Name: unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples
Uploaded: 2016-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
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This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

dichiarazione etica: pazienti febbre di Lassa sono stati reclutati per questo studio utilizzando protocolli approvati da comitati soggetti umani presso la Tulane University, Harvard University, Broad Institute, Irrua Specialist Teaching Hospital (ISTH), Ospedale governo Kenema (KGH), Oyo Ministero della Salute, Ibadan , Nigeria e Sierra Leone Ministero della Salute. Tutti i pazienti sono stati trattati con un livello simile di cura e sono stati offerti il ​​farmaco ribavirina, anche se non hanno deciso di partecipare allo studio. Per la febbre Lassa (LF) dei pazienti, il trattamento con Ribavirina ha seguito le linee guida attualmente raccomandati ed è stato generalmente offerto non appena LF è stata fortemente sospettato. A causa della grave epidemia di Ebola virus della malattia (EVD), i pazienti non potevano essere consentito attraverso i nostri protocolli standard. Invece l&#39;uso di campioni in eccesso clinici di pazienti EVD è stato valutato e approvato da Institutional Review Boards in Sierra Leone e alla Harvard University. il Office della Etico e Review Comitato Scientifico la Sierra Leone, la Sierra Leone, Ministero della Salute e Igiene, e il Comitato di Harvard sulla uso di soggetti umani hanno concesso una rinuncia del consenso per sequenza e rendere sequenze virali pubblicamente disponibili ottenuti da campioni di pazienti e di contatto raccolti durante l&#39;epidemia di Ebola in Sierra Leone. Questi corpi inoltre concesso l&#39;uso dei dati clinici ed epidemiologici per campioni de-identificato raccolti da tutti i pazienti che ricevono cure EVD sospetti durante la risposta epidemia. Il Leone Ministero della Salute e Igiene Sierra ha inoltre approvato le spedizioni di non infettivi, i campioni non biologici da Sierra Leone a Broad Institute e Harvard University per gli studi genomici di campioni focolaio. 1. DNasi-trattamento di RNA del campione (fino a 55 ml estratti RNA totale, ~ 4 ore) <ol><li> Impostare la reazione DNasi in una piastra a 96 pozzetti PCR su ghiaccio in un armadio biosicurezza come descritto nella Tabella 1 </strong&gt;, Step 1,1 (volume totale, 70 microlitri / pozzetto). Nota: Un mix master può essere preparato. </li><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Cleanup utilizza in fase solida reversibile immobilizzazione (SPRI) perline RNA. <ol><li> perline RNA riscaldare a TA per 30 min. </li><li> Agitare delicatamente bottiglia perline RNA per risospendere le particelle magnetiche che possono essere regolati. Aggiungere il volume 1,8x (126 ml) di perline RNA RNA DNasi-trattati (70 ml), mescolare con una pipetta 10 volte e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (volume totale di ben, 196 ml). </li><li> Posizionare miscela sulla stazione magnetica. Attendere la soluzione per deselezionare (5 - 10 min). </li><li> Rimuovere la soluzione eliminato mentre sulla stazione da pipetta e degli scarti. Mentre sulla stazione, lavare perline coprendo pellet con il 70% di etanolo e incubare per 1 min. Rimuovere etanolo con pipetta e degli scarti. Ripetere per un totale di due lavaggi. Nota: L&#39;utilizzo precisamente il 70% appena preparato etHANOL è critica, come una percentuale maggiore si tradurrà in lavaggio inefficiente delle molecole più piccole dimensioni, mentre &lt;70% di etanolo potrebbe causare la perdita di campione 7. </li><li> Mantenere targa sulla stazione e lasciare aperta asciugare all&#39;aria. Nota: Assicuratevi di lasciare le perline asciugare completamente fino perline cominciano a incrinarsi. </li><li> Aggiungere 55 ml di acqua priva di nucleasi alla piastra per eluire RNA. Rimuovere la piastra dalla stazione di mescolare le perline e acqua pipettando accuratamente. Nota: In alternativa, utilizzare meno acqua (≤ 10 pl) per concentrare l&#39;RNA totale. </li><li> Mettere piastra posteriore della stazione. Attendere fino a quando la soluzione cancella per trasferire da pipetta nuovo tubo tappo a vite per la conservazione a lungo termine (-80 ° C). Mettere 5 ml di RNA in new 96-pozzetti PCR per esaurimento (passo. 2.4). </li><li> Optional:. Salva e diluire 1 ml a 19 ml di acqua (1:20) per qRT-PCR di rRNA (ad esempio, 18S, 28S rRNA) (Tabella 2) e marcatori virali 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. L&#39;esaurimento selettiva di ribosomiale e Carrier RNA da virale campione di RNA (~ 4 ore) <ol><li> Fare ibridazione 5x e 10x buffer di reazione RNasi H, e l&#39;acqua priva di nucleasi con supporto acrilamide lineare come descritto nella tabella 1. </li><li> Impostare reazione di ibridazione combinando RNA con oligonucleotidi deplezione rRNA (Tabella 3) e oligo (dT) sul ghiaccio in una piastra a 96 pozzetti PCR come descritto nella Tabella 1. Nota: Un mix master può essere preparato. 50 femtogrammi (FG) di un RNA sintetico unico (ERCCs 8) possono essere aggiunti per il monitoraggio sia per il processo di sequenza virale e potenziale indice di lettura contaminazione incrociata. <ol><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 95 ° C per 2 min, lento rampa di 45 ° C a -0,1 ° C per sec. Pausa termociclatore a 45 ° C. </li></ol></li><li> Impostare mix di reazione RNase H sul ghiaccio come descrittod nella Tabella 1, quindi preriscaldare a 45 ° C per 2 min. Nota: Un mix master può essere preparato. <ol><li> Aggiungere la miscela preriscaldata RNase H della reazione di ibridazione in lamiera mantenendo la piastra nel termociclatore a 45 ° C. </li><li> Mescolare bene delicatamente pipettando 6 - 8 volte. Incubare a 45 ° C per altri 30 min. Mettere in ghiaccio. </li></ol></li><li> Impostare la miscela di reazione DNasi sul ghiaccio, come descritto nella tabella 1. Nota: Un mix master può essere preparato. <ol><li> Aggiungere alla reazione RNasi H in lamiera, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Smettere di reazione DNase con l&#39;aggiunta di 5 ml di 0,5 M EDTA. Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup utilizzando perline di RNA (vedi punto 1.3) con un volume di 1,8 volte (144 ml) perline. Eluire in 11 ml di acqua priva di nucleasi. Nota: Per lo stoccaggio a freddo di sicurezza, negozio impoverito RNA campioni a -80 ° C O / N. </li></ol> 3. cDNA Synthesis (~ 6 ore) <ol><li> Mix rRNA / RNA carrier-impoverito con primer casuali sul ghiaccio in una piastra a 96 pozzetti PCR, come descritto nella tabella 1, vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. <ol><li> Riscaldare il miscuglio a 70 ° C per 10 minuti in un termociclatore. Subito dopo la denaturazione di calore, posizionare l&#39;RNA in ghiaccio per 1-5 min. Non lasciare che l&#39;RNA di stare (anche su ghiaccio) per più di 5 minuti prima del primo filamento reazione. </li></ol></li><li> Impostare mix reazione di sintesi del primo filamento sul ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. <ol><li> Aggiungi RNA / random miscela di primer in lamiera, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare a 22 - 25 ° C per 10 min. </li><li> Incubare a 55 ° C in un incubatore d&#39;aria per 60 min. Posizionare la piastra sul ghiaccio per terminare la reazione. None: L&#39;uso di un incubatore aria è consigliabile creare progressivo riscaldamento del primo filamento di reazione durante il quale il primer ricottura e la prima parte inizia ad allungarsi. </li></ol></li><li> Impostare mix reazione di sintesi del secondo filone sul ghiaccio, come descritto nella tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. <ol><li> Aggiungi il primo filamento reazione di sintesi nel piatto, vortice delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. Incubare per 2 ore a 16 ° C (tenere il coperchio a 25 ° C). Non permettere che la temperatura a salire sopra 16 ° C. </li><li> Posizionare la piastra sul ghiaccio, poi inattivare reazione con l&#39;aggiunta di 5 ml di 0,5 M EDTA, mescolare delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li></ol></li><li> Pulizia con perline di DNA (vedi punto 1.3 per il protocollo) che utilizzano il volume 1,8 volte (153 ml) di perline. Eluire in 9 ml di tampone di eluizione (EB). Salva 1 ml per la quantificazione. Utilizzare 1 ng di cDNA per subsequepassi NT. Se la concentrazione cDNA è troppo bassa per rilevare, utilizzare 4 ml di cDNA per tagmentation (vedi punto 4.1). </li><li> Per lo stoccaggio a freddo di sicurezza, negozio di doppio filamento cDNA a 4 ° CO / N o -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 4. Biblioteca Preparazione - DNA Biblioteca Costruzioni (~ 4 ore) <ol><li> Trasferimento 4 ml di cDNA ad una piastra a 96 pozzetti e salvare il restante cDNA per un secondo tentativo se necessario. </li><li> Impostare la reazione tagmentation su ghiaccio come descritto nella Tabella 1. Nota: Un maestro-mix può essere preparato. Per ridurre il fondo e il costo complessivo, il volume totale della reazione tagmentation è ridotto da 20 a 10 microlitri. Come cDNA è il fattore limitante, la quantità di ATM (cioè, transposome) utilizzato nella reazione è anche ridotta per diminuire il numero di siti di integrazione. <ol><li> Aggiungere mix tagmentation al cDNA nel piatto, vortice delicatamente e accuratamente e centrifugare a 280 g (a temperatura ambiente) per 1 min.Incubare a 55 ° C per 5 minuti, tenere a 10 ° C. </li><li> Una volta a 10 ° C, aggiungere immediatamente 2,5 ml di Neutralizzare Tagment Buffer (NT) per terminare la reazione. Mescolare pipettando su e giù, quindi si centrifuga a 280 xg (a RT) per 1 min. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol></li><li> Impostare PCR reazione di amplificazione in ghiaccio come descritto nella Tabella 1. <ol><li> Vortex delicatamente e accuratamente, quindi si centrifuga a 280 xg a temperatura ambiente per 1 min. </li><li> Eseguire la PCR sul termociclatore utilizzando le condizioni descritte in Tabella 1. Nota: 12 cicli di PCR sono suggeriti per 1 ng di cDNA tagmented; tuttavia, campioni clinici virali hanno spesso quantità rilevabili di cDNA. Per basse quantità di cDNA (&lt;1 ng), utilizzare fino a 18 cicli di PCR per creare abbastanza libreria per il sequenziamento. </li></ol></li><li> Preparazione Biblioteca - pulizia e mettere in comune per il sequenziamento <ol><li> Portare campione fino a 50 ml con EB. </li><li> Pulizia conperline di DNA (vedi punto 1.3 per il protocollo) che utilizzano il volume 0.6x (30 ml) perline. Eluire in 15 microlitri EB. </li><li> Determinare la concentrazione di biblioteca (figura 3) per lo svolgimento di analisi di regione (da 150 a 1000 bp) utilizzando il software bioanalizzatore 9, esclusi i dimeri di primer (~ 120 bp) da analisi regione. Nota: In alternativa, qPCR può essere utilizzato per quantificare le librerie 10. </li><li> librerie piscina presso la più bassa concentrazione molare di 1 nm o superiore. Se biblioteca è inferiore a 1 nM, aggiungere una piccola quantità di biblioteca alla piscina (~ il volume 1x di altre biblioteche) per acquisire informazioni sulla sequenza da queste librerie. </li><li> piscina Cleanup con 0,7x perline DNA come descritto in precedenza (vedi punto 2). Eluire in 15 microlitri EB. Nota: Volume di perline dipenderà dal volume finale della piscina. </li><li> Analizzare piscina 9. Determinare concentrazione molare conducendo analisi regione (da 150 a 1000 bp) 9. Nota: In alternativa, qPCR può essere utilizzato per quantificare piscina libreria 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Carico sequencer a una concentrazione biblioteca 22:00 di generare 101 bp, abbinato-end legge con doppio codice a barre legge 11. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Figura 3. Biblioteche Costruito da virus Ebola campioni clinici. Immagine Gel di 4 rappresentante virus Ebola (EBOV) librerie. Regioni della biblioteca e di primer dimeri sono mostrati. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The authors have no competing financial interests.

