Name: automated quantification and analysis of cell counting procedures using imagej plugins
Uploaded: 2016-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins at JoVE.com

This work was supported by the Canadian Institute of Health Research to CP (OR 142730 and OR 89931). We would like to thank Jelena Brkic for her initial idea of binary particle analysis in ImageJ.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell&#39;immagine, cioè quanto strettamente l&#39;immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È quindi della massima importanza per seguire microscopio e protocolli di calibrazione software associati nel miglior modo possibile. Questo include limitare il rumore di fondo, riducendo le particelle indesiderate, catturando luminose e uniformemente immagini in-focus, e il salvataggio in formati di file senza perdita come TIFF. Così, entrambi i plugin sono in grado di produrre risultati errati se questi requisiti non sono soddisfatti. E &#39;quindi sempre buona norma doppi conteggi delle cellule di controllo per determinare se corrispondono aspettative visive, quando in dopt. Se, infatti, i risultati non corrispondono, confrontando l&#39;immagine originale con l&#39;immagine binaria può aiutare a chiarire la questione (10.4 nota). In alcuni casi, le immagini del test di migrazione più scure possono contenere grandi aree che sono state contate a causa di valori di pixel che rientrano nei limiti di soglia colore. In generale, usando un&#39;immagine flatfield rimuoverà l&#39;oscurità e couperose e prevenire conta più indesiderati dovuti a irregolarità cromatiche. Alla luce di questi problemi possibili e relativamente comuni, è importante seguire le linee guida integrità dell&#39;immagine standard, come quelli proposti dal Nature Publishing Group e altri 13. Per mantenere i conteggi coerente, alcuna regolazione un&#39;immagine dovrebbe essere applicato anche per tutti gli altri. Questo include ma non si limita al contrasto, la saturazione, la luminosità, il guadagno, filtri come la media e la nitidezza, e filtri colorati. Regolazione della gamma dovrebbe essere evitato in quanto si applica modifica in modo non lineare di colore dei pixel e così può influenzare ogni immagine diversaly 14. Quando si applica un tempo di esposizione comune per le immagini con poche cellule (&lt;1.000), questo può portare a sovraesposizione e perdita di immagine fedeltà. Al contrario, una membrana con migliaia di cellule può richiedere tempi di esposizione più elevati per evitare la sottoesposizione. Di conseguenza, è buona norma regolare le immagini il meno possibile, e solo quando necessario, per mantenere la massima fedeltà dell&#39;immagine ottenibile. un&#39;immagine di alta fedeltà Anche con, i conteggi delle particelle veri possono essere gravemente distorta da particelle indesiderate. Quando si utilizza calcolatore cellulare Concentrazione, se un campione contiene quantità significative di detriti cellulari, in particolare di aree simili a quelle di cellule sospese, ciò può inclinare il risultato. In alcuni casi, questo potrebbe impedire l&#39;analisi automatizzata se i detriti non può essere minimizzata. Analogamente, membrane dosaggio migrazione che contengono livelli elevati di colorazione di fondo di colore simile al macchiati cellule o cellule non rimossi dal retro della membrana, probabilmente produrrà irisultati nAccuratezza. Queste particelle indesiderate possono normalmente essere rimossi in alcuni modi: aumentando la luminosità o l&#39;esposizione origine ora di luce, modificando la soglia colore per essere più severi, o rimosso manualmente tramite &#39;immagine aperta con conta&#39; (10.4). È importante notare che questo protocollo produce l&#39;ottima qualità dell&#39;immagine richiesta per CCC e TC per mantenere la precisione. Tuttavia, TC è in grado di contare le immagini di qualità notevolmente inferiore, ingrandimenti variabili, o diverse macchie di colore, in genere solo richiede più tempo speso per regolazioni manuali (10.4). Durante la calibrazione di qualsiasi immagine membrane test di migrazione è importante prendere in considerazione la risoluzione dell&#39;immagine e la relativa dimensione delle celle. Come descritto in precedenza, Qualità immagine (Q) e la raccomandazione di calibrazione (CR) dipendono metriche trama frequenza di superficie delle particelle. Delle immagini analizzate, ogni cella occupa mediamente 1 / 100.000 dellaarea dell&#39;immagine totale. Quando si utilizzano immagini di solo milioni di pixel con un piccolo rapporto di dimensione cellulare, la variazione di dimensione della cella è anche piccolo. Cioè, la varianza può variare solo dal 10-60 px. Ma come area cellule rapporto area dell&#39;immagine diventa più grande, la distribuzione di cellula dimensioni aumenta, riducendo l&#39;Kurtosis della dimensione della cella distribuzione normale riducendo la frequenza di una determinata area. Questo a sua volta può rendere il calcolo automatico del superficie cellulare più difficile o impossibile perché una superficie minima definita non può essere determinata. Analogamente, questo vale anche per le immagini con pochi numeri di cellule in cui la frequenza di diverse dimensioni delle celle può essere molto bassa (&lt;50). Come risultato, quando si analizzano immagini con risoluzioni diverse rispetto a quelli utilizzati in questo studio o diverse distribuzioni di dimensioni delle cellule, può essere necessaria l&#39;identificazione manuale della gamma dimensione della cella (10.3.3). Significato e futuri arrivarci Il ImageJ plug cellulare Counter E &#39;stato inizialmente Relèased nel 