Name: mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
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1. Preparazione del lavoro Aptamero l&#39;Archivio <ol><li> Seguire le istruzioni del produttore e sciogliere il oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la sequenza di riferimento 18) in acqua, raggiungendo una concentrazione finale di 100 micron. </li><li> Preparare la soluzione aptameri di lavoro diluendo lo stock oligonucleotide a 200 Nm con tampone assorbente (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2; 0,01% Tween20). </li><li> Incubare la miscela per 2 minuti a 90 ° C, lasciate raffreddare il campione immediatamente sul ghiaccio, e utilizzare il campione a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparazione del Ligand diluizione Series <ol><li> Per ogni ligando (adenosina trifosfato (ATP), adenosina difosfato (ADP), adenosina monofosfato (AMP), adenina, guanosintrifosfato (GTP), citosintrifosfato (CTP), deossiadenosina trifosfato (dATP), e S-adenosilmetionina (SAM) ; 10 mM magazzino ciascuno), preparare un diluti di serie 16-stepsu in 200 provette micro microlitri. NOTA: centrifugazione delle scorte ligando per 5 minuti a 14000 g può aiutare a rimuovere gli aggregati. Basso volume, si raccomanda provette vincolante basso per evitare l&#39;assorbimento delle molecole alle pareti del tubo. </li><li> Iniziare con una concentrazione massima di almeno 50 volte superiore all&#39;affinità stimata e ridurre la concentrazione del ligando del 50% in ogni fase di diluizione. NOTA: Lo strumento concentrazione finder implementato nel software di controllo simula dati vincolanti e aiuta a trovare l&#39;intervallo di concentrazione giusta per la serie di diluizioni. </li><li> Riempire 20 ml di legante magazzino (10 mm) in tubo 1. Aggiungere 10 ml di tampone di legame aptameri in tubi di reazione micro 2-16. </li><li> Trasferimento 10 ml di tubo da 1 a tubo 2 e miscelare correttamente pipettando su e giù parecchie volte. Trasferire 10 microlitri al tubo successivo e ripetere questa diluizione per i rimanenti tubi. </li><li> Eliminare l&#39;eccesso di 10 ml dall&#39;ultima provetta. Evitare qualsiasi Beffetti diluitivi Uffer. Il tampone nella provetta 1 e in tubi 2-16 deve essere identica. </li></ol> 3. Preparazione della miscela di reazione finale <ol><li> Preparare le singole reazioni di legame con un volume di 20 microlitri (10 ml di soluzione di lavoro aptamer + 10 ml di rispettiva diluizione ligando) per minimizzare errori di pipettamento. Un volume di soli 4 microlitri è suf fi ciente per il riempimento capillare. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro 200 nM aptameri a 10 microlitri di ogni diluizione ligando e miscelare correttamente pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Incubare i campioni per 5 min a temperatura ambiente e riempire i campioni nei capillari standard, immergendo i capillari nel campione. tempi di incubazione più lunghi possono essere necessari per alcune interazioni; Tuttavia, 5 min è adeguato per la maggior parte. Selezionare i capillari solo sui lati, NON sulla parte centrale, dove viene effettuata la misurazione ottica. </li><li> Posizionare i capillari si aVassoio capillare e ed avviare il dispositivo MST. </li></ol> 4. Avvio del dispositivo MST NOTA: Il dispositivo fornisce due pacchetti software preinstallati, l &#39; &quot;software per la messa a punto tecnica delle condizioni sperimentali e il controllo&#39; &#39;analisi&quot;&#39; software per l&#39;interpretazione dei dati prodotti. <ol><li> Prima di effettuare il vassoio capillare nel dispositivo MST, avviare il software di controllo e regolare la temperatura complessiva desiderata selezionando &#39;&#39; attivare il controllo manuale della temperatura &quot;del &#39;&#39; controllo della temperatura&quot; menu a discesa. Regolare la temperatura a 25 ° C in questo modo. NOTA: Gli strumenti MST possono essere a temperatura controllati attraverso 22 a 45 ° C. </li><li> Attendere che la temperatura per raggiungere il livello previsto e quindi inserire il vassoio capillare nel dispositivo MST. </li><li> Impostare il canale LED per &#39;&#39; rosso &quot;per le tinture Cy5 e regolare la potenza del LED per ottenere un fl uorescence segnale 300 a 1000 unità di fluorescenza del dispositivo MST con un sensore standard. potere LED 25% è utilizzato in questo studio. NOTA: 6.000 a 18.000 unità di fluorescenza sono raccomandati per il MST con un sensore ad alta sensibilità. </li></ol> 5. capillare Scan <ol><li> Effettuare una scansione capillare per controllare diversi aspetti di qualità del campione, scegliendo la posizione capillare sul software &quot;di controllo&quot; e cliccando su &quot;avviare la scansione cap&quot; prima della misurazione MST. </li><li> Ispezionare la scansione capillare per la