L&#39;approccio delineato consente robusto, universale, rapida sequenza ed è stato utilizzato per il sequenziamento virus Ebola nel corso del 2014 2,4 scoppio. Accoppiando deplezione selettiva e sintesi del DNA con la costruzione biblioteca tagmentation, il tempo complessivo processo è stato ridotto di ~ 2 giorni da precedenti metodi adattatore legatura. Più di recente, questo protocollo è stato impiegato da collaboratori internazionali e gli altri con grande successo 15,16 e verrà distribuito ai laboratori in Africa occidentale per sostenere gli studi di ricerca genomica basata su locali e diagnostica 17. Il protocollo qui descritto utilizza primer casuali per preparare cDNA per le librerie di RNA-Seq virali. A differenza dei precedenti approcci RNA-seq virali, essa non richiede una conoscenza a priori dei dati di sequenza o di progettazione Primer elaborato e richiede tempo per un virus o clade specifico. Il metodo può essere applicato a qualsiasi campione di RNA virale. Ad esempio, è stato utilizzato per generare contenuti virali sia Ebolae campioni Lassa 6. Il protocollo può essere utilizzato anche per la trascrittomica padrone di casa, progetti di sequenziamento metagenomiche e di scoperta patogeno 1. Un passaggio fondamentale del protocollo è rivolto RNase H digestione, un alto rendimento, metodo a basso costo per la rimozione di vettore indesiderate e dell&#39;RNA host da campioni virali. Il passo deplezione selettiva del protocollo utilizza molti componenti e richiede abilità e precisione. I tempi supplementari e la cura dovrebbe essere presa durante la configurazione iniziale. Come la maggior parte dei campioni di siero e plasma clinici hanno spesso molto poco materiale acido nucleico, la contaminazione e la perdita del campione sono comuni. Per evitare questi problemi, particolare attenzione dovrebbe essere presa quando si utilizza questo protocollo. Innanzitutto, RNA è altamente suscettibile alla degradazione; quindi tutte le aree devono essere puliti e privi di nucleasi. In secondo luogo, per identificare i campioni adatti per l&#39;utilizzo in questo protocollo, analisi qRT-PCR sia per l&#39;RNA ospite e virus devono essere utilizzati per la quantificazione 5,6 </sup&gt;. Quando si confrontano ingresso pari con i risultati di sequenziamento del protocollo, il successo sequenziamento (vale a dire, la generazione di dati sufficienti per l&#39;assemblaggio virale pieno) correlati con i campioni che contenevano almeno 100 pg RNA totale e 1.000 copie del virus. Terzo, l&#39;esposizione a fonti ambientali di acidi nucleici deve essere evitato. Il protocollo descritto qui viene eseguita in una cappa di biosicurezza per precauzioni di sicurezza e per limitare contaminanti ambientali. Inoltre, il nostro gruppo e gli altri hanno notato che gli enzimi commerciali possono essere un&#39;altra fonte di contaminazione acidi nucleici batterici in campioni a basso input 6,18. L&#39;utilizzo di uno spazio di lavoro pulito (ad esempio, la PCR cappuccio, armadio biosicurezza) e controlli negativi (ad esempio, acqua o buffer) aiuterà ad alleviare e tenere traccia di contaminazione, rispettivamente. Per i campioni con &lt;100 pg di RNA totale, solo poli (rA) RNA carrier, non rRNA, dovrebbe essere esaurita per garantire risultati di sequenziamento di alta qualità, limitando la perdita di materiale. per moltocampioni di ingresso bassa, metodi cDNA-amplificazione può essere più adatto 19, anche se poly (rA) vettore dovrebbe essere rimosso prima della sintesi del DNA. L&#39;esaurimento di accoglienza rRNA arricchisce di contenuti virali nelle biblioteche di sequenziamento ed è applicabile alle collezioni di campioni diversi, tra cui siero o plasma, e diversi tipi di tessuti da roditori e primati non umani 5,6. Negli organismi non umani, legge l&#39;allineamento di 28S rRNA è rimasto dopo l&#39;esaurimento, suggerendo 28S rRNA è meno conservato tra gli esseri umani e le altre specie 6,20. Quando si utilizza questo metodo con isolati non-umani, può essere necessario integrare con oligonucleotidi di DNA complementare alle divergenti sequenze rRNA della specifica 3,21 host. Dal momento che il protocollo è imparziale, virale legge può rappresentare solo una piccola frazione del contenuto totale biblioteca. Anche se rRNA è la specie più abbondante di RNA ospitante e solo una piccola percentuale di rRNA legge (0, 1%) si trovano dopo l&#39;esaurimento selettiva, tutti gli altri RNA host (ad esempio, mRNA) rimarrà dopo l&#39;esaurimento e può spiegare molti sequenziamento legge dal campione. Pertanto &quot;sovracampionamento&quot; (vale a dire, oversequencing) singole biblioteche è necessario al fine di avere una copertura sufficiente per le chiamate di assemblaggio e variante virale. Per i nostri studi, si cerca di sequenza ~ 20 milioni letture per campione di avere abbastanza profondità per l&#39;analisi dei virus e varianti genomiche associate così come il contenuto metagenomica 2,5. Per gli studi di scoperta metagenomiche e patogeni, è importante notare che DNA contaminante host viene rimosso dalla DNasi digestione. Pertanto virus e altri agenti patogeni che contengono genomi di DNA possono essere persi durante il processo, tuttavia intermedi di RNA possono ancora essere sequenziato.