2001 dal Dr. Kurt De Vos e ha servito come un fiocco per il conteggio delle cellule manuale a questo giorno. Per continuare il trend di strumenti liberamente disponibili per la comunità biologica, cellulare Concentrazione Calcolatrice e contatore test di migrazione offrono il prossimo passo in strumenti gratuiti per contribuire ad aumentare il throughput e la riproducibilità inter-sperimentale di test di migrazione. Il risultato finale del test di migrazione è fortemente dipendente dal numero di cellule seminate. Ergo una conta cellulare affidabile è una necessità per la riproducibilità. In questo modo, CCC offre sia una maggiore precisione grazie alla maggiore certezza statistica di concentrazione cellulare e più brevi i tempi di conteggio preservare la salute delle cellule. Inoltre, il risultato finale di entrambe plugin è un conteggio del numero di cellule e non un indice relativo come fluorescenza. Vari altri protocolli esistenti che misura la fluorescenza dopo colorazione ma questi metodi soffrono di mancanza di sensibilità 13. Adobe Photoshop offre la propria analisi delle particelle tool ma il programma deve essere acquistato per l&#39;uso e non offre l&#39;analisi post-conteggio disponibile dalla migrazione contatore test 20. Entrambi i plugin si affidano alla funzione di conteggio delle particelle da ImageJ e di conseguenza possono essere modificati dall&#39;utente finale modificando le macro utilizzate da ImageJ. Questo offre una maggiore flessibilità per l&#39;utente di ampliare la portata dei plugin per altre particelle con la creazione di nuove macro. Un ulteriore sviluppo per aumentare l&#39;ampiezza delle particelle numerabili e di integrare i contributi degli utenti finali è il prossimo passo logico. Combinando i principi fondamentali del cellulare Contatore con un&#39;analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Nel conteggio delle cellule in vitro è un&#39;importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione 1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi 3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli sfruttano cellule resistenza elettrica per determinare il numero di cellule e le dimensioni. Sono veloci, accurati e più economico rispetto citometri a flusso. Tuttavia, essi sono raramente utilizzati solo per il conteggio delle cellule a causa del loro costo considerevole rispetto al conteggio manuale 3. Flusso citometri, d&#39;altra parte, sono costosi ma hanno molte applicazioni, come il conteggio delle cellule, analisi della forma cellule, structure e cella di misura interna marcatori 4,5. Le macchine che utilizzano uno di questi due principi sono disponibili da molti produttori. Conteggio manuale è conveniente, ma richiede tempo e soggetto a bias mentre i metodi automatici sono dotati di una frazione del tempo richiesto per il conteggio manuale, ma utilizzando macchine costose 6. Altre procedure di coltura cellulare comune ha in saggi di motilità cellulare in vitro, vale a dire, la migrazione cellulare e dell&#39;invasione 7. saggi di migrazione e invasione sono comunemente usati per studiare la motilità cellulare e invasività in risposta ad una risposta chemiotattica. Inoltre, essi sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale, la differenziazione, la risposta infiammatoria, e le metastasi di più tipi di cellule 7-11. Le cellule che sono migrati o invaso attraverso la membrana porosa di un saggio di migrazione possono essere quantificati in due modi diversi. In primo luogo, colorando le cellule con un colorante fluorescente, dissociazione from la membrana, e la quantificazione usando un lettore di fluorescenza 12. Una limitazione di questo metodo di quantificazione è che nessun record può essere conservato delle membrane e non vi è alcuna possibilità per ulteriori analisi 13. Il secondo metodo di quantificazione è per migrato / celle da fissi e colorati con colorante fluorescente o più comunemente, con coloranti citologici, come violetto di cristallo, toluidina colorante blu o ematossilina invaso; quindi le cellule vengono quantificati utilizzando manualmente immagini microscopiche invertite di queste membrane che è un compito molto tempo 12,13. Per superare gli inconvenienti di conteggio manuale delle cellule, sono stati sviluppati due contatori di cellule automatizzati affidabili ed accurate per concentrazione cellulare e per il dosaggio di migrazione. Questi algoritmi automatizzati contatore di cellule sono stati sviluppati per ImageJ come plugin usando il linguaggio del computer Java di Oracle. ImageJ è uno strumento di elaborazione immagine pubblica e diffuso sviluppato dal National Institute of Health (NIH) 14,15; in tal modo, scrivendo questi plugin per ImageJ facilita l&#39;integrazione nella comunità biologica. Automazione del conteggio delle cellule assicura un throughput elevato e riproducibilità rispetto al conteggio manuale. Anche se altri software e plug-in disponibili possono essere utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare attraverso l&#39;analisi delle immagini 5,16,17, cellulare Concentrazione calcolatore di plug-in è veloce e può anche gestire diluizioni di cellule e trattamenti. Inoltre, tutti i risultati ei calcoli di questi due contatori possono essere salvati ed esportati. I due plugin descritti nel presente documento sono ottimizzate per l&#39;impiego di un microscopio a contrasto di fase per l&#39;imaging cellulare dal vivo e ampio campo di vista (cattura tutta la membrana) di imaging per membrane dosaggio migrazione attraverso l&#39;uso di un ambito dissezione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