fluorescenza valorizzazione / tempra e gli effetti che attaccano (a forma di U o appiattita picchi) nel software. NOTA: Maggiori dettagli sul rilevamento e la gestione della fluorescenza e gli effetti che attaccano possono essere trovati nella discussione. </li></ol> 6. Misura MST NOTA: Prima di iniziare la misura MST, assicurarsi di escludere attaccare effetti, valorizzazione / effetti tempra, oerrori di pipettamento, e garantire che la scansione capillare indica che il segnale fluorescenza è suf fi ciente. Per maggiori dettagli, vedere la discussione. <ol><li> Assegnare le concentrazioni di ligando della serie di diluizione alla rispettiva posizione capillare nel software &#39;&#39; di controllo &quot;consideri la fase di diluizione della miscelazione del aptamer e ligando. (1: 1). </li><li> Inserisci la più alta concentrazione di ligando (5 mm) per capillare # 1, selezionare il tipo di diluizione corretto (qui, 1: 1), cliccare sulla massima concentrazione, e utilizzare la funzione di trascinamento per assegnare automaticamente le restanti concentrazioni in capillari # 2 16. La concentrazione più bassa è 152,6 nM. </li><li> Inserire la concentrazione del aptamer uorescenti fl (qui, 100 nM) nella rispettiva sezione del software di controllo. </li><li> Utilizzare le impostazioni predefinite, che rilevano la fluorescenza fl per 5 secondi, registrare il MST per 30 secondi, e registrare la fluorescenza per altri 5 secondi dopo l&#39;inattivazione del t laser<html> o monitorare la diffusione posteriore delle molecole. </li><li> Regolare la potenza del laser al 20% nella rispettiva sezione del software di controllo. NOTA: per ricevere il miglior rapporto segnale-rumore e per evitare effetti non specifici, si consiglia una potenza laser di 20-40%. In casi specifici, una potenza del laser più elevato può essere richiesto per ottenere una buona separazione delle molecole non legati e legati. </li><li> Salvare l&#39;esperimento dopo aver selezionato la cartella di destinazione e avviare la misura MST premendo il pulsante &#39;&#39; misura di inizio MST &quot;. NOTA: Il file .ntp verrà generato nella cartella di destinazione. Usando questa configurazione, una misurazione dura 10-15 minuti. </li><li> Ripetere la procedura sperimentale almeno due volte per una determinazione più accurata del valore EC 50. NOTA: Al fine di testare la riproducibilità tecnica, gli stessi capillari possono essere acquisiti più volte (ripete tecnici). </li></ol> 7. Analisi dei dati MST nt &quot;&gt; NOTA: Il software di analisi permette l&#39;analisi dei dati sul fl y durante la misurazione Il software di analisi traccia le tracce del tempo MST e dei cambiamenti nel normalizzato fluorescenza (F norma) contro la concentrazione del ligando 37.. <ol><li> Avviare il software di analisi MST (Analisi MO.Affinity) e caricare il file .ntp dalla cartella di destinazione. Selezionare &quot;MST&quot; come tipo di analisi nel menu di selezione dei dati. NOTA: Nel caso di effetti di fluorescenza ligando-dipendente, la fluorescenza iniziale può essere scelto per l&#39;analisi. </li><li> Aggiungere la rispettiva corsa (s) tecnico o biologico per una nuova analisi con il drag-and-drop o premendo il tasto &quot;+&quot; al di sotto del rispettivo periodo sperimentale. </li><li> Premere il pulsante di informazioni al di sotto del rispettivo periodo di sperimentazione per ottenere informazioni sulle proprietà di questo esperimento, tracce MST, scansione capillare, forma capillare, fluorescenza iniziale e tasso di sbiancamento. NOTA: I dati grezzi possono alcosì da ispezionare in fasi successive dell&#39;analisi. </li><li> Visivamente le tracce MST per l&#39;aggregazione e la precipitazione effetti, visibile come urti e picchi. NOTA: Per ulteriori informazioni sul rilevamento e la gestione degli effetti di aggregazione, leggere la discussione. </li><li> Ispezionare visivamente la scansione capillare e la capillare forma di sovrapposizione per gli effetti di adsorbimento, visibile come picchi o appiattite a forma di U. Ispezionare visivamente la scansione capillare e la fluorescenza iniziale per gli effetti di fluorescenza. Ispezionare visivamente il tasso sbiancante per photobleaching effetti. </li><li> Passare alla modalità dose-risposta e modificare l&#39;impostazione di analisi in modalità &quot;esperto&quot; premendo il tasto corrispondente. Selezionare &quot;T-Jump&quot;, come la strategia di valutazione MST. </li><li> Selezionare il modello di &quot;Hill&quot; per la curva fi tting. saranno automaticamente calcolati i parametri vincolanti. Normalizzare i dati scegliendo il rispettivo tipo di normalizzazione nel menu &quot;confrontare i risultati&quot;. esportare ili dati sia come un file .xls o .pdf. Nota: La tabella sotto il grafico legame riassume i parametri vincolanti calcolati. </li></ol>