La nuova generazione di sequenziamento del virus da fonti cliniche può informare la trasmissione e l&#39;epidemiologia delle infezioni, così come l&#39;aiuto supporto romanzo diagnostica, vaccini e lo sviluppo terapeutico. sintesi del DNA utilizzando primer casuali ha permesso l&#39;individuazione e l&#39;assemblaggio dei genomi da divergenti, co-infettante o anche di nuovi virus 1,2. Come con altri metodi imparziali, contaminanti indesiderati occupano molti sequenziamento legge e un impatto negativo i risultati di sequenziamento. Host e poli (Ra) RNA carrier sono contaminanti presenti in molte collezioni di campioni virali esistenti. Il protocollo descrive un modo efficiente ed economico di profondi genomi virali sequenza di RNA sulla base imparziale totale RNA-Seq. Il metodo utilizza una deplezione selettiva passo RNase H 3 per rimuovere indesiderati ribosomiale host e l&#39;RNA carrier. Deplezione selettiva arricchisce di contenuti virali (Figura 1) e migliora la qualità complessiva dei dati di sequenziamento(Figura 2) da campioni clinici. Inoltre, tagmentation viene applicato al protocollo poiché riduce notevolmente i tempi di costruzione libreria. Questi metodi sono stati utilizzati per generare rapidamente grandi quantità di dati di Ebola e Lassa genomi virali 2,4,5 e possono essere utilizzati per studiare una vasta gamma di virus a RNA. Infine, il metodo non è limitato a campioni umani; l&#39;utilità di esaurimento selettivo è stata dimostrata su campioni di tessuto raccolti da roditori Lassa-infette e modelli di malattia di primati non umani 5,6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;RNA totale contenuto riflette Arricchimento di Lassa Virus Content Utilizzando selettiva esaurimento. Partendo contenuto complessivo (ingresso RNA) e l&#39;arricchimento di unico virus Lassa (LASV) legge (contenuto Library) sulla riduzione di rRNA da nove diversi isolati clinici. Questa cifra è stata modificata da 6 <em&gt;. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Figura 2. più di alta qualità Sequencing Dopo Carrier RNA esaurimento. Qualità di base mediani per ciclo di sequenziamento di poli (rA) -contaminated librerie virus Lassa (rosso) e di controllo (nessun vettore osservata in biblioteca, nero) dal rapporto QC 13. Sia in lettura 1 e 2 lettura di fine accoppiato letture vengono uniti nel file BAM biblioteca e il punteggio di qualità sono mostrati in ogni base. Questa cifra è stata modificata dal 6. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I dettagli del protocollo di costruzione virale RNA-Seq di librerie direttamente da estrattiRNA raccolti da campioni clinici e biologici. Per garantire la sicurezza personale, tutti i campioni di siero, plasma e del tessuto virali, devono essere inattivati ​​nei buffer appropriato prima estrazione di RNA. In alcuni kit di inattivazione e di estrazione, vettore poli (rA) RNA è incluso; questo verrà rimosso durante la fase di svuotamento selettivo iniziale RNase H. Sulla base di recupero completo, la concentrazione atteso di RNA carrier è di 100 ng / ml. Nel protocollo, 110 ng / ml oligo dT RNA (concentrazione di portatori 1.1x) viene utilizzato per esaurimento. Se poly (rA) vettore non è presente nel campione, quindi oligo (dT) non dovrebbe essere aggiunto prima della deplezione. Il seguente protocollo è stato progettato per 24 reazioni in formato piastra PCR (fino a 250 volumi mL). Una precedente versione di questo protocollo è stato segnalato in Matranga, et al. 6.

