Name: evaluation of the efficacy and toxicity of rnas targeting hiv-1 production for use in gene or drug therapy
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
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Il lavoro qui presentato è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (concede DCB-120266, PPP-133.377 e 348.967 HBF-a AG).

1. Cellule e trasfezioni <ol><li> Culture cellule HEK 293T in terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Preparare una sospensione 2 x 10 5 cellule / ml nel terreno di coltura cellulare. Aggiungere 500, 100 e 1.000 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, 96 e 12 pozzetti, per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, rispettivamente (Figura 2A). </li><li> Mescolare delicatamente i piatti e li incubare O / N a 37 ° C con 5% di CO 2. Crescere le cellule a 50-70% di confluenza. </li><li> Secondo un piano di trasfezione, preparare diluizioni di RNA di prova e dei loro controlli in provette da 1,5 ml (micro esempio, la figura 2B). <ol><li> Per il saggio di produzione virale, preparare un 10 ng / ml di diluizione di HIV-1 plasmide di espressione e aggiungere 10 microlitri in ciascun tubo. Successivo preparare 5 micron diluizioni di RNA di prova e un RN controllo negativoA. Aggiungere 2,5 o 10 ml di ogni RNA di prova e la diluizione di controllo negativo ai corrispondenti tubi per 25 o 100 concentrazioni finali nm. </li><li> Per il test di vitalità cellulare, preparare 5 pM diluizioni di RNA di prova e 10 mg / ml di diluizione dell&#39;RNA controllo positivo, a basso peso molecolare Poly I: C. Aggiungere 2 ml di RNA test o diluizioni di controllo RNA positivi ai corrispondenti tubi per 100 nm o concentrazioni finali ml 200 mg /, rispettivamente. </li><li> Per il saggio attivazione del sistema immunitario, aggiungere 20 ml di RNA test o diluizioni di RNA di controllo positivo previste al punto 1.3.2. ai corrispondenti tubi di 100 nm o 200 mg / ml concentrazione finale rispettivamente. Nota: Per il test di RNA plasmidi di espressione, preparare 10 ng / diluizioni microlitri al posto dei 5 micron diluizioni di RNA di prova, dando importi finali di 25 e 100 ng per passo 1.3.1. e 100 ng per passi 1.3.2. e 1.3.3. </li></ol></li><li> Aggiungere 50, 25 o 75 ml di DMEM ad ogni provetta trasfezione per prod viraleuzione, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. Per i saggi di produzione virale, portare le cellule e tubi trasfezione preparati per un 3 (BSL3) laboratorio di livello di bio-sicurezza prima del passaggio successivo. </li><li> Aggiungere 2 ml di trasfezione reattivo sequenzialmente i tubi di trasfezione e incubare 15 a 20 minuti per consentire di formare complessi. Vedere la tabella dei materiali per la specifica del reagente di trasfezione da utilizzare. </li><li> Aggiungere la miscela di trasfezione da ciascuna goccia a goccia alle posizioni corrispondenti nelle piastre di coltura cellulare tubicino. Agitare delicatamente e incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Misura HIV-1 di produzione (sezione 2), la vitalità cellulare (sezione 3) e l&#39;attivazione immunitaria (sezione 4) nelle piastre di coltura cellulare (Figura 2C). </li></ol> 2. Assay La produzione virale <ol><li> Rimuovere le piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti da incubatore e mescolare delicatamente le piastre all&#39;interno della coltura cellulare BSL3cappuccio. Trasferire 150 pl di surnatante da ogni pozzetto ad un corrispondente bene in una piastra inferiore 96 pozzetti piatta, che sarà utilizzato per quantificare HIV-1 di produzione. Nota: saggi titolazione virale comuni includono misurando l&#39;espressione della proteina del capside di HIV-1 (p24) by enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) 20, quantificando RNA virale mediante trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) 21 e misurando l&#39;attività di HIV-1 RT enzima. I passaggi da 2.2 a 2.5 spiegare i metodi per quantificare l&#39;HIV-1 RT attività 13,15,16. </li><li> Trasferimento 5 ml di surnatante in pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, contenente 25 ml di una perturbazione virale cocktail 15 (Tabella 1). Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire la piastra ad una workstation radioattività. Nota: Step 2.2. è necessaria solo se una workstation radioattività non è disponibile in laboratorio BSL3. Se le piastre non devono essere rimossi dallaboratorio BSL3, procedere al punto 2.3. e aggiungere 50 ml di radioattivi / virale perturbazione cocktail (Tabella 1) al posto dei 25 ml di cocktail radioattivi. </li><li> Preparare una radioattivo cocktail 15 (Tabella 1), e aggiungere 25 ml a ciascun pozzetto di surnatante virale e cocktail interruzioni. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Spot 5 ml di miscela di reazione su piazze corrispondenti in una fibra di vetro Di Etile Amino etilico (DEAE) carta filtermat e consentire le macchie asciugare per 10 minuti. Spot la miscela di reazione su ogni altro quadrato in modo che non esistono due campioni Boarder direttamente l&#39;un l&#39;altro. Ciò consente di evitare cross-over tra i campioni per determinare i conteggi per minuto (cpm) al punto 2.6. </li><li> Lavare le carte 5X per 5 minuti con 2x salina citrato di sodio (SSC) tampone (Tabella 1), seguito da due 1 min lavaggi con etanolo al 95%. Lasciare le carte a secco e sigillarli in sacchetti di campionamento. </li><li> Clip portacampionari containing la carta filtermat in una cassetta ed inserire la cassetta in un contatore a scintillazione micropiastra. Impostare il contatore di leggere CPM per 32 P, con la data di riferimento previsto per la partita di [32 P] dTTP utilizzato nell&#39;esperimento. Selezionare quali campioni da letto utilizzando la mappa piatto e avviare il contatore. </li><li> Per qualsiasi metodo titolazione virale, dividere i valori ottenuti per ciascun RNA test il controllo negativo adiacente e moltiplicare tale valore per 100 per ottenere la percentuale di inibizione di HIV-1 di produzione per ciascun replicato degli RNA prova. