Name: development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact at JoVE.com

This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB: Ciascuna delle seguenti operazioni deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare come richiesto per colture cellulari di mammifero. Inoltre, le linee guida generali per la coltivazione ottimale delle cellule sterili si applicano, ad esempio., Scartando consigli ogni volta che possono portare a contaminazione incrociata, riducendo la quantità di cellule di tempo sono esposti all&#39;aria durante l&#39;esecuzione di interi cambiamenti dei media, correttamente, ma con delicatezza mescolando sospensioni cellulari per garantire la loro dispensazione omogeneo, ecc Inoltre, gli inserti sono una sorta di plasticware che richiedono un trattamento speciale. In primo luogo, ogni volta che gli inserti sono manipolati, evitare di toccare la membrana fragile, che strappa facilmente e potrebbe quindi compromettere l&#39;esperimento. Inoltre, non è adatto per eseguire l&#39;aspirazione sotto vuoto del mezzo di coltura cellulare, in quanto vi è il rischio di perforazione della membrana o dissociare cellule aderenti. Successivamente, inserti pendere nella piastra di coltura tissutale pozzetti e, pertanto, deve essere posta attenzione quando moVing il Plasticware o durante la dispensazione per evitare di dissociare cellule aderenti. Inoltre, quando si usano inserti di grandi dimensioni dei pori, c&#39;è una possibilità che il mezzo di coltura cellulare filtra attraverso la membrana e, quindi, è importante monitorare frequentemente il livello del liquido. Infine, si noti che il seguente protocollo è progettato per cellule aderenti e richiede piccole modifiche per essere adatto per cellule in sospensione. 1. Linee guida generali per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura di inserimento <ol><li> Semina tipo di cellula # 1 a inserti <ol><li> Scartare gli inserti dalla confezione. </li><li> Posizionare gli inserti in una piastra di coltura tissutale pozzetti vuota della dimensione corretta. Per fare ciò, afferrare il bordo superiore dell&#39;inserto usando pinzette. </li><li> Per migliorare l&#39;attaccamento e la diffusione di cellule aderenti, condizionare gli inserti con terreno di coltura cellulare prima della semina. Per fare ciò, coprire l&#39;intera superficie della membrana con coltura cellulare medium con una micropipetta. NOTA: Fate questo per il maggior numero di inserti, come richiesto. </li><li> Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare per almeno 1 ora o O / N alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li><li> Quando gli inserti sono condizionati, rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare utilizzando una micropipetta. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> tipo di cellula Seed # 1 nel terreno di coltura fresco nello stesso modo come in una piastra multipozzetto. Per fare ciò, disegnare un appropriato volume di sospensione cellulare con una micropipetta e dispensare il liquido nell&#39;inserto. NOTA: Preparare come molti inserti come richiesto. </li><li> Dopo la semina tutti gli inserti, oscillare delicatamente la piastra destra e sinistra, poi avanti e indietro in modo da distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare di fare movimenti circolari, ciò causerebbe le cellule a accumulano nel centro degli inserti. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare come specificato per i requisiti cellulari (normalmente 37 ° C, 5-10% CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Semina tipo di cellula # 2 in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> tipo di cellula Seed # 2 nel terreno di coltura fresco secondo il punto 1. </li><li> Preparare come molti pozzi come richiesto per il numero di inserti. Oscillare la piastra come al punto 1.1.7), al fine di garantire che le cellule sono equamente distribuiti nei pozzetti. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li></ol></li><li> media rinfrescante in inserti <ol><li> Usando una micropipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare, negli inserti contenenti tipo cellulare # 1. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. riposare delicatamente la punta sulla parete interna dell&#39;inserto e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare secondo passo 1.1.4. </li></ol></li><li> media rinfrescante in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> Utilizzando un MICROPIpipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare nei pozzetti contenenti tipo cellulare # 2. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. Posizionare la punta sulla parete interna del canale e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare secondo protocolli di coltura cellulare precedentemente stabiliti. </li></ol></li><li> Trasferimento di inserti contenenti tipo di cellula # 1 a piastre di coltura tissutale pozzetti contenenti tipo di cellula # 2. NOTA: Eseguire questo passaggio quando entrambi i tipi di cellule hanno raggiunto la fase di crescita adeguato. <ol><li> Prima di trasferire gli inserti nei pozzetti, apportare le necessarie modifiche medie, come precedentemente descritto ai punti 1.3) e 1.4). NOTA: A questo punto, è importante dispensare i volumi appropriati di supporto in entrambi i compartimenti, come specificato da istruzioni del produttore dell&#39;inserto. </li><li> Con una pinzetta, afferrare il bordo superiore di un inserto contenente cellule Tipo 1 # e delicatamente posizionarlo nella