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strips of Eight Caps</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>post RNA extraction step, 2 U/&amp;micro;l, buffer included</td></tr><tr><td>PCR cycler</td><td></td><td></td><td>any PCR cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI beads&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>beads for RNA cleanup</td></tr><tr><td>Real Time qPCR system</td><td></td><td></td><td>any system</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>prepare fresh</td></tr><tr><td>qRT-PCR primers</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos covering entire rRNA region</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;, order lab-ready at 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt long, desalted</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostable RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>post selective depletion step</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>mostly hexamers</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>with first-strand buffer, DTT</td></tr><tr><td>Air Incubator</td><td></td><td></td><td>any air incubator cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Polymerase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>beads for DNA cleanup</td></tr><tr><td>Elution Buffer&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Index Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td></tr></tbody></table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Qui descriviamo un protocollo sequenza di RNA di nuova generazione che permette de novo assemblee e chiamate variante intra-host dei genomi virali raccolti da fonti clinici e biologici. Il metodo è imparziale e universale; utilizza primer casuali per la sintesi del DNA e non richiede alcuna conoscenza preliminare del contenuto di sequenza virale. Prima costruzione della libreria, selettivo digestione RNasi H-based è utilizzata per esaurire indesiderato RNA - vettore compreso poli (Ra) e RNA ribosomiale - dal campione di RNA virale. deplezione selettiva migliora sia la qualità dei dati e il numero di univoco legge in biblioteche RNA virali sequenziamento. Inoltre, passo un trasposasi-based &#39;tagmentation&#39; è usato nel protocollo in quanto riduce il tempo complessivo di costruzione biblioteca. Il protocollo ha permesso un rapido sequenziamento profondo di oltre 600 campioni, tra cui Lassa e Ebola virus collezioni sia da sangue e tessuti isolati, ed è ampiamente applicabile ad altri studi di genomica microbica.