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova, a diverse concentrazioni è fornita in figura 3. </li></ol> 3. vitalità cellulare Assay <ol><li> Rimuovere le piastre a 96 pozzetti dall&#39;incubatore e aggiungere 20 ml di 5 mg / ml MTT (3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromide) diluito in tampone fosfato di Dulbecco ( DPBS) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre Fo 3 ore a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato con detergente (1% NP-40, 4 mM HCl in isopropanolo) a ciascun pozzetto ed incubare le piastre per 2 ore a RT. </li><li> Determinare l&#39;assorbanza a 570 nm in uno spettrofotometro per micropiastre. </li><li> Calcolare il metabolismo MTT relativo per ciascun controllo e test di RNA positivo dividendo il valore ottenuto per ciascun campione per il controllo trasfezione adiacente. Un esempio dei risultati confrontando i diversi RNA di prova e un controllo positivo è fornito in Figura 4. </li></ol> 4. Immune attivazione del test <ol><li> Rimuovere le piastre da 12 pozzetti da incubatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS e aggiungere 70 ml di tampone di lisi freddo 22 (tra cui proteasi e fosfatasi inibitori, Tabella 1) in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Trasferimento lisati cellulari per tubi micro e veloce congelarli immergendo iltubi in azoto liquido. Consentire ai campioni di scongelare e ripetere per altri 2 cicli di gelo e disgelo, per un totale di 3. </li><li> Centrifugare i lisati per 15 minuti a 4 ° C, 15.700 xg, per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in nuovi tubi micro e determinare la concentrazione di proteine ​​con il metodo 23,24 Coomassie blu (Bradford). </li><li> Risoluzione 75 mg di proteine ​​di ogni campione in un gel di poliacrilammide denaturante al 10% e trasferimento su membrana di nitrocellulosa come precedentemente descritto 25,26. </li><li> Dopo elettroforesi e trasferimento ad una membrana, rivelare bande proteiche incubando la membrana Ponceau S (Tabella 1) per 1 min seguita da lavaggio con acqua bidistillata. Utilizzare le bande e scaletta proteine ​​come guida per tagliare la membrana 80 e 55 kDa. Nota: Nel passo 4.4 campioni possono essere eseguiti su 16 x 18 cm 2 gel scorrimento a 34 kDa, in modo che sia facile da tagliare la membrana nelle posizioni specificate e non tagliare ilbande di interesse. In alternativa, alcuni gel possono essere eseguiti con gli stessi campioni per evitare di tagliare la membrana. </li><li> Lavare la colorazione Ponceau S con soluzione salina Tris tamponata contenente 0,05% di Tween 20 (TBST, Tabella 1). Aggiungere TBST con latte non grasso 5% per coprire completamente le membrane. Incubare le membrane a temperatura ambiente con agitazione per 1 ora. </li><li> Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di albumina sierica bovina (BSA) e anticorpi diluito a 1 su 1.000 contro ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), per i primi, basso e intermedio pezzi della membrana, rispettivamente. </li><li> Lavare le membrane 5X per 5 minuti con TBST e incubare in TBST con latte 5% senza grassi e di capra anti-coniglio anticorpi secondari perossidasi (diluito a 1 su 5.000) per 1 ora. </li><li> Lavare il membrane 5x per 5 minuti con TBST e applicare la soluzione elettrochemiluminescenza (ECL) per visualizzare le bande in film, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo visualizzare le bande proteiche su film, lavare i pezzi intermedia ea valle della membrana per 10 minuti con una soluzione di anticorpi stripping. Incubare le membrane O / N in TBST con 3% di BSA e anticorpi contro PKR totale (a 1 a 500) e IRF3 (a 1 su 1.000), per la metà e pezzi di fondo, rispettivamente. Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio per la membrana PKR (centro). </li><li> Lavare il pezzo inferiore della membrana 5x per 5 minuti con TBST e incubare la membrana in TBST con 3% BSA per 1 ora con un anticorpo contro actina (diluito 1 a 5000). Ripetere i punti 4.8. e 4.9. utilizzando marcato con perossidasi di capra anti-topo al posto del anticorpo secondario anti-coniglio. Un esempio dei risultati che confrontano diversi RNA di prova e un controllo positivo viene fornito nella Figura 5. Vedere la tabella di materiali per i anticorpi specifici da utilizzare. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+RRE+RNA+acts+as+an+RNA+silencing+suppressor+by+competing+with+TRBP-bound+siRNAs.">HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs.</a> RNA Biol. 12, 123-135 (2015).</li><li>Castanotto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+delivery+of+small+interfering+RNAs+reduces+RNAi+efficacy+by+selective+incorporation+into+RISC.">Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC.</a> Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).</li><li>Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. 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The authors have nothing to disclose.