<table><tbody><tr><td>HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002702</td><td>Cell culturing media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovian serum (FBS)</td><td>GIBCO BRL</td><td>P00015</td><td>Media suppliment</td></tr><tr><td>HTR8/SVneo trophoblast cell line</td><td>Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen&amp;rsquo;s University, Kingston, Canada)</td><td></td><td>Software is designed to work with any cell line.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBCO BRL</td><td>27250-018</td><td>Prepared as 0.20% (w/v) in 10 &amp;micro;M EDTA 1x PBS</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>833902</td><td>Any tissue culture treated plates will be suitable</td></tr><tr><td>Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0&amp;nbsp;&amp;micro;m Pore size</td><td>Costar 3422 ordered from Fisher Scientific</td><td>7200150</td><td>For 24-well plates; Pore size: 8.0 &amp;micro;m; 6.5 mm diameter; 0.33 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; growth area</td></tr><tr><td>HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 &amp;amp; 3</td><td>EMD Millipore and ordered from VWR</td><td>65044A, B, &amp;amp; C</td><td>Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles &amp;amp; includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicator</td><td>Puritan Medical</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Single-edge industrial razor blades</td><td>VWR</td><td>55411 - 055</td><td>Thickness: 0.30 mm (0.012&quot;)</td></tr><tr><td>Microscope Slides - Precleaned/Plain</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550A3</td><td>Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Fisher Chemical Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereo dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD &amp;amp; camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:&amp;nbsp; LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90&amp;nbsp;mm Model: MOB306 &amp;amp; Objective achromat 0.32X, WD=303&amp;nbsp;mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Assistant Germany&amp;nbsp;</td><td></td><td>0.100 mm Depth - 0.0025 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Olympus inverted light microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41SF</td><td>The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2&lt;br /&gt;2.0 Megapixel CMOS Color Camera &amp;amp; camera software is Infinity analyze Version 6.5.2</td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet 1300 Series A2</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Model: 1375</td><td>Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Model: 370</td><td>Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.50e</td><td>Minimum version required</td></tr><tr><td>Java Runtime Environment</td><td>Oracle</td><td>Version 1.8.0_66</td><td>Minimum version required</td></tr></tbody></table>

automated quantification and analysis of cell counting procedures using imagej plugins

L&#39;Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l&#39;elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l&#39;emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all&#39;interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l&#39;analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un&#39;analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.