Il protocollo descritto consente la generazione di sequenziamento di alta qualità legge da campioni di RNA virale a basso input, arricchendo di contenuti virali unici. Come mostrato in figura 1, il protocollo arricchita unico contenuto virus Lassa almeno cinque volte in tutti i campioni (rispetto ai controlli non impoverito) con almeno un milione di copie del 18S rRNA (~ 100 pg di RNA totale). Allo stesso modo, il successo sequenziamento anche correlata con la quantità di virus in un dato campione. Utilizzando qRT-PCR come surrogato per quantità virale, i campioni che contenevano ~ 1.000 o più copie di genoma virale più spesso create assemblee pieno (dati non riportati). Inoltre, deplezione di poli (rA) portante, sequenze omopolimero di A e T in biblioteche, conseguente preparazioni puliti e garantire una migliore qualità sequenziamento letture (Figura 2). biblioteche definitivo campioni clinici virali a basso input spesso hanno un ampio frammento lunghezza da 150 a 1000 bp(Figura 3). Dopo il sequenziamento, per ridurre errori di identificazione del campione e diafonia tra le biblioteche all&#39;interno di una piscina di 12, solo indice di legge con un punteggio di qualità di base di 25 (Q25) e garantire a zero mancate corrispondenze sono mantenuti durante il processo di demultiplazione. Genomi virali sono assemblati utilizzando una pipeline bioinformatica specifico per virus divergenti 2,4-6. Questi strumenti sono disponibili presso https://github.com/broadinstitute/viral-ngs o attraverso piattaforme cloud commerciali 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fase 1.1: reazione DNasi </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> Buffer 10x DNase </td><td> 7 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 6 </td></tr><tr><td> RNA virale estratto </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: tampone 5x ibridazione </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml (ml) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Fase 2.1: 10x tampone di reazione RNase H </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml (ml) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Fase 2.1: Acqua wacrilamide lineare esimo </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per 1 ml di tampone (ml) </td></tr><tr><td> acqua priva di nucleasi </td><td> 992 </td></tr><tr><td> acrilammide lineare (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.2: reazione di ibridazione per la deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 5x Tampone di ibridazione </td><td> 2 </td></tr><tr><td> oligo mix rRNA-esaurimento (100 micron) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) T (550 ng / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNasi trattati RNA totale </td><td> fino a 5 </td></tr><tr><td> Spike-in RNA (questo è facoltativo) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> portare fino a 10 in totale </td></tr><tr><td> volu totaleme </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.3: RNase H reazione per deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 10x RNase H tampone di reazione </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termostabile RNase H (5 U / ml) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 2.4: messaggio reazione DNasi deplezione selettiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> 10x DNase Buffer </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Acqua (con acrilammide lineare) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> inibitore RNasi (20 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNasi RNasi-free I (2.72 U / ml) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Volume totale (con reazione RNasi H) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 3.1: sintesi del DNA, Primer casuale ibridazione </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume per reazione (ml) </td></tr><tr><td> rRNA / RNA carrier-impoverito </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 mg di primer casuale </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Fase 3.2: Primo aspetto reazione di sintesi del DNA </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> 5x First-Strand tampone di reazione </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mix 10 mM dNTP </td><td> 1 </td></tr><tr><td> inibitore RNasi (20 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> trascrittasi inversa (aggiungere ultima) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale (con l&#39;RNA sopra) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Fase 3.3: Secondo aspetto reazione di sintesi del DNA </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> acqua priva di RNasi </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x tampone di reazione seconda Strand </td><td> 8 </td></tr><tr><td> mix 10 mM dNTP </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli DNA Ligase (10 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA polimerasi I (10 U / ml) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNase H (2 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume totale (con 1 ° reazione filo) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Fase 4.2: reazione Tagmentation </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> Amplicon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA Buffer (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Volume totale (con cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Passo 4.3: reazione Biblioteca PCR </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (ml) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Indice 1 Primer (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Indice 2 Primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Volume totale (con tagmented cDNA) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Punto 4.3.2: condizioni di PCR Biblioteca </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 sec </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> fino a 18 cicli a 10 sec a 95 ° C, 30 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, per sempre </td><td></td></tr></tbody></table>Tabella 1:. Reazione di set-up e buffer Step-by-Step tabelle con contenuto di tutti i buffer e miscele di reazione. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligo Nome </td><td> Sequenza (5 &#39;a 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola Kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola Kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tin grado&gt; Tabella 2: qRT-PCR Primer sequenze primer utilizzati per la misurazione host (18S rRNA) e virali contenuti (Ebola e Lassa).. &#39;KGH&#39; è Hospital Kenema governo in Sierra Leone, dove i primer di Ebola sono stati testati 2. &#39;Kulesh&#39; è il ricercatore che ha progettato il primer set 14. Tabella 3: RNA ribosomiale (rRNA) Depletion Oligos 195 lunghe sequenze di 50 nucleotidi complementari per rRNA umana per passo deplezione selettiva 6.. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