CE e TS sono dipendenti di 2bind GmbH, che fornisce servizi di analisi biofisici. spese di pubblicazione di questo video-articolo sono pagati dal 2bind GmbH.

Controlli di qualità: Aspecifico sticking / adsorbimento di materiale campione a superfici, così come gli effetti di aggregazione, hanno una influenza notevole sulla qualità dei dati di affinità. Tuttavia, solo un paio di tecnologie state-of-the-art offrono opzioni precise e rapide per monitorare ed evitare questi effetti. MST offre controlli di qualità integrati che consentono di rilevare e aiutano a superare questi problemi, consentendo l&#39;ottimizzazione graduale della configurazione ...

L&#39;interazione tra le molecole è la base della natura. Quindi, gli scienziati in molti campi della ricerca di base e applicata cercano di capire i principi fondamentali delle interazioni molecolari di diversi tipi. MicroScale termoforesi (MST) consente agli scienziati di effettuare il veloce, preciso, caratterizzazione economicamente efficiente e di qualità controllata delle interazioni molecolari in soluzione, con una scelta di buffer. Ci sono già più di 1.000 pubblicazioni utilizzando MST, a partire dal 2016 da solo, che descrive i diversi tipi di analisi, tra cui proiezioni di libreria, convalide di eventi, analisi della concorrenza, e gli esperimenti di legame con partner multipli vincolanti 1-8. In generale, MST consente lo studio dei parametri vincolanti classici, come affinità di legame (pM a mM), stechiometria e termodinamica, di qualsiasi tipo di interazione molecolare. Un grande vantaggio di MST è la capacità di studiare eventi di legame indipendenti dalla dimensione dei partner di interazione. anche Chalinterazioni lenging tra piccole aptameri di acidi nucleici (15-30 nt) e target, quali piccole molecole, farmaci, antibiotici, o metaboliti possono essere quantificati. Le attuali tecnologie state-of-the-art di caratterizzare le interazioni aptamer bersaglio sono o laboratorio-intenso e molto complesso o non riescono a quantificare aptameri-piccola molecola Interazioni 9,10. Risonanza plasmonica di superficie (SPR) a base di test di 11,12 e approcci calorimetrica veramente libero-label, come Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) 13-15, eluizione isocratica 16, equilibrio filtrazione 17,18, in linea di sondaggio 19, gel- spostare saggi, stopped- flusso fluorescenza spettroscopia 20,21, anisotropia di fluorescenza (FA) 22,23, singola molecola fluorescenza di imaging 24,25, e Bio-strato di interferometria (BLI) 26 siano anche imprecisi o incompatibile con la molecola aptameri-piccole interazioni. Altro Principal temi di questi metodi sono bassa sensibilità, elevato consumo di campione, l&#39;immobilizzazione, limitazioni di trasporto di massa su superfici e / o limitazioni del buffer. Solo pochi di queste tecnologie forniscono controlli integrati per aggregazione e di adsorbimento effetti. MST rappresenta un potente strumento per gli scienziati di superare questa limitazione per studiare le interazioni tra aptameri e piccole molecole 27-29, nonché altri obiettivi come le proteine 30-33. La tecnologia si basa sul movimento delle molecole attraverso gradienti di temperatura. Questo movimento diretto, chiamato &quot;termoforesi,&quot; dipende dalle dimensioni, carica, e shell idratazione della molecola 34,35. Il legame di un ligando alla molecola modificherà direttamente almeno uno di questi parametri, con un conseguente mobilità thermophoretic cambiato. Ligandi con le piccole dimensioni non possono avere un notevole impatto in termini di cambio formato dal non associata alla stato legato, ma possono avere dr<html> effetti Amatic sul guscio di idratazione e / o carica. I cambiamenti nel movimento delle molecole thermophoretic dopo interazioni con il partner legante consente la quantificazione dei parametri vincolanti di base 2,7,34,36,37. Come illustrato in figura 1A, il dispositivo MST costituito da un laser a infrarossi focalizzato sul campione entro i capillari di vetro con la stessa ottica come per la rilevazione della fluorescenza. Il movimento thermophoretic delle proteine tramite fluorescenza intrinseca di triptofani 6 o di un 3,8 socio interazione fluorescente può essere monitorato mentre il laser