appropriata pozzetto contenente tipo di cellula # 2. </li><li> Dopo aver trasferito tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d&#39;aria sotto la membrana di inserti. NOTA: Le bolle d&#39;aria impediscono qualsiasi scambio attraverso la membrana dell&#39;inserto e possono compromettere l&#39;intero esperimento. </li><li> Se le bolle d&#39;aria sono presenti, sollevare molto delicatamente l&#39;inserto dal bene con una pinzetta e immergersi di nuovo nel mezzo di coltura cellulare. Le bolle spariranno. Se sono ancora presenti, provare delicatamente immergendo inserti di nuovo nel mezzo di coltura cellulare in un angolo. NOTA: Non battere o mescolare gli inserti per evitare di dissociare cellule aderenti. </li><li> Dopo aver rimosso tutte le bolle d&#39;aria e controllare che i volumi di media in entrambi i comparti, posizionare il coperchio sulla piastra e incubare. </li></ol></li><li> mezzi rinfrescanti in un sistema di co-coltura NOTA: Anche se la membrana consente facilmente gli scambi multimediali tra inserto e ben, rinfrescante il medium è fatto inentrambi i comparti Poiché il tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio nei vani superiori e inferiori da sola diffusione possono essere piuttosto lungo. <ol><li> media rinfrescante in inserti contenenti tipo cellulare # 1 viene effettuata nello stesso modo come nel punto 1.3). </li><li> Per aggiornare medie pozzetti contenenti tipo di cellula # 2, far scorrere delicatamente l&#39;inserto di lato per creare uno spazio abbastanza ampio per ospitare una punta della pipetta. Aggiornare il medium come al punto 1.4). </li><li> Controllare la presenza di bolle d&#39;aria e verificare i volumi come per gradini 1.5.3) attraverso 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Esempio: misurare gli effetti delle citochine secrete da microglia N9 LPS-attivati ​​sulle cellule neuronali PC12 NOTA: Le seguenti operazioni sono progettati per specifiche pallone, bene e dimensioni del piatto. Tuttavia, il protocollo può essere personalizzato per qualsiasi dimensione plasticware. Per i media e la composizione vedi Materiali Tavolo. <ol><li> Semina e differenziazione delle cellule PC12 in multie piastre di coltura tissutale <ol><li> mezzo di coltura cellulare PC12 routine di riscaldamento, PC12 terreno di differenziamento e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Utilizzare cellule PC12 al 60-80% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Con di 15 mm pipetta Pasteur, effettuare l&#39;aspirazione a vuoto dell&#39;intero mezzo di coltura cellulare nel pallone. </li><li> Lavare delicatamente il monostrato cellulare con 5 ml di sterile tampone fosfato e rimuovere il liquido con una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non dissociare le cellule in questa fase. </li><li> Coprire il monostrato cellulare con 3 ml di tripsina-EDTA e incubare per 2-3 minuti a 37 ° C. </li><li> Assicurarsi che tutte le cellule sono staccati al microscopio. Se pochissime cellule sono flottanti, incubare per un periodo più lungo per un massimo di 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine al fine di inattivare la tripsina-EDTA. </li><li> Con una pipetta 10 ml, triturare delicatamente facendo in modo che la maggior parte delle cellule sono dissociate dal basso of matraccio. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> Con la stessa pipetta 10 ml, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione 50 ml. </li><li> Centrifugare per 1 min a 3.200 xg </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare PC12 routine con una pipetta 10 ml. NOTA: Questo volume può essere regolato se il pellet è insolitamente piccolo o grande. </li><li> Triturare con la stessa pipetta 10 ml per omogeneizzare il pellet. cellule PC12 spesso si raggruppano in modo almeno il 20 pipettando su e downare necessario. NOTA: Durante la triturazione vigorosa è necessario, evitare di creare bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> In una provetta da 1,5 ml, preparare una diluizione appropriata di sospensione cellulare in blu trypan. Contare le cellule utilizzando un emocitometro secondo protocolli stabiliti in precedenza 74. </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellularecon terreno di differenziamento PC12 per ottenere una sospensione appropriata diluite per semina pozzetti di una piastra da 24 pozzetti (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per pozzetto secondo il protocollo del produttore). NOTA: Il 24-pozzetti deve essere preventivamente rivestito con collagene, come specificato dai protocolli stabiliti in precedenza 75. </li><li> Distribuire 0,6 ml della sospensione di cellule per pozzetto con una micropipetta. </li><li> Quando tutti i pozzi sono testa di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Per consentire il corretto differenziamento delle cellule PC12, incubare le piastre a 24 pozzetti per 7-9 giorni a 37 ° C in atmosfera umida 5% CO 2 in PC12 differenziazione medio 15,16 prima di eseguire esperimenti di co-coltura. </li><li> Eseguire modifiche medie a giorni rimuovendo la metà del liquido e la sua sostituzione con un uguale volume di terreno di differenziamento PC12 fresco. </li></ol></li><li> Semina microglia N9 negli inserti e trattare con LPS <ol><li> Un giorno prima di effettuare degli esperimenti di co-coltura, pre-trattamento di PTFE 0,4 inserti micron-pori con routine di terreno di coltura cellulare N9 per ottimizzare l&#39;aderenza delle cellule, seguendo i punti 1.1.1) attraverso 1.1.4) </li><li> Warm medio