Calcolatrice cellulare Concentrazione La figura 1 presenta il processo globale di calibrazione CCC e l&#39;acquisizione di immagini numerabile. Figura 1A e 1B rappresentano l&#39;immagine di calibrazione P-Square e calcolo della lunghezza del P-square in pixel. CCC determina concentrazione cellulare in un dato volume utilizzando la formula: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq1.jpg" /> P-quadro di un emocitometro ha un volume di 100 NL (1 mm x 1 mm x 0,1 mm) e Data questa costante, il volume totale immagine può essere calcolato dopo la conversione pixel a mm. Figura 1C è un&#39;immagine numerabile ideale, con messa a fuoco cellule che visualizza la caratteristica illuminazione fase e non graduazioni sfondo emocitometro. Infine, il diagramma a dispersione di Figure 1D mostra una altamente correlati, manuale contro il conteggio automatizzato delle cellule da 57 immagini scattate su vari esperimenti e tipi di cellule, tra cui HTR8, ES-2, e Swan71. Da segnalare, la gamma alta della concentrazione era ~ 5,6 x 10 6 cellule / ml con una fascia bassa del ~ 2.3 x 10 3 cellule / ml (≈ 5 cellule per immagine). Si suggerisce che se i conteggi sono al di sotto di 10-15 cellule per immagine, il campione deve essere sospeso in un volume più piccolo per aumentare la potenza statistica. Acquisizione ed elaborazione di immagini per le migrazioni Assay contatore Centinaia di membrane test di migrazione sono stati ripresi nel corso di molti esperimenti, che sono stati tutti seminato con la linea umana di cellule trofoblasto HTR8, Swan71, o ovarico linea di cellule di cancro ES-2. Di queste immagini, molteplici sono stati scelti per rappresentare una serie di categorie da molto scarsa per la qualità eccellente sulla base di luminosità, chiarezza e colore della Stained cellule, e il grado di colorazione di fondo e particelle indesiderate (rumore). Utilizzando queste immagini, le impostazioni dei colori RGB soglia predefinita (≈ 150, 120, 0) sono stati determinati (Figura 2C) e utilizzati come base di tutti gli sviluppi successivi dell&#39;algoritmo. L&#39;obiettivo era quello di massimizzare il colore nucleare di rapporto di colore totale, vale a dire, la maggior parte dei pixel colorati dovrebbe essere all&#39;interno di nuclei cellulari. Il pannello superiore della figura 2A illustra la luminosità ideale immagine, cellule nuclei chiarezza e colore, e il rumore di fondo trascurabile. La luminosità dell&#39;immagine è importante garantire c&#39;è una grande abbastanza contrasto tra cellula e lo sfondo per produrre un&#39;immagine binaria in bianco e nero. Se questa differenza non è soddisfatta, le aree di grandi dimensioni o imprevedibili possono essere contati dalla ImageJ Analizzare funzione di particelle; la migliore delle ipotesi è uno sfondo completamente bianco. In opposizione, il pannello inferiore di Fifigura 2A ha sfondo estrema colorazione e le cellule che sono quasi indistinguibili. Membrane con questo grado di colorazione molto probabilmente produrre risultati inaffidabili dal contatore test di migrazione. In alcuni casi, aumentando luminosità al livello ideale può influenzare fedeltà dell&#39;immagine da sovraesporre l&#39;immagine. Allo stesso modo, elevata esposizione o la luminosità possono produrre effetti cromatici sistemici con luce progressiva o irregolare e le regioni scure. Con la correzione flatfield, questi effetti possono essere ridotti al minimo o eliminati del tutto come mostrato nella Figura 2B (vs superiore pannello inferiore). Inoltre, la correzione flatfield è un buon modo per pareggiare la luminosità delle immagini multiple di membrana. Calibrazione e validazione di migrazione Assay contatore Per aiutare gli Stati UnitiER in meglio determinare se le immagini membrana test di migrazione soddisfano i criteri richiesti per il conteggio preciso, due qualificazioni sono stati progettati, la qualità dell&#39;immagine chiamato (Q), e la calibrazione raccomandazione (CR). È importante sottolineare che entrambe le qualificazioni, come il nome suggerisce CR, sono raccomandazioni solo e agiscono come guide, piuttosto che i giudici assoluti della numerabilità di ogni immagine. Sia Q e CR si basano sulle metriche del grafico a dispersione di frequenza di un&#39;area particella (10.3.2). Per semplificazione, una metrica può essere considerato come le varie forme della curva che compongono la trama di frequenza. La metrica desiderata di un Q adeguata (≥0.5) è stato determinato dal osservata normale distribuzione approssimativa della dimensione della cella. Comunemente, cellule che sono irrisolvibile tra loro, over-tinto, o semplicemente particolarmente grande, spostano il skewedness a una distribuzione normale coda di destra (Figura 3B). Come tale, questa è la metrica ideale di una tipica immagine calibrata. Conl&#39;aggiunta di rumore di fondo, questo porta normalmente ad un gran numero di particelle nell&#39;intervallo zona 1-5 pixel (Figura 3A). Al fine di calcolare le metriche di scena, i dati sono dotati di dieci Savitzky-Golay curve smussati di diversa gradi polinomiali prodotti dalla Biblioteca Java scientifico del Dr. Michael Thomas Flanagan (http://www.ee.ucl.ac.uk/~mflanaga /Giava/). Essenzialmente, questo crea più punti nella regione approssimativa di ciascun estremo. Attraverso una serie di mappe a grappolo densità di minimi locali e massimi, un quadro generale delle metriche trama può essere calcolato come un elenco ordinato, vale a dire, minimo, massimo, minimo / massimo di sovrapposizione, ..., n ° estremo. In breve, il grado in cui le curve levigate si adattano i dati di frequenza determina il modo in fitto gli estremi punti sono. Maggiore è il raggruppamento di non sovrapposti extrema, maggiore Q diventa. In teoria, Q rappresenta chiarezza complessiva immagine sulla base di tha distribuzione delle dimensioni delle particelle distinte. Sia il booleano CR è vero o no dipende dalla sequenza di Extrema. Dalla figura 3A, la lista ordinata sarebbe minimo, massimo, e una sequenza di sovrapposizione extrema in base alle proprietà della curva Savitzky-Golay. Dal momento che figura 3A rappresenta un&#39;immagine non calibrato, questa sequenza generale di bandiere Extrema CR come veri, il che suggerisce all&#39;utente che l&#39;immagine può avere bisogno di calibrazione. Andando avanti, si può notare che dalla figura 3B, l&#39;elenco sarebbe identica, ma con l&#39;esclusione del primo minimo. Così le metriche delle immagini non calibrati e tarati ideali sono stati determinati. Deviazioni da queste metriche generalmente contrassegnare un&#39;immagine per la calibrazione e ridurre Q ≤ 0, come nel caso del fondo elevato rumore membrana in Figura 3C. L&#39;applicazione di queste qualificazioni ad una selezionedi modesto per immagini eccellenti, per quanto riguarda la luminosità e il rumore di fondo, è chiaro che conta immagine calibrata sono significativamente più vicino a conteggi manuali che non calibrato (1,9% ± 0,3 vs 21,7% ± 2,9, rispettivamente; Figura 3D, E). Data l&#39;elevata qualità complessiva delle immagini scelte per l&#39;analisi (non calibrata <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0,71 ± 0,04; media ± SE), vi è stato un modesto aumento previsto solo in D dopo la calibrazione ( <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719eq2.jpg" /> = 0.90 ± 0.04). Nel loro insieme, Q suggerisce il potenziale numerabilità generale di un&#39;immagine, mentre CR è un forte indicatore del fatto che la taratura è successo o meno. Timing confronti di entrambi i contatori cellulare Concentrazione e migrazione contatore Assay <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Due ricercatori (Utente 1 e Utente 2) sono stati usati per testare i confronti velocità tra metodi manuali e automatici. Entrambi i ricercatori hanno avuto una notevole esperienza con il conteggio delle cellule e il test di migrazione, ma per l&#39;utente 1 è stato sperimentato in uso sia del CCC e TC mentre l&#39;utente 2 ha dovuto seguire le istruzioni scritte. Figura 4A confronta CCC tempo di taratura tra il Utente 1 e 2. Come previsto, l&#39;utente 1 è sostanzialmente più veloce di utente 2, insieme, prendendo in media circa cinque minuti per la calibrazione CCC. Al fine di confrontare il conteggio emocitometro manuale e tariffe automatizzati, il tasso di manuale di contare con un contatore riscontro è stato confrontato con il tempo impiegato per scattare nove immagini della camera di emocitometro e conteggiato in CCC (Figura 4B). Una concentrazione cellulare