L&#39;HIV-1 test di produzione, definita è stata effettuata utilizzando cellule HEK293T (Figura 2) ed è simile a dosaggi utilizzati per lo screening HIV-1 RNA per ribozyme efficace 13, shRNA 10,29, siRNA 30, e U1i RNA siti 11,31 bersaglio. Utilizzando diversi metodi per quantificare l&#39;HIV-1 di produzione, la maggior parte degli studi hanno misurato la produzione virale 48 ore dopo la co-trasfezione di HIV-1 RNA plasmide con candidati. Dopo la produzione di HIV-1, virioni immaturi subiscono scissione proteolitica dei loro poliproteine ​​dal HIV-1 proteasi diventare virioni maturi, capaci di infettare nuove cellule. Per il saggio RT attività enzimatica HIV-1 descritto nelle fasi 2.2. a 2,5., sia la produzione e gradini maturazione vengono valutati, poiché l&#39;enzima RT è attivo solo in virioni maturi. Al contrario, la proteina del capside e RNA virale possono essere presenti in entrambi i virioni maturi e immaturi. Pertanto, quantificando HIV-1 produzione p24 ELISA o RT-PCR may perdere effetti di RNA terapeutici che agiscono sul gradino maturazione del ciclo di replicazione di HIV-1, come ribozimi che localizzano per HIV-1 virioni 32 e molecole antisenso basate che inibiscono l&#39;elaborazione Gag in aggiunta a HIV-1 espressione della proteina 13, 31. Una limitazione di saggi produzione virale è che le cellule utilizzate non esprimono i recettori appropriati per HIV-1 iscrizione e non possono essere utilizzati per valutare gli effetti di RNA terapeutici su HIV-1 iscrizione o l&#39;integrazione. Per valutare gli effetti di anti HIV-1-RNA sull&#39;intero ciclo di replica, vari modelli HIV-1 sono stati utilizzati in diverse linee cellulari T linfociti o globuli primarie 5,33. Dal momento che queste linee cellulari sono difficili da trasfezione, sono necessari per fornire una quantità sufficiente di HIV-1 RNA anti-per osservare gli effetti sulla replicazione dell&#39;HIV-1 metodi più alta intensità di lavoro, come l&#39;inserimento del gene vettori lentivirali o aptameri / peptide coniugazione. Questa limitazione rende difficult per confrontare rapidamente il rapporto struttura-attività tra le varianti di un particolare anti-HIV-1 RNA o eseguire lo screening su larga scala per identificare il sito di destinazione ottimale per nuove classi di anti-HIV-1 RNA. Mentre saggi produzione virali sono utili per identificare nuove molecole anti-HIV-1 RNA, modelli cellulari alternativi in ​​linee cellulari facilmente transfettate che supportano replicazione dell&#39;HIV-1, come TZM-bl cellule, sarebbe utile per lo screening anti-HIV-1 RNA di targeting altre fasi del ciclo di replicazione, come l&#39;ingresso e l&#39;integrazione. A seconda della classe di anticorpi anti-HIV-1 RNA, sono state descritte diverse possibili meccanismi di tossicità. Ad esempio, RNA antisenso-based possono avere effetti fuori bersaglio sulla RNA cellulari contenenti la stessa o una sequenza simile al loro sito bersaglio in HIV-1 RNA. Allo stesso modo, aptameri RNA, sul modello della risposta elemento trans-attivazione (TAR) o elemento di risposta Rev (RRE), potrebbero influenzare la funzione di pr cellularioteins, come la proteina legante TAR RNA (TRBP) 34. shRNAs e siRNA hanno il potenziale aggiunto per influenzare il percorso RNA interference sequestrando proteine ​​RNAi 35 e alcune molecole U1i hanno dimostrato di influenzare la giunzione e lavorazione di RNA cellulari sequestrando proteine ​​del U1 piccoli RNA-proteina nucleare complesso 36. Mentre alcuni di questi effetti possono essere minimizzati un&#39;attenta progettazione, misurazioni della tossicità cellulare in schermi per nuove molecole anti-HIV-1 RNA sono utili per escludere molecole con potenziali effetti fuori bersaglio da un ulteriore sviluppo. Inoltre, gli effetti fuori bersaglio potrebbero indirettamente inibire l&#39;HIV-1 di produzione, rendendo tossicità cellulare una misura importante nel convalidare l&#39;efficacia di nuovi farmaci anti HIV-1 molecole identificate dagli schermi HIV-1 di produzione. Il saggio vitalità cellulare descritto in passi 3.1. a 3,4. è una variante di un test standard che è stata usata per vagliare diverse molecola antivirale<html> S 37. Il dosaggio misura l&#39;attività di enzimi cellulari NAD (P) H-dipendenti per ridurre il reagente MTT alla sua forma viola insolubile, formazan. Il protocollo è adattato da metodi precedentemente pubblicati 38 e diversi kit sono disponibili con MTT o altri reagenti strettamente correlati. Mentre è importante per saggiare la vitalità cellulare nella linea cellulare utilizzata per lo screening anti-HIV-1-RNA, va notato che diverse linee cellulari variano nella loro