di routine N9 coltura cellulare e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Nel frattempo, pesano circa 10 mg di LPS in una provetta da 1,5 ml per un uso successivo. NOTA: Dal momento che LPS è un potente endotossine pro-infiammatorio e richiede particolari precauzioni di sicurezza, occhiali, guanti, e un respiratore per particolati sono fortemente raccomandato. </li><li> Utilizzare le cellule N9 a 80-90% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Seguire i passaggi 2.1.3) a 2.1.14). Usare sempre terreno di coltura cellulare N9 di routine, invece di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine. Si noti inoltre che la microglia N9 non si aggregano insieme tanto quanto le cellule PC12 fanno, in modo meno pipettando su e giù possono essere necessarie al punto 2.1.13). </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellulare con terreno di coltura cellulare N9 per obtain una sospensione cellulare diluita appropriato per la semina inserti progettati per tenere in piastre da 24 pozzetti (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inserto secondo il protocollo del produttore, per superficie della membrana vedere le informazioni del produttore). NOTA: Questi inserti sono già rivestiti con collagene dal produttore e sono ottimizzati per l&#39;adesione cellulare. </li><li> Distribuire 0,05 ml della sospensione cellulare per inserto utilizzando una micropipetta. </li><li> Quando tutti gli inserti sono teste di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Eseguire diluizioni seriali di LPS utilizzando terreno di trattamento N9 per ottenere 4 mg / ml, 2 mg / ml e / ml soluzione di lavoro 1 mg. </li><li> Pipettare 0,05 ml di 4 mg / ml soluzione di lavoro in un set di inserti per produrre una diluizione finale di 2 mg / ml. </li><li> Ripetere il passaggio 2.2.10) per le altre due soluzioni di lavoro in diversi inserti set, ottenendo diluizioni finali di 1 mg / ml e 0,5 mg / ml, rispettivamente. </li><li> Incubate le piastre contenenti gli inserti per 24 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5% per consentire N9 microglia attivazione con LPS prima di eseguire degli esperimenti di co-coltura. </li></ol></li><li> Co-coltivando cellule PC12 neuronali con microglia N9 <ol><li> A 7-9 giorni di differenziazione delle cellule PC12, attivare le microglia N9 dopo 24 ore di incubazione con LPS di terreno di trattamento N9 calda e terreno di trattamento PC12 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per microglia N9 come al punto 1.3), sostituendo l&#39;intero mezzo utilizzato da 0,1 ml di terreno di trattamento N9. Fate questo per ogni insert.This è necessario rimuovere tutte le tracce di LPS, lasciando microglia N9 solo attivati ​​negli inserti. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per le cellule neuronali PC12 come al punto 1.4). Trasferire gli inserti nelle piastre da 24 pozzetti come al punto 1.5) .Incubate co-colture N9-PC12 per 24 ore o 48 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5%. </li><li> dopo 24hr o 48 hr, raccogliere il surnatante e / o le cellule per la citotossicità, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), Western Blot, o di altri test. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La fase più critica di esperimenti sistema inserto co-coltura effettivamente abita nello scegliere l&#39;inserto corretto di utilizzare. Dimensione dei pori e materiale della membrana devono essere presi in considerazione approfondita, senza dimenticare di considerare il tipo di cellule che saranno seminate e lo scopo dell&#39;esperimento. Per esempio, saggi chemiotassica possono utilizzare lo stesso tipo di membrana di co-colture cellulari per analizzare modulazioni comportamento cellulare indotta da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula. Tuttavia, entrambi i tipi di esperimenti richiedono diverse dimensioni dei pori: quelli più grandi per il primo, per consentire la migrazione cellulare, e quelli più piccoli per quest&#39;ultimo, per impedire la migrazione cellulare e il contatto cellula-cellula. Per la valutazione di cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula, poro dimensioni di 0,4 micron o 3 micron sono solitamente appropriate in quanto consentono di grandi molecole, quali proteine, attraversare ma prevenire la maggior parte delle cellule da fare così. Membranamateriale dipende in larga misura dal tipo di cellula e le tecniche da utilizzare al fine del protocollo coltura cellulare. Brevemente, membrane PET offrono una buona visibilità cella come sono chiari ma non sono rivestite collagene, che può essere un problema per cellule aderenti quello richiesto per il supporto da trattare. Essi hanno anche la migliore resistenza chimica a fissativi che, accanto alle loro buone proprietà ottiche, li rende ideali per gli studi istologici. D&#39;altra parte, membrane PC offrono scarsa visibilità cella come sono traslucide e non sono collagene rivestite. Tuttavia, essi possiedono la più alta densità di pori e la disponibilità più diversificata di dimensioni dei pori. Infine, le membrane in PTFE sono chiare quando bagnato ma consentono solo la visualizzazione di cellule delinea nel microscopio. Come un vantaggio importante, essi sono collagene rivestite, che li rende anche un po &#39;più spessa. È importante notare che il rivestimento inserti PET o membrana PC con collagene può ostruire i pori e impedire il passaggio di solubile factoRS. In ogni caso, la maggior parte dei produttori inserto offrono guide complete per assistere