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Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Imparziale sequenziamento profondo di RNA virus da campioni clinici

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K Views.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

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Immunologia e infezioni

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Bioingegneria

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetica

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Convalida del sequenziamento dei nanopore dell'intero genoma, usando Usutu Virus come esempio

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. The process typically involves wastewater concentration, nucleic acid extraction, amplification of selected genomic segments, and detection and quantification of the amplified genomic segment. This methodology can similarly be leveraged to detect and quantify infectious agents, such as SARS-CoV-2, in air samples. Initially, SARS-CoV-2 was presumed to spread primarily through close personal contact with droplets generated by an infected individual while speaking, sneezing, coughing, singing, or breathing. However, a growing number of studies have reported the presence of SARS-CoV-2 RNA in the air of healthcare facilities, establishing airborne transmission as a viable route for the virus. This study presents a composite of established protocols to facilitate environmental detection, quantification, and sequencing of viruses from both wastewater and air samples.

This protocol aims to quantify SARS-CoV-2 RNA in wastewater and air samples to be used for wastewater-based epidemiology studies and to assess the exposure risk to SARS-CoV-2 in indoor and outdoor aerosols. This protocol also describes a tiled amplicon long-template sequencing approach for SARS-CoV-2 whole genome characterization.

Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

Ambiente

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Tamponare l'ambiente urbano - Una pipeline per il campionamento e il rilevamento della SARS-CoV-2 dai bacini ambientali

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Biologia

Un approccio genomico basato sui nanopori per controllare la rabbia nei paesi a basso reddito

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

Autore in primo piano: Un flusso di lavoro genomico conveniente per migliorare il controllo della rabbia in contesti con risorse limitate 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...