

Video: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanical Injury Vessel in embrioni di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologia

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Microiniezione endovenosa di nefrotossine nell'embrione di zebrafish: una tecnica per rilasciare agenti nefrotossici nel flusso sanguigno dell'embrione di zebrafish

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...