ricercatori nel selezionare l&#39;inserto corretto. Nel nostro paradigma specifico, le scelte di densità di placcatura, i media, la concentrazione sierica, giorni di differenziazione, giorni di attivazione LPS, le concentrazioni di LPS, e rivestimento dei flaconi per cellule PC12 sono stati ottimizzati in anni di lavoro con questi sistemi co-coltura 15 , 16. Degno di nota, la densità di placcatura della microglia N9 negli inserti stato scelto a 60.000 ¢ / cm 2 al fine di ottenere il 40-50% di confluenza al momento di iniziare la co-coltura e, quindi, per dare loro spazio di moltiplicare sulla loro attivazione da LPS. Altre condizioni ottimali quando può anche portare a risultati soddisfacenti, come ad esempio la sostituzione di collagene da L-lisina nei palloni destinati per la manutenzione PC12 nativo. Per aumentare la sostenibilità dei risultati, diversi controlli diversi possono essere eseguite. Quando si cerca di dimostrare che i fattori solubilisono responsabili degli effetti osservati, colture miste manifestano contatto diretto cellula-cellula e gli esperimenti mezzo condizionato dovrebbero essere condotti in parallelo. Inoltre, facendo uso di anticorpi per neutralizzare un fattore secreto specifico aiutare a identificare la molecola responsabile dell&#39;effetto paracrino che è percepito. Quando possibile, bloccare un recettore o di una parte del suo percorso di segnalazione per individuare l&#39;esatta identità del recettore in fase di attivazione. Se una molecola viene utilizzato per attivare una popolazione cellulare prima dell&#39;esperimento co-coltura con un secondo tipo di cellule, come nell&#39;esempio descritto in precedenza, è importante prendere in considerazione la presenza della molecola nel sistema. Come prima opzione, il terreno deve essere completamente modificato prima dell&#39;esperimento co-coltura per assicurare che la molecola è assente dal sistema del tutto. Come seconda opzione, una condizione deve essere aggiunto in cui la molecola sola viene incubato con il secondo tipo di cella pervalutarne l&#39;effetto in assenza del primo tipo di cellula. Se non vi è alcun effetto della molecola sul secondo tipo di cellule, non vi sarà alcuna necessità di cambiare il mezzo prima dell&#39;esperimento co-coltura. Allo stesso modo, se entrambi i tipi cellulari non sono coltivate nello stesso mezzo di coltura cellulare, devono essere prese precauzioni simili per assicurarsi che le differenze di composizione media non influiscono una o l&#39;altra popolazione cellulare. Sebbene entrambi i supporti saranno separati dalla membrana inserto in un primo momento, la diffusione è destinata a garantire che essi si mescoleranno per periodi di incubazione più lunghi. Inoltre, diversi problemi possono derivare da interruzioni aberrante di solubili rapporti fattore-recettore. Tra diverse cause di errore, l&#39;uso eccessivo di dissociazione enzimatica e la presenza di importanti concentrazioni di siero possono interferire con i recettori della superficie cellulare. Altre cause di errore nei sistemi inserto co-coltura includono, ma non sono limitati a 1) improprie tecniche di coltura cellulare, come ad esempio la rimozione della totalità della cellamezzo di coltura in troppi pozzetti contemporaneamente causando cellule per asciugare, 2) un monostrato che è troppo confluenti nell&#39;inserto, responsabile per sigillare la membrana inserto e prevenire molecole apicalmente-secrete per raggiungere il vano inferiore, e 3) mal regolato confluenza delle cellule, che causa un espressione sotto-sovra o di fattori solubili che portano a risultati fisiologicamente irrilevanti o assenza di qualsiasi effetto. Mentre solo uno scenario inserto co-coltura è stata presentata qui, ci sono numerosi modi per fare uso di questa tecnica molto versatile. Qui, un tipo di cellule sono state pretrattate con una molecola responsabile per indurre la secrezione di un fattore solubile che, in caso di trasferimento l&#39;inserto al pozzo, influisce sul comportamento del secondo tipo di cellula. È anche possibile incubare entrambi i tipi cellulari insieme in un sistema di co-coltura prima di separare loro di rilevare la maggiore vulnerabilità o la resistenza di popolazioni una o entrambe le cellule ad un trattamento ulteriore. HoWever, se si considera la sua forma più rudimentale, questa tecnica può fare uso di due popolazioni di cellule incubate insieme senza alcun trattamento, con l&#39;obiettivo di valutare basale segnalazione reciproca paracrina. Il limite più importante di questa tecnica è che entità molecolari molto breve durata come le specie reattive dell&#39;ossigeno non sopravvivono la distanza che separa la popolazione di cellule in crescita nel vano superiore e quella nel vano inferiore 82. L&#39;ultimo sviluppo nelle tecniche di co-coltura ha cercato di rispondere a questo problema utilizzando un substrato di cultura microfabbricazione in grado di mantenere due popolazioni cellulari in prossimità microscala 83. Oltre a portare tutti i vantaggi dei sistemi inserto co-coltura, come il rilevamento specifico frazione di cambiamenti e segnalamento bidirezionale, è stato anche dimostrato questa schermata microfabbricazione per rendere possibile il rilevamento di interazioni a corto raggio che non erano prima detectable a causa del decadimento di fattori solubili su distanze. Questa piattaforma coltura cellulare è l&#39;ultima innovazione in co-coltura cellulare e promette di aiutare a svelare i meccanismi tra le cellule che sono stati trascurati prima segnalazione.