sensibilità verso tossicità RNA-indotta. Ad esempio, Reynolds et al. Dimostrato che Dicer siRNA substrato ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare nelle cellule HEK293T, ma ha ridotto significativamente la vitalità cellulare nelle cellule MCF7, DU145 e HeLa S3 39. Per il saggio descritto, HEK293T cellule sono usati come esempio (figura 4); Tuttavia, lo stesso test è anche stato fatto in cellule MCF7 per valutare la potenziale tossicità in una linea cellulare che è più sensibile a piccole tossicità RNA-indotta 16. e_content &quot;&gt; Da-HIV-1 anti-RNA non può essere elaborato e presentato al sistema immunitario adattativo, sono considerati meno immunogenico rispetto anti-HIV-1-proteine ​​o peptidi. Tuttavia, a seconda della loro sequenza o struttura, possono suscitare innata risposte immunitarie, e diversi sensori immunitario e vie di segnalazione sono stati individuati in grado di rispondere a piccoli RNA (recensiti 40). nel saggio di attivazione immunitaria qui descritto, i livelli di PKR fosforilato e IRF3 stati confrontati in cellule trasfettate con piccoli RNA come un indicazione di attivazione PKR o TLR3 rispettivamente. Entrambi i sensori RNA sono presenti in una vasta gamma di linee cellulari e la loro attivazione può portare alla produzione di interferoni di tipo 1 e, in caso di PKR, un arresto in traduzione. per valutare il potenziale anti-HIV-1 RNA per attivare la produzione di interferoni di tipo 1 di percorsi alternativi, i livelli di interferone-stimolata gene ADAR1 (P150) sono stati confrontati in cellule trasfettate conanti-HIV-1 RNA. Come dimostrato dagli effetti della lunga controllo positivo dsRNA, Poly I: C, tutte queste risposte erano attivi nelle cellule HEK293T (Figura 5) ed effetti simili sono stati osservati nelle cellule MCF7 16. Poiché queste risposte possono inibire HIV-1 di produzione in assenza di effetti sulla vitalità cellulare, il saggio di attivazione immunitaria fornisce un&#39;ulteriore convalida per l&#39;efficacia di nuovi anti-HIV-1 RNA. Ulteriori misure che possono essere aggiunti a questa valutazione includono la misurazione della produzione di citochine infiammatorie e interferoni di tipo 1 nelle cellule in coltura supernatante, e misurando l&#39;espressione di più geni interferone-stimolata. Dato che le cellule bersaglio HIV come le cellule ei macrofagi T CD4 + possono esprimere diversi livelli di sensori immunitarie innate, i candidati individuati dai saggi descritti in questo protocollo dovrebbero essere valutati per potenziale stimolazione immunitaria in questi tipi di cellule. Per tutti i saggi descrivonod, il passaggio critico per ottenere risultati riproducibili ed accurati è la preparazione dei tubi DNA o RNA transfezione (punto 1.3.). Il DNA plasmidico o RNA dovrebbero essere di elevata purezza con concentrazioni determinate con precisione. E &#39;anche fondamentale per comprendere gli opportuni controlli. Per valutare nuovi plasmidi di espressione dell&#39;RNA prova nel test di produzione virale, un controllo negativo appropriato è il plasmide di espressione vuota. Per RNA antisenso-based, deve essere incluso un ulteriore controllo negativo plasmide che esprime un RNA non-targeting. Sequenze per un ribozima non-targeting e shRNA che non incidono produzione HIV sono forniti in 13. Per siRNA prova, l&#39;unico controllo negativo che può essere utilizzato è un RNA non-targeting e un non-targeting siRNA sequenza appropriata per il dosaggio di produzione virale è fornito in 16. Per la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria, il controllo negativo deve essere cellule trattate con solo il reagente di trasfezione ed è critical che un controllo positivo come poli I: C è incluso per confermare che le cellule sono sensibili alla tossicità RNA-indotto o attivazione immunitaria. Per RNA plasmidi di espressione, il plasmide vuoto deve essere incluso per garantire che il vettore stesso non ha effetti tossici sulle cellule. Nel complesso, i saggi qui descritti rappresentano un buon primo passo verso l&#39;identificazione di terapie RNA sicuri ed efficaci per l&#39;uso in HIV-1 gene o la terapia farmacologica. Per molecole di targeting HIV-1 RNA, è anche importante considerare la conservazione del loro sito bersaglio in HIV-1 ceppi circolanti e metodi dettagliati per calcolare conservazione di sequenza sono stati precedentemente pubblicati 15. Per spostare una molecola in avanti in studi clinici, tossicità ed efficacia studi a lungo termine devono essere eseguite in cellule umane primarie e in modelli animali per confermare che i candidati identificati saranno al sicuro ed efficace nella clinica.