tipica di 1,15 x 10 6 cellule / ml è stato utilizzato per confrontare tempi, portando ad una media di aumento del throughput 1x. Questo tasso varia a seconda del numero di cellule caricato nelemocitometro come il tempo totale impiegato per catturare immagini e di processo è indipendente dal numero di cellule. Infine, timing che comprende l&#39;acquisizione delle immagini delle membrane, quantificazione all&#39;interno TC, e le regolazioni manuali di queste immagini è stata misurata in figura 4C. In particolare, 12 membrane test di migrazione con basso numero di cellule (Totale = 10.571 cellule) e lo sfondo sostanziale colorazione e detriti cellulari sono stati scelti per facilitare la peggiore delle ipotesi, che richiederebbe una regolazione manuale per numero di cellulare. Ciò si riflette nella colonna di regolazione Figura 4C (Adj) dove ha preso una media di 13 minuti per rimuovere i conteggi indesiderati e aggiungere le cellule perse. Per confronto al conteggio manuale, i tassi di conteggio delle cellule ottimali sono stati determinati con cellulare contatore; immagini di alta qualità a membrana con alta densità cellulare sono stati usati (risultati non mostrati). Questo ha prodotto un tasso massimo medio tra l&#39;utente 1 e 2 di 9.1 x 10 3 cellule / h(~ 2,5 cellule / s). L&#39;utilizzo di questi numeri, le membrane di Figura 4C sono stati contati 4.4x più veloce con TC quanto ci si aspetterebbe a tasso manuale di massima. Il risparmio di tempo sono direttamente dipendenti da numero di cellulare e la qualità delle immagini, contando membrane di migrazione che ha richiesto poco o nessun aggiustamento e la densità delle cellule alta (~ 7.000 cellule / membrana), TC generato conta delle cellule 1,395x più veloce rispetto al tasso di manuale di massima. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig1.jpg" /> Figura 1: Cell Concentrazione Calcolatrice. Contrasto microfotografia (A) Fase della piazza principale centrale del emocitometro prese a 40X ingrandimento totale. barra della scala rappresenta 200 micron. (B) Un ritagliata versione dell&#39;immagine da (A) raffigurante che lunghezza misurare sul emocitometro. La colonna Lunghezza finestra Risultati è stato evidenziato per una facile identificazione. barra gialla= 1 mm. (C) Un microscopio ideale di un emocitometro contenente cellule HTR8 dopo la calibrazione microscopio e software a 40X di ingrandimento totale, con una risoluzione di 1.600 x 1.200 px. Barra di scala = 200 micron. (D) Un grafico a dispersione confrontando i conteggi manuali utilizzando il contatore ImageJ plug-cellulare rispetto ai conteggi automatici delle stesse immagini utilizzando la calcolatrice concentrazione delle cellule. n = 57 immagini. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54719/54719fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig2.jpg" /> Figura 2: saggio di migrazione contatore immagini rappresentative. (A) Il pannello superiore è un ottavo porzione di una membrana totale raffigurante un&#39;immagine ideale con sfondo minima; Barra di scala = 200 micron. Ilpannello inferiore contiene un&#39;immagine con sfondo significativa colorazione che influenza fortemente la precisione del conteggio automatico; Barra di scala = 585 micron. (B) Il pannello superiore rappresenta un&#39;immagine scura di buona qualità che produceva conteggi imprecisi. Il pannello inferiore è una versione numerabile della stessa immagine dopo la correzione flatfield. Barre di scala = 593 micron. (C) Il pannello superiore rappresenta una vista ingrandita di una membrana tipico. Il pannello inferiore è la stessa immagine seguita dal colore soglia ImageJ desiderato (RGB soglia = 150, 120, 0) per rimuovere sfondo intercellulare e la maggior parte del citoplasma visibilmente macchiato. Tutte le immagini sono state scattate a 1.35X ingrandimento totale con un ambito dissezione tarato a una risoluzione di 2.592 x 1.944 px da più invasioni test di migrazione di HTR8 colorate con ematossilina. Barre di scala = 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54719/54719fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vie</a>wa più grande versione di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig3.jpg" /> Figura 3: Calibrazione e validazione di test