Lo studio dei tessuti, organi o sistemi in vitro è un tentativo di semplificare le molto complesse relazioni esistenti fra i vari sottotipi cellulari che compongono organismi multicellulari. Infatti, gli studi in vitro permettono di acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di cellule singole. Ci sono due principali vantaggi di condurre esperimenti in vitro: 1) riduzione interazioni cellulari, e 2) la capacità di manipolare facilmente l&#39;ambiente cellulare. Scienziati Quindi, questi due vantaggi hanno consentito di prevedere il comportamento di specifici tipi cellulari in vivo, che porta alla capacità di regolare risultati delle influenze estrinseche in organismi interi. In questo senso, colture cellulari in vitro spesso funziona come un ponte che collega le scienze di base e applicate vita. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi di lavorare in vitro, il più importante dei quali è che una certa riserva può dimorare nella fisiologicaAl rilevanza di fenotipi osservati. In effetti, quando un unico tipo di cellula è coltivato in un vaso, la cultura perde, a diversi livelli,, le sue connessioni cellula-cellula con altri tipi di cellule, il suo contributo per l&#39;ambiente umorale dal tessuto e organismo di origine, e le ancore all&#39;interno il tessuto che ha permesso di sostenere una particolare struttura tridimensionale volte cruciale per la funzione delle cellule. La questione dei rapporti cellula-cellula è stato affrontato con lo sviluppo di tecniche di coltura mista. In questo metodo, due o più popolazioni di cellule sono coltivate insieme nello stesso recipiente di coltura. Tuttavia, queste culture miste sopportano disagi importanti. Da un lato, alcuni sottotipi di cellule non fisicamente interagiscono tra loro nei tessuti di origine e si basano esclusivamente sulle comunicazioni paracrini sostenute da fattori solubili secreti e recettori nelle vicinanze. Questo è il caso per diversi processi infiammatori che dipendono prossimale segnalazione di citochine. In misto cultures, interazioni fisiche sono inevitabili e rendono impossibile studiare le comunicazioni paracrini in assenza di contatti cellula-cellula che possono produrre risultati alterati. D&#39;altra parte, ottenendo interpretazioni specifiche delle celle all&#39;interno di una popolazione mista diventa irrealizzabile senza l&#39;uso di tecniche di separazione dure che potrebbero influenzare significativamente i risultati. Per risolvere questi problemi importanti, l&#39;uso dei mezzi condizionati è stata sviluppata come una tecnica che consente culture compartimenti e lo studio di segnalazione paracrina. Questo metodo richiede il trasferimento del surnatante di un tipo di cellula, medio così chiamato condizionata, di pozzetti contenenti un&#39;altra popolazione di cellule. Tuttavia, un importante inconveniente è che le molecole di breve durata non sopravvivono abbastanza a lungo nel mezzo condizionato da trasferire ai pozzetti della seconda popolazione di cellule. Anche le molecole lunghe durata sarà notevolmente diluiti nel tempo a causa di diffusione. Inoltre, sia cellulepopolazioni partecipano solo in comunicazione paracrina unidirezionale, piuttosto che nella comunicazione bidirezionale attiva. Questo porta alla mancanza di segnale di retroazione che è vitale per ricreare rapporti multicellulari accurate come esistono in vivo. Di conseguenza e guidato dalla necessità di meglio simulare l&#39;originale in condizioni in vivo l&#39;ambiente cellulare in vitro, diverse progressi nelle tecniche di coltura cellulare sono stati ottenuti nel corso degli anni. Uno dei progressi più significativi è stato l&#39;uso di supporti permeabili con membrane microporose di compartimentazione colture cellulari, utilizzate per la prima volta da Grobstein nel 1953 1. Tali supporti permeabili sono stati adattati negli anni per ospitare numerosi tipi di cellule e da utilizzare in diverse applicazioni. Oggi, questi supporti esistono inserti come cave che sono progettati per riposare in pozzetti di una piastra di coltura tissutale pozzetti o in circupiatti lar. In un sistema di co-coltura, l&#39;inserto contiene un tipo di cellule che pozzo o piatto contiene l&#39;altra popolazione cellulare, permettendo di studiare il contributo di due differenti popolazioni di cellule sul loro ambiente umorale (Figura 1). Come risultato, la polarità cellulare (basolaterale vs secrezione apicale o ricezione del segnale) è conservato, conferendo sistemi inserto co-coltura un importante vantaggio rispetto colture miste e tecniche mezzo condizionato. Diversi tipi di materiali membrana sono disponibili, i più comuni sono poliestere (PET), policarbonato (PC) o collagene rivestite con politetrafluoroetilene (PTFE), ed esistono in diverse dimensioni dei pori da 0,4 micron a 12,0 micron. Queste varietà di materiali e dimensioni dei pori offrono una gamma di inserti che esercitano funzioni di variabili rilevanti per le proprietà ottiche, spessore della membrana e l&#39;adesione delle cellule che li rendono pratici a livelli diversi per i seguenti usi non limitato a: -studiandola differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, metastasi tumorali e la riparazione delle ferite mediante saggi chemiotassica attraverso membrane permeabili; -evaluating penetrazione farmaco, valutando il loro trasporto attraverso monostrati epiteliali o endoteliali in coltura su supporti permeabili, e; -Esecuzione co-colture di cellule di analizzare modulazioni il comportamento delle cellule indotte da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula. Lo scopo di questo articolo è descrivere orientamenti metodologici generali per compiere la terza funzione sopra indicato, che è di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula con un sistema di inserimento co-coltura. Diversi campi di ricerca fanno uso di sistemi inserto co-coltura per rispondere a domande relative all&#39;effetto di fattori solubili secreti su popolazioni di cellule. Infatti, segnalazione paracrina che modula comportamento cellulare a vari livelli è pertinente in tutti i tessutie sistemi, il che rende i sistemi di co-coltura inserto indispensabile per assicurare progressi in questi campi. Al contrario, l&#39;utilizzo di