Una limitazione di corrente trattamenti HIV-1 è che devono essere somministrati cronicamente per prevenire la progressione della malattia. Trapianto di HIV-1 resistenti linfociti T, o cellule staminali ematopoietiche, ha il potenziale per fornire un controllo a lungo termine della replicazione dell&#39;HIV-1 in assenza di terapia farmacologica 1,2 e può anche essere un approccio efficace per raggiungere un HIV-1 cura 3. Un modo per rendere le cellule resistenti alla replicazione dell&#39;HIV-1 è quello di inserire uno o più geni che codificano per anti-HIV-1 RNA o peptidi nelle cellule di un individuo infetto durante un trapianto autologo 4. Diversi candidati-HIV-1 anti-geni sono stati progettati con alcuni studi clinici che entrano in combinazioni di due o tre 5 6, per prevenire lo sviluppo di HIV-1 resistenza a qualsiasi singolo gene. Anti-HIV-1 RNA sono tra i primi candidati per la terapia genica combinazione a causa del loro basso potenziale per suscitare risposte immunitarie e perchésono trascritti da sequenze geniche molto brevi. Alcuni-HIV-1 anti-RNA sono stati progettati per colpire l&#39;ingresso e l&#39;integrazione virale. Tuttavia, la maggior parte degli RNA anti-HIV-1 Target passaggi post-integrazione nel ciclo di vita virale (Figura 1). Inibitori post-integrazione includono RNA decoy, mira le HIV-1 Tat proteine ​​regolatrici o Rev 1, e RNA antisenso a base, il targeting siti diversi in HIV-1 RNA, come ribozimi 7, 8 e shRNAs U1i RNA 9. I metodi che sono stati utilizzati per confrontare l&#39;efficacia di anti HIV-1-RNA includono il monitoraggio replicazione virale in cellule trasdotte con i geni codificanti per RNA candidati e misurando la produzione virale in cellule trasfettate con plasmidi esprimenti RNA candidati e uno di HIV-1 plasmide di espressione 10 -13. Abbiamo usato in precedenza un test di produzione di HIV-1 per lo screening HIV-1 RNA per il nuovo ribozima siti bersaglio 13-15. Questi metodi sono stati dal raffinato per ottimizzare il formato di un RNAmolecola interferenze espresso dal DNA plasmide come shRNA o consegnato come siRNA sintetico 16. Il test misura la produzione di virus maturi dalle cellule 293T umane embrionali renali (HEK), e può essere utilizzato per confrontare gli effetti degli inibitori che colpiscono fasi post-integrazione nel ciclo di replicazione dell&#39;HIV-1 (Figura 1). Per gli inibitori che colpiscono fasi di pre-integrazione, sono necessari test alternativi come una prova di infettività delle cellule TZM-bl 17 per valutare l&#39;efficacia antivirale. I principali problemi di sicurezza per la fornitura di anti-HIV-1 RNA nella clinica includono potenziali effetti fuori bersaglio sulla RNA umani o proteine, e l&#39;attivazione dei sensori del sistema immunitario innato. Per valutare la tossicità di anti-HIV-1 siRNA, abbiamo utilizzato un test di vitalità cellulare in diverse linee cellulari 16. Abbiamo anche misurato attivazione dei doppi sensori immuni RNA incagliati, RNA proteina chinasi attivata R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), nonché expressione dell&#39;interferone stimolato gene, p150 ADAR1. Questi saggi possono essere usati per confermare che l&#39;efficacia anti-HIV-1 RNA non è dovuto ad effetti indiretti sulla vitalità cellulare o attivazione del sensore immunitaria. Sono anche utili per escludere RNA candidati potenziali tossicità di ulteriore sviluppo. Nelle seguenti protocolli, le procedure per identificare nuovi RNA terapeutici e ottimizzare il formato di quelli esistenti sono descritti. I metodi sono utili per gli inibitori della post-integrazione a base di screening di RNA di HIV-1 replicazione e potrebbero essere adattati per lo screening altri inibitori post-integrazione, come ad esempio piccole molecole di targeting Rev esportazione mediata di RNA virale 18 o CRISPR / sistemi Cas progettato per indirizzare integrato HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubes Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Low molecular weight Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>transfection reagent for synthetic RNAs</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>transfection reagent for RNA expression plasmids</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poly(A) RNA template&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)&lt;sub&gt;12-18&lt;/sub&gt; DNA primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtermat paper&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Microplate scintillation counter</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Microplate spectrophotometer</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer tablets</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>protease and phosphatase inhibitors</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Gel running chamber</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Semi-dry transfer cell</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Protein ladder EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Antibody stripping solution</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>PI32106</td><td></td></tr><tr><td>ADAR1 antibody</td><td></td><td></td><td>from Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>phospho-T446-PKR antibody</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>phospho-S396-IRF3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR antibody</td><td></td><td></td><td>from Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Actin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-labeled goat anti-rabbit</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-labeled goat anti-mouse</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of the efficacy and toxicity of rnas targeting hiv-1 production for use in gene or drug therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Uno schema generale delle procedure è mostrata in figura 2 con un piano trasfezione esempio per tre RNA di prova e un RNA di controllo fornito in Figura 2B. Per i saggi di produzione e vitalità cellulare virali, la lettura per ciascun costrutto test è normalizzata a un controllo negativo. Replicati vengono trasfettati in serie, in modo che ogni RNA test viene normalizzato al suo controllo negativo adiacente. Questo viene fatto per evitare dati imprecisi relativi al tempo tra complessante e trasfezione, che può causare, ad esempio, tutti i controlli negativi sono trasfettate prima. Poiché HIV-1 può influenzare le risposte immunitarie 27,28, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione immunitaria vengono eseguite senza l&#39;aggiunta di un plasmide che esprime HIV-1. Per identificare la lunghezza ottimale di molecole di RNA interference mira un sito conservato in HIV-1 RNA (posizione 1498-141519 in HIV-1 