stabilisce un gradiente di temperatura (DT di 2-6 ° C). La differenza di temperatura risultante nello spazio, DT, porta alla deplezione o accumulo di molecole nella zona di temperatura elevata, che può essere quantificato dal Soret coefficiente (S T): g &quot;/&gt; c rappresenta caldo la concentrazione nella regione riscaldata, ec freddo è la concentrazione nella regione fredda iniziale. Come mostrato nella Figura 1B, un tipico esperimento MST ottiene un profilo di movimento MST (traccia temporale), costituito da diverse fasi, che possono essere separati dai rispettivi tempi. La fluorescenza iniziale è misurata nei primi 5 s in assenza del gradiente di temperatura per definire la precisione di fluorescenza iniziale e per controllare photobleaching o photoenhancement. Il salto di temperatura (T-Jump) rappresenta la fase in cui le variazioni di fluorescenza prima del movimento thermophoretic. Questa diminuzione iniziale della fluorescenza dipende da sbalzi termici-dipendente di fl uorophore resa quantica. La fase termoforesi segue, in cui diminuisce fluorescenza (o aumenta) dovuti al movimento thermophoretic delle molecole fino alla distribuzione dello stato stazionario viene raggiunto.Il tjump retromarcia e retrodiffusione concomitante di molecole fl uorescenti possono essere osservati come indicato in Figura 1B dopo il laser è spento. Per accedere ai parametri di base vincolanti, diversi rapporti molari dei partner di interazione sono analizzati e confrontati. Tipicamente, 16 differenti rapporti sono studiati in un esperimento MST, considerando che la molecola visibile ottica viene mantenuta costante ed è fornita con una quantità crescente di ligando non marcato. L&#39;interazione tra i due partner di legame induce cambiamenti nella termoforesi, e quindi nella fluorescenza normalizzato, F norma, che viene calcolato come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F calda e fredda F rappresentano una media di fl intensità fluorescenza a de fi nite momenti delle tracce MST. Affinità di legame (K D o valori di EC 50) possono essere calcolati curve montaggio (Figura 1C). Nel complesso, MST è un potente strumento per studiare le interazioni molecolari di qualsiasi tipo. Questo manoscritto offre un protocollo per caratterizzare l&#39;interazione sfida tra la piccola molecola di adenosina trifosfato (ATP; 0,5 kDa) e il 25-nt breve ssDNA aptameri DH25.42 (7,9 kDa). Nel corso del manoscritto, il sito di legame del aptamer sulla molecola ATP viene mappato verso il gruppo adenina dell&#39;ATP.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

In questo studio, MST è stato applicato per caratterizzare il sito di legame del DNA aptamer DH25.42 18 ATP. A differenza di altri studi che caratterizzano l&#39;interazione di ATP o ATP-mimando piccole molecole con proteine marcate casualmente con uno o più fluorofori 38-40, questo studio include una etichetta versione del aptamer 7,9 kDa ssDNA con una molecola Cy5 sull&#39;estremità 5&#39; . Diversi derivati ​​ATP e molecole correlate, che differiscono da A...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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10.5K Views.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Acido ftalico Ester-associazione DNA aptamero selezione, caratterizzazione e applicazione di un Aptasensor elettrochimica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Ricerca

Chimica

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Biochimica

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Un saggio di legame proteico della superficie cellulare basato sulla citometria a flusso per valutare la selettività e la specificità di un aptamero antitumorale

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Ricerca sul cancro

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

Primer-Free Selezione aptamero utilizzando una libreria di DNA casuale

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biologia

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Bioingegneria

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Calorimetria differenziale a scansione per studiare l'interazione tra aptamero e ligando termolabile del DNA

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...