inserti può confermare che il segnale di trasduzione è attraverso il contatto diretto cellula-cellula e non da fattori secreti. Uno degli usi più importanti di inserti è in studi infiammazione 2-14 in cui l&#39;effetto di citochine secrete viene valutato in vari giocatori cellulari di immunità. In particolare, lo studio di infiammazione nel sistema nervoso centrale (SNC) ha notevolmente beneficiato da studi inserto co-coltura, che hanno permesso di definire meglio i ruoli paracrini distinti di neuroni e microglia nel guidare neuroinfiammazione 15-21. Questi sistemi sono stati concepiti per studiare il potenziale anti-infiammatorio di molecole che si basa sulla loro capacità di ridurre o inibire la secrezione di fattori pro-infiammatori 22-26. La ricerca di pertinenza di cancro 27-31, in particolare i meccanismi alla base dell&#39;angiogenesi 32-34 e inflammatisul 35-42 nella tumorigenesi, beneficia anche di sistemi di inserti co-coltura. Inoltre, fattori solubili sono di primaria importanza nei processi che guidano la differenziazione e diversi studi hanno usato gli inserti di rispondere alle domande in quel particolare settore 43-50. Nel SNC, visto che tessuto neurale ha un potenziale rinnovamento molto limitato, lo studio di neurotrophism e neuroprotezione è fondamentale ed è stato ampiamente garantita dall&#39;uso di cellule staminali in sistemi di co-coltura 51-56. Inoltre, gli inserti sono utilizzati anche in settori diversi come nefrologia 57,58, interazioni endoteliali e l&#39;angiogenesi 59-62, apoptosi segnalazione 63-65, infiammazione di obesità e sindrome metabolica 22,23,66-67, orecchio interno di protezione delle cellule dei capelli 68,69, e anche in funghi virulenza 70,71 e parassitologia 72,73. Questo articolo offre indicazioni metodologiche generali al fine di istituire un sperimento in vista di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti che utilizzano un sistema di inserimento co-coltura. In particolare, ci concentreremo la nostra attenzione su co-colture di cellule nervose e il loro uso nello studio processo neuroinfiammatorio. Data la vasta gamma di esperimenti che inserisce rendere possibile pilota, è insopportabile per coprire ogni aspetto di questa tecnica di coltura cellulare. Come esempio, un protocollo specifico per misurare gli effetti di citochine secrete da lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia N9 su cellule PC12 neuronali sarà dettagliato, offrendo una comprensione concreta della metodologia inserto co-coltura.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&amp;ndash;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from&amp;nbsp;Escherichia coli&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts for use with 24-well plates</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Coat with collagen before use</td></tr><tr><td>Routine PC12 cell culture medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 cell culture medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiation medium</td><td></td><td></td><td>N9 treatment medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL nerve growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 treatment medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

L&#39;utilizzo di sistemi di inserti co-coltura è particolarmente pertinente nello studio dei processi neuroinfiammatori che mettono in risalto le relazioni tra i diversi attori paracrini cellulari del sistema nervoso centrale. Immunità nel sistema nervoso centrale avviene principalmente dalle cellule residenti chiamate microglia che monitorano l&#39;ambiente nel loro riposo stato ramificata (Figura 2A) e sono in grado di disturbi di rilevamento che potrebbero turbare la preziosissima omeostasi necessarie per il corretto funzionamento neuronale 76-78. Attivazione della microglia, caratterizzato dall&#39;adozione di una forma ameboide (Figura 2B) e la moltiplicazione della popolazione cellulare definito microgliosis (figura 3), seguita dal rilascio di mediatori pro-infiammatori, come le citochine, costituisce l&#39;aspetto principale della neuroinflammation 79 . rilascio di citochine serve il nobile scopo di proteggere i neuroni contro gli attacchi nocivi ed è closely monitorato. Tuttavia, quando neuroinflammation sfugge questo controllo stretto, adotta una natura distruttiva e può ferire gravemente il sistema nervoso centrale. Poiché tessuti neurali hanno un potenziale rinnovamento molto limitata, il CNS è tanto più suscettibili a tali risposte infiammatorie auto-distruttiva. Lo studio della diafonia, che esiste tra i neuroni e microglia è indispensabile nel chiarire i meccanismi alla base della neuroinfiammazione. A differenza di culture miste, sistemi inserto co-coltura consentono al ricercatore di identificare quale popolazione cellulare sta generando gli effetti tossici e che uno è influenzato. Qui, le cellule PC12 differenziate per 7-9 giorni con il fattore di crescita dei nervi sono stati co-coltura con cellule microgliali N9 LPS-attivati ​​con l&#39;obiettivo di quantifyingthe effetti nocivi di fattori solubili infiammazione-derivati ​​sui neuroni. Per fare ciò, le cellule neuronali PC12 sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti mentre microglia N9 sono state seminate in inserti. N9 microgliun sono stati trattati per 24 ore con LPS, molto potente endotossina pro-infiammatorie comprese nelle membrane esterne di batteri gram-negativi. LPS è noto per attivare toll-like receptor 4 suscitando così una robusta risposta infiammatoria in un&#39;ampia varietà di cellule effettrici del sistema immunitario, compresa la immortalate murino linea cellulare N9 microglia 80,81. I seguenti risultati rappresentativi mostrano che microglia N9 attivati ​​con LPS hanno la tendenza ad aumentare la loro popolazione (Figura 3) ed a secernere citochine pro-infiammatorie solubili, come l&#39;interleuchina-6 (IL-6), interferone gamma (IFN-γ) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), che attraversano facilmente la membrana degli inserti co-coltura e causare danni citotossici per le cellule PC12 neuronali crescente nel vano inferiore. La preoccupazione principale prima di trasferire le microglia N9 LPS-activated ai pozzetti contenenti cellule neuronali