ceppo NL4-3) 13, un insieme di siRNAs sono stati progettati (Figura 3A). Usando il test di produzione di HIV-1, la percentuale di attività RT rispetto alle cellule trasfettate con un lungo Dicer substrato dialogo siRNA (Sins) è stata calcolata per le cellule trasfettate con l&#39;siRNA test a diverse quantità di co-trasfezione con 100 ng di plasmide esprimente HIV-1 ceppo NL4-3 (Figura 3B). Usando il test di vitalità cellulare, il metabolismo cento di MTT è stata determinata per le cellule trasfettate con i siRNA più efficaci identificati nella Figura 3B. I dati sono stati normalizzati al metabolismo MTT in cellule trattate con il solo reagente di trasfezione (Figura 4). Una lunga RNA a doppia elica (Poly I: C) ha ridotto la vitalità delle cellule; Tuttavia, l&#39;effetto era significativo soltanto alla dose più elevata. No significativa riduzione della vitalità cellulare è stata osservata per siRNA targeting 1498 SI<html> te in HIV-1 RNA, indipendentemente dalla loro lunghezza. Usando il test di attivazione immunitaria, lo stesso insieme di RNA sono stati valutati per il loro potenziale per innescare risposte immunitarie (Figura 5). In condizioni in cui Poly I: C attivata l&#39;espressione di p150 ADAR1 e fosforilazione indotta di PKR e IRF3, alcun effetto significativo sui marcatori di attivazione immunitaria potrebbe essere osservata per una qualsiasi delle RNA di prova. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di passaggi pre e post-integrazione nel ciclo di replicazione dell&#39;HIV-1. Pre-integrazione (1-3) e post-integrazione (4-7) passi nel ciclo di replicazione di HIV-1 sono mostrati in scatole delineati . <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54486/54486fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54486 / 54486fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Schema della produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario. Cellule aderenti (A) Piastra e la cultura per 24 ore. Le cellule sono placcati in a 24, 96 e 12- pozzetti a 500, 100 e 1.000 ml di mezzi di coltura cellulare per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario, rispettivamente. (B) Preparare le provette di trasfezione, le cellule trasfezione, e la cultura per 48 ore. Un piano esempio trasfezione per una serie di tre test (RNA RNA1-3) viene mostrato con controlli appropriati. La procedura di transfezione è anche illustrata. (C) Leggi-out. La presenza di un letto per la produzione virale, la vitalità delle cellule e saggi di attivazione del sistema immunitario sono scritti e ha spiegato in dettaglio nelle sezioni 2, 3 e 4, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54486/54486fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig3.jpg" /> Figura 3. Effetto di siRNA di test per l&#39;HIV-1 di produzione. (A) Progettazione di siRNA con lunghezze e simmetrie differenti. Una sequenza conservata in HIV-1 RNA (1498 sito di destinazione) è stato utilizzato per la progettazione di siRNA simmetrici e asimmetrici (si1498-) con diverse lunghezze (da 17 a 29 fili nucleotide senso). Il senso atteso (in alto, nero) e antisenso (in basso, rosso) filamenti sono indicati. (B) L&#39;inibizione del virus HIV-1 produzione varianti di lunghezza si1498. La percentuale (%) di inibizione di HIV-1 RT nel supernatante di cellule trasfettate con HEK293T varianti di lunghezza si1498 simmetriche o asimmetriche è mostrato relativamente ad una lunga substrato Dicer dialogo siRNA (Sins). Ogni RNA test è stato confrontato Sins a dosi differenti in almeno due trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressed come valori medi ± mezzi di errore standard (SEM). Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54486/54486fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto di lunghezza si1498 varianti sulla vitalità cellulare HEK293T cellule sono state trasfettate con poli I:. C a 50 e 200 mcg / ml (PIC50 e PIC200) e lunghezze diverse e formati di si1498 a 100 nM. Il metabolismo% di MTT è stata determinata rispetto alle cellule trattate con solo il reagente di trasfezione (Mock, M) in tre trasfezioni indipendenti con due o tre repliche. I dati sono espressi come valori medi ± SEM. studenti spaiato t-test sono stati utilizzati per determinare se il diverso trasfezioni significantly (*, P &lt;0,05) ridotta vitalità cellulare rispetto alle cellule transfettate finta. Questa cifra è stata modificata da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54486/54486fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54486/54486fig5.jpg" /> Figura 5. Effetto della lunghezza si1498 varianti sulle risposte immunitarie innate. HEK293T cellule sono state trasfettate con PIC50, PIC200 e diverse lunghezze e formati di si1498 a 100 nM. L&#39;attivazione di PKR e TLR3 sono stati valutati misurando PKR fosforilata e IRF3, rispettivamente. L&#39;espressione di un interferone gene stimolato (ISG) è stata valutata misurando i livelli di P150 ISG ADAR1 relativi alla variante costitutivamente espresso, P110 ADAR1. L&#39;espressione di actina è stata utilizzata come controllo di caricamento. Questo figure è stato modificato da 16, copyright American Society for Microbiology. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54486/54486fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome di Buffer / reagente </td><td> Composizione </td></tr><tr><td> Cocktail interruzione virale </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 1% NP-40. </td></tr><tr><td> cocktail radioattivo </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 10 ug / ml Poly (A), 0,33 mg / ml oligo dT. Aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32 P] dTTP (3000 Ci / mmol) Per ogni 500 ml di cocktail. </td></tr><tr><td> Radioactive / virale cocktail perturbazione </td><td> 60 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,8), 75 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1,04 mM EDTA, 0,1% NP-40, 5 mg / ml poli (A), 0,16 mg / oligo ml it. Aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso: 8 mm ditiotreitolo (DTT, C 4 H 10 O 2 S 2) e 5 ml [32] P dTTP (3000 Ci / mmol) per ogni 1 ml di cocktail. </td></tr><tr><td> 2x SSC </td><td> 17.53 g NaCl e 8,82 g di sodio citrato - 2H 2 O in 1 LH 2 O. </td></tr><tr><td> tampone di lisi </td><td> 50 mM Tris-HCl (da 1 M Tris-HCl, pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA (da 0,5 M, pH 8,0), 10% v / v di glicerolo, 1% v / v NP-40. </td></tr><tr><td> Ponceau S </td><td> 2.5 g Ponceau S e 5 ml di acido acetico in 500 ml di H 2 O. </td></tr><tr><td> TBST </td&gt; <td> 6,05 g Tris, 8,76 g di NaCl e 1 ml di Tween 20 in 1 LH 2 O. </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Componenti del buffer non commerciali e reagenti Ricette per tutti i buffer non commerciali e reagenti sono forniti.

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Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  Lady Davis Institute for Medical Research. Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones. 

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Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus replication. Here we present the application of this technology to uncovering host targets that specifically modulate the replication of Maraba virus, an oncolytic rhabdovirus, and vaccinia virus with the goal of enhancing therapy. While the protocol has been tested for use with oncolytic Maraba virus and oncolytic vaccinia virus, this approach is applicable to other oncolytic viruses and can also be utilized for identifying host targets that modulate virus replication in mammalian cells in general. This protocol describes the development and validation of an assay for high-throughput RNAi screening in mammalian cells, the key considerations and preparation steps important for conducting a primary high-throughput RNAi screen, and a step-by-step guide for conducting a primary high-throughput RNAi screen; in addition, it broadly outlines the methods for conducting secondary screen validation and tertiary validation studies. The benefit of high-throughput RNAi screening is that it allows one to catalogue, in an extensive and unbiased fashion, host factors that modulate any aspect of virus replication for which one can develop an in vitro assay such as infectivity, burst size, and cytotoxicity. It has the power to uncover biotherapeutic targets unforeseen based on current knowledge.

Here we describe a protocol for employing high-throughput RNAi screening to uncover host targets that can be manipulated to enhance oncolytic virus therapy, specifically rhabodvirus and vaccinia virus therapy, but it can be readily adapted to other oncolytic virus platforms or for discovering host genes that modulate virus replication generally.

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

High-throughput genome-wide RNAi (RNA interference) screening technology has been widely used for discovering host factors that impact&#160;virus ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Immunologia e infezioni

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

DNA Vector-based RNA Interference per studiare la funzione del gene in Cancro

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Medicina

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Biologia

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Regolamento MicroRNA basata su Picornavirus Tropismo

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. Although combinational antiretroviral therapy (cART) has been successful in suppressing viral replication, it cannot completely eradicate the reservoir from HIV-infected individuals. A safe and effective cure strategy for HIV infection will require multipronged methods, and therefore the advancements of animal models for HIV-1 infection are pivotal for the development of HIV cure research. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection. The humanized mouse model can be infected by HIV-1 and viral replication can be controlled with cART regimens. Moreover, cART interruption results in a prompt viral rebound in humanized mice. However, administration of cART to the animal can be ineffective, difficult, or toxic, and many clinically relevant cART regimens are unable to be optimally utilized. Along with being potentially unsafe for researchers, administration of cART by a commonly used intensive daily injection procedure induces stress by physical restraint of the animal. The novel oral cART method to treat HIV-1 infected humanized mice described in this article resulted in suppression of viremia below the detection level, increased rate of CD4+ restoration, and improved overall health in HIV-1 infected humanized mice.

This protocol describes a novel method to deliver oral combinational antiretroviral drugs that successfully suppress HIV-1 RNA replication in humanized mice.

Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1

The human immunodeficiency virus (HIV-1) pandemic continues to spread unabated worldwide, and currently, there is no vaccine available against HIV. ...

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l'uso in gene terapia farmacologica

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