di migrazione c ounter. (A) Tipico esempio di un&#39;immagine non calibrato di alta qualità. (B) La versione calibrata di (A) con Recount migrazione del contatore saggio&gt; &#39;dimensione suggerita&#39;. (C) Un tipico diagramma di frequenza di una membrana a bassa qualità delle immagini con sfondo notevole macchia o l&#39;oscurità generale. (D) Un grafico a dispersione confrontando i conteggi manuali utilizzando il contatore plug cellulare ImageJ e migrazione contatore saggio conteggi automatici. (E) Un grafico a barre che mostra la differenza media per cento dei calibrato rispetto conteggi automatici non calibrati. I dati sono media ± SE. P &lt;0.0001, n = 30, t-test spaiato con corri di Welchction. Le stesse immagini sono state utilizzate per D ed E. La calibrazione di entrambi è stato fatto con il riconteggio&gt; &#39;dimensione suggerita&#39; e Recount&gt; &#39;Impostazioni manuali per ridefinire ulteriormente la dimensione minima contati e la soglia del colore. Nessuna rettifica di conteggio manuale sono state effettuate utilizzando il &#39;immagine aperta con conta&#39; la funzione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54719/54719fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54719/54719fig4.jpg" /> Figura 4: Tempi di concentrazione delle cellule contatore e l&#39;uso di contatore test di migrazione. (A) Confronto di ore per la calibrazione CCC (punti 1 e 2) tra l&#39;utente 1 (CCC / esperto TC) e User 2 (CCC / TC novizio). (B) volte conteggio manuale delle cellule sono stati in media nell&#39;arco di cinque prove ed espressi in cellule contate per min. automatic conteggi sono stati calcolati da tempi media per catturare nove immagini di una camera di emocitometro e contati con CCC. Concentrazione cellulare usato era ~ 1,15 x 10 6 cellule / ml. I dati sono media ± SE. n = 5. (C) timing Transwell contatore sono stati confrontati su tre categorie: acquisizione (Acq, i punti 7 e 8), di quantificazione (Qnt; passi 10.1-10.3.3 utilizzando le impostazioni di configurazione di default), e la regolazione manuale (Adj mentre le misure di 10,4 -1.4.2). Le membrane quantificati hanno un elevato grado di colorazione di fondo e detriti per richiedere sostanziali regolazione manuale per conteggi precisi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54719/54719fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

automated-quantification-analysis-cell-counting-procedures-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

46.8K Views.  York University. This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Video: Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Una migliore visualizzazione e analisi quantitativa degli effetti del farmaco utilizzando cellule Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Bioingegneria

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Biologia dello sviluppo

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochimica

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Biologia

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to the substrate as a function of the number and size of focal adhesions, and cell shape, characterized by the cell shape index and other shape descriptors. Focal adhesions were visualized by paxillin staining and cell-cell borders were marked by junction plakoglobin and actin. The methods for cell culture and staining were standard; images represent single focal planes; image analysis was performed using publicly available image processing software. The presented protocols are used to quantify the number and size of focal adhesions and the differences in cell shape distribution in the monolayers, but they can be repurposed for the quantification of the size and shape of any other distinct cellular structure that can be stained (e.g., mitochondria or nuclei). Assessing these parameters is important in the characterization of the dynamic forces in adherent cell layer, including cell adhesion and actomyosin contractility that affects cell shape.

The article describes quantification of 1) the size and number of focal adhesions and 2) cell shape index and its distribution from confocal images of the confluent monolayers of MCF7 cells.

Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...