PC12 consiste nel confermare that il PC12 siano correttamente differenziati. Cellule PC12 differenziate di sette giorni devono mostrare evidenti fenotipi neuronali, come un corpo cellulare piatta, che proietta diversi neuriti lunghi a volte si visualizzano varicosità (Figura 4). Una volta che questo punto di controllo viene eseguito, inserti microgliali N9 contenenti mezzo fresco privo di LPS possono essere trasferiti nei pozzetti contenenti PC12 differenziata. Dopo un periodo di incubazione di 24 ore o 48 ore, il surnatante nel vano inferiore viene raccolto e un saggio di citotossicità, sulla base del rilascio di lattato deidrogenasi 15,16, così come un ELISA 15, per misurare citochine vengono eseguite. È importante raccogliere il surnatante nel vano inferiore per misurare le citochine che hanno effettivamente attraversato la membrana permeabile e che possono attivare recettori presenti sulla superficie delle cellule PC12. I risultati dimostrano che LPS-activated microglia N9 dal vano superiore generano un citocromo dose e tempo dipendenteeffetto otoxic su cellule PC12 neuronali differenziate impostati nel compartimento inferiore (Figura 5). La condizione / ml LPS 0,5 mg non è però significativamente citotossica a 24 ore o 48 ore. I livelli di citotossicità sono state trovate per raggiungere quasi il 100% in 2 ug / ml LPS 48 condizione hr. Inoltre, i risultati mostrano che la concentrazione di citochine pro-infiammatorie IL-6, IFN-y e TNF-alfa nel surnatante aumenta simultaneamente con citotossicità osservata. In particolare, IL-6 concentrazioni sono significativamente aumentati dopo 24 ore solo per la condizione 2 ug / ml, mentre 1 ug / ml di LPS anche rendimenti livelli della citochina sollevate significativamente dopo 48 ore (Figura 6). Microglia secernono IFN-γ che raggiunge il vano inferiore in un aumento significativo del modo quando sono trattati con 1 mg / ml e 2 ug / ml, e sono incubati con cellule PC12 neuronali differenziate sia per 24 ore o 48 ore (Figura 7). Il 0,5 mg / mlcondizione di LPS, ancora una volta non aumenta i livelli di IFN-g in modo significativo. Infine, le concentrazioni di TNF-alfa nel vano inferiore sono stati quantificati da ELISA e sono stati trovati ad essere il più potenziata da LPS attivazione della microglia, raggiungendo livelli quasi sette volte più importante della condizione di controllo (Figura 8). In particolare, entrambi i periodi 24 hr e 48 ore di incubazione provocato importanti incrementi nei livelli di TNF-α nel surnatante. Tuttavia, il / ml LPS condizione 1 mg ha prodotto un significativo aumento dei livelli di TNF-α solo dopo 48 h. Nel complesso, questi risultati mostrano che le citochine pro-infiammatorie secrete sono almeno in parte responsabile degli effetti citotossici osservati in cellule PC12 neuronali differenziate dopo un periodo di incubazione 24 ore o 48 ore con microglia attivate da diverse concentrazioni di LPS. Inserire sistemi di co-coltura di cellule microgliali e PC12 N9 LPS-attivati ​​hanno dimostrato diparticolarmente utile nello studio della neuroinflammation e nell&#39;elaborazione di strategie per contrastare esso. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che LPS-activated microglia N9 cresciuti in coltura cellulare inserisce mostra un aumento della trascrizione di citochine pro-infiammatorie, che a loro volta inducono l&#39;apoptosi delle cellule PC12 fattore di crescita nervosa differenziate attraversando i micropori dell&#39;inserto 15, 16. Nello stesso paradigma, pre-trattamento della popolazione microglia con il resveratrolo composto polifenolico (0,1 pM, 3 hr) impedito la trascrizione di citochine pro-infiammatorie e apoptosi pertanto impedito di cellule PC12 neuronali differenziate bloccando caspasi-3 attivazione e, successivamente, , DNA scissione. Un altro gruppo ha anche dimostrato gli effetti neuroprotettivi della vitamina E in un N9-PC12 co-coltura 26. Oltre alla co-culture N9-PC12, diverse linee cellulari immortalizzate o colture primarie sono anche stati impiegati in un contesto di neuroinfiammazione. Ad esempio, lalinea di cellule microgliali BV2 murino è stato co-coltura con cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano per mostrare l&#39;effetto anti-apoptotico della luteolina polifenolico apparentemente mediata dal suo anti-infiammatorio potenziale 17. Come pure, microglia BV2 attivati ​​dalle cellule PC12 feriti sono stati dimostrato di esercitare effetti anti-apoptotici in cellule staminali mesenchimali 18. Segnalazione reciproco è stato dimostrato di essere importante nei meccanismi anti-apoptotici sottostante microglia primaria neuroprotezione conferitegli primari neuroni granuli cerebellari 19. Inoltre, neuroni ippocampali primari sono stati co-coltivati ​​con microglia primaria attivato da proteina precursore amiloide secreta per valutare il rilascio di glutammato per scambio cisteina e la conseguente indebolimento della funzione sinaptica 20. Infine, un gruppo ha anche mostrato il crosstalk che esiste tra i neuroni dell&#39;ippocampo primari e microglia primaria di competenza fractalkine segnalazione, a chemochine Expres costitutivamentesed dai neuroni nel sistema nervoso centrale il cui recettore si trova sulla superficie della microglia 21. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di un sistema di inserimento di co-coltura. Il vano superiore è composto dell&#39;inserto che contiene un tipo di cellula e il suo ambiente umorale apicale. Il vano inferiore è costituita da un pozzo o piatto contenente il secondo tipo di cella. L&#39;inserto poggia sui bordi della piastra di coltura tissutale pozzetti o piatto. L&#39;inserto è progettato per giacere appena sopra il fondo del pozzo in modo da non toccare la popolazione di cellule in crescita sotto. Il mezzo nel vano inferiore è in contatto sia con la superficie basale del primo tipo di cellula e la superficie apicale del secondo tipo di cellula. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un vers più grandi</a>ione di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig2.jpg" /> Figura 2. microfotografie della microglia N9. (A) non trattati di riposo microglia N9 in inserti presentano una morfologia cellulare ramificata che consente loro di monitorare attivamente il loro ambiente. (B) microglia N9 in inserti trattati con lipopolisaccaride (LPS) per 24 hr visualizzazione una forma ameboide tipica del fenotipo attivato. Questa microfotografia è stata presa poco prima di trasferire l&#39;inserto contenente questi microglia N9 attivato per i pozzetti contenenti cellule PC12 differenziate come illustrato in figura 4. Barra di scala = 25 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <imgalt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54356 / 54356fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. N9 densità delle cellule microgliali dopo trattamento con lipopolisaccaride (LPS). L&#39;effetto di trattare microglia N9 con diverse concentrazioni di LPS per differenti intervalli di tempo è stata valutata stimando il numero di cellule utilizzando un emocitometro 69. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l&#39;intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono state prese in considerazione 10 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (** p &lt;0.01). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un larg</a>versione er di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig4.jpg" /> Figura 4. microfotografie di cellule neuronali PC12 differenziate. Sette giorni di crescita nervoso fattore differenziato cellule neuronali PC12 mostrano evidenti fenotipi neuronali quali lunghe neuriti e varicosità. Questa microfotografia è stata presa poco prima di trasferire gli inserti contenenti microglia N9 attivati ​​come illustrato nella figura 2. Barra di scala = 25 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig5.jpg" /> Figura 5. effetto citotossico di lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia sulle cellule neuronali PC12 differenziate.microglia N9 state attivate con differenti concentrazioni di LPS per 24 h, quindi trasferiti in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. La citotossicità è stata valutata usando un saggio di rilascio di lattato deidrogenasi eseguita sul supernatante del vano inferiore. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l&#39;intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (*** p &lt;0.001). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 6. Concentrazione di i nterleukin-6 (IL-6) nel supernatante dopo l&#39;attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati ​​con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. IL-6 concentrazioni nel supernatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l&#39;intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra il trattamento e concondizione di controllo (*** p &lt;0.001, ** p &lt;0.01 e * p &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig7.jpg" /> Figura 7. Concentrazione di interferone gamma (IFN-γ) nel supernatante dopo l&#39;attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati ​​con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. Le concentrazioni di IFN-gamma nel surnatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi post-hoc di Tukey con il programma GraphPad Instat, versione 3.06per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l&#39;intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (** p &lt;0.01 e * p &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54356/54356fig8.jpg" /> Figura 8. Concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nel supernatante dopo l&#39;attivazione N9 da lipopolisaccaride (LPS). Microglia N9 stati attivati ​​con diverse concentrazioni di LPS per 24 ore, e poi trasferito in pozzetti contenenti cellule PC12 neuronali differenziate per 24 ore o 48 ore. TNF-αconcentrazioni nel supernatante del vano inferiore sono stati valutati utilizzando un test ELISA. Differenze significative tra i gruppi sono state accertate da una analisi della varianza, seguita da analisi di Tukey post-hoc con il programma GraphPad Instat, versione 3.06 per Windows (San Diego, CA; www.graphpad.com). Tutti i dati, analizzati con l&#39;intervallo di confidenza del 95%, sono espressi come media ± errore standard della media da 3 esperimenti indipendenti in cui sono stati considerati 6 pozzi. Gli asterischi indicano differenze statistiche tra la condizione di trattamento e di controllo (*** p &lt;0.001). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54356/54356fig8large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact at JoVE.com

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K Views.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Video: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living biobanks&#34; of patient derived cell lines. For many types of epithelial cells, various three dimensional (3D) culture approaches have been described that support an improved differentiated state. While CRCs retain their lineage commitment to the tissue from which they are isolated, they fail to express many of the differentiation markers associated with the tissue of origin when grown under normal two dimensional (2D) culture conditions. To enhance the application of patient-derived CRCs for prostate cancer research, a 3D culture format has been defined that enables a rapid (2 weeks total) luminal cell differentiation in both normal and tumor-derived prostate epithelial cells. Herein, a filter insert-based format is described for the culturing and differentiation of both normal and malignant prostate CRCs. A detailed description of the procedures required for cell collection and processing for immunohistochemical and immunofluorescent staining are provided. Collectively the 3D culture format described, combined with the primary CRC lines, provides an important medium- to high- throughput model system for biospecimen-based prostate research.

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Immunologia e infezioni

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Bioingegneria

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzato di co-coltura 3D a due strati per cellule epiteliali e fibroblasti

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento dei sistemi di cocoltura 3D con membrane nanofibrose PVA-PCL

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Biologia

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici