Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.

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The authors have nothing to disclose.

Le prime osservazioni di LBCs &quot;vivente&quot; GVS-isolato mano di rane e salamandre sono state fatte quasi 80 anni fa dal biologo americano William Duryee, 19 prima dell&#39;introduzione del contrasto di fase e microscopia DIC, prima di immunostaining fluorescenti, e prima di FISH. I vantaggi di LBCs per indagare i dettagli della struttura cromosomica e trascrizione a livello singolo gene sviluppo necessario di tecniche per fissare la LBCs di vetrini, di risolverli in modo realistico, e di applicare tecniche molecolari senza distruggere la loro morfologia di base. Quasi ogni tecnica per realizzare questi obiettivi richiede un po &#39;di adattamento alle specie oggetto di indagine e qualche compromesso tra conservazione realistica e caratterizzazione molecolare. Per esempio, alla GVS e LBCs di anfibi dalla coda sono insolitamente facile lavorare con a causa della loro enormi dimensioni e la facilità con cui i contenuti GV disperdono nell&#39;ambiente interessato. Uino recentemente, tuttavia, ben poco si sapeva circa i loro genomica, rendendo difficile correlare la ricchezza di caratteristiche citologiche con dettagli molecolari. Viceversa, LBCs di Xenopus sono abbastanza piccole rispetto a quelle di anfibi coda (figura 5), ma i genomi di entrambi tropicalis X. e X. laevis sono stati sequenziati e sono ragionevolmente ben annotato. Per coloro che utilizzano prima GVs anfibi, la sfida principale sarà quella di isolare il GV e rimuovere la membrana nucleare senza danneggiare le LBCs. Fino ad oggi, nessuno ha scoperto un modo per rimuovere la busta se non per mano con le pinze del gioielliere. Sarebbe un grande passo avanti tecnico se un modo sono stati trovati per &quot;sciogliere&quot; o &quot;digerire&quot; la busta, ma lasciare i cromosomi e altri organelli nucleari danneggiati. Tale tecnica sarebbe ugualmente utile per studi molecolari. Nelle nostre indagini sulla RNA nucleare e citoplasmatica abbiamo trovato essenzialerimuovere la busta nucleare prima analisi di RNA nucleare (Figura 2). 17,18 Se la busta non viene rimosso, la piccola quantità di RNA nucleare è sommersi contaminando RNA citoplasmatico che aderiscono all&#39;esterno della busta. Un altro miglioramento importante sarebbe la scoperta di un modo per collegare LBCs più strettamente ad un vetrino da microscopio. Centrifugazione della preparazione è fondamentale, ma anche la centrifugazione prolungato (1 ora a 4.500 xg) non assicura attaccamento. Si può dire solitamente quando LBCs sono ben attaccati da loro esame con contrasto di fase sotto media ingrandimento. Ben attaccate cromosomi non mostrano il moto browniano a tutti. Se una moto browniano delle anse è rilevabile, successivi protocolli di immunoistochimica o pesce si portano a danni o perdita di materiale.

La maggior parte dei vertebrati, con la notevole eccezione di marsupiali e mammiferi placentati, producono grandi uova Yolky. Nonostante la loro talvolta enormi dimensioni, queste uova sono cellule singole che raggiungono la loro dimensione finale, pur nelle ovaie della femmina. Uova ovariche sono chiamati ovociti e ogni genere contiene un singolo nucleo gigante, conosciuta sin dagli inizi del 19 ° secolo come il vescicola germinale o semplicemente GV. 1 ovociti delle rane di laboratorio comuni, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, raggiungono un diametro massimo di 1,2 mm e 0,8 millimetri, rispettivamente (Figura 1). I GVs da ovociti maturi di questi due rane sono 0,3 - 0,4 mm di diametro (figure 2, 3). Salamandre in genere hanno ovociti ancora più grandi e GVs. Ovociti completamente maturi del axolotl messicano, Ambystoma mexicanum, sono più di 2 mm di diametro e GV è di circa 0,5 mm. Così, questi nuclei sono facilmente visibili ad occhio nudo e lattinaessere manipolata in molti modi che sono impossibili con i nuclei di cellule somatiche tipiche. Altrettanto notevole è il gigantismo dei cromosomi all&#39;interno del GV, un fatto riconosciuto già alla fine del 19 ° secolo. Cromosomi individuali di Ambystoma e altre salamandre possono essere fino a 1 mm di lunghezza (Figure 4, 5). Quelli di Xenopus sono notevoli più piccolo, anche se con lunghezze fino a 100 pm o più, nano cromosomi tipici somatici di maggior parte degli organismi. Una caratteristica importante dei cromosomi degli ovociti è la loro straordinaria attività trascrizionale, che porta ad una delle loro più caratteristici morfologiche - centinaia di loop laterali accoppiati (Figura 5). Ogni ciclo è composto da una o poche unità di trascrizione che sintetizzano attivamente RNA. Le anse conferiscono ovocita cromosomi uno fuzzy aspetto, che ha portato il nome di cromosoma &quot;lampbrush&quot; dopo la loro superficialesomiglianza con le spazzole utilizzate in passato per pulire camini lampada a cherosene. 2 L&#39;obiettivo di questo lavoro è l&#39;uso di GVs isolati per studiare LBCs e organelli nucleari (nucleoli, corpi istone locus, e macchie). Due tecniche piuttosto diverse saranno descritte. Nel primo, la tecnica più comune, GVs sono isolati in una soluzione salina con pinze del gioielliere, brevemente risciacquato per rimuovere tuorlo aderenti, e l&#39;involucro nucleare viene rimosso, ancora una volta con una pinza del gioielliere. I contenuti gelatinosi, contenenti i LBCs e organelli nucleari, sono autorizzati a stabilirsi su un vetrino da microscopio in vetro o coprioggetto. Tali preparati possono essere esaminati direttamente dal contrasto di fase o microscopia DIC. In alternativa, preparati possono essere centrifugati per fissare le LBCs e organelli alla diapositiva o coprioggetto. Tali preparati possono essere trattati per l&#39;analisi molecolare dettagliata degli acidi nucleici e proteine, in primo luogo mediante immunofluorescenza e fluorescent ibridazione in situ (FISH). 3-7 Una seconda tecnica prevede l&#39;isolamento del GV in olio minerale. 8 GVs olio isolato rimangono trascrizionalmente attivo per molte ore e sono potenzialmente utili per gli studi dove si vuole i contenuti nucleari di essere il più realistico possibile. 9,10 Poiché l&#39;indice di rifrazione del &quot;SAP&quot; nucleare è vicino a quello dei LBCs e altri organelli nucleari (Figura 3), tecniche microscopiche può essere una sfida con GVs olio isolato. Infine, a causa delle loro dimensioni e facilità di manipolazione, GVs sono materiale ideale per studi sulla membrana nucleare. Il complesso del poro nucleare è stata descritta da elettroni studi microscopici sulle buste GV anfibi 11 e osservazioni SuperResolution più recenti hanno utilizzato lo stesso materiale. 12,13

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>Sometimes referred to as MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (paraffin wax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Grocery Store</td><td></td><td>Commercial Knox gelatin works fine</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal cover glass&amp;nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy</td></tr><tr><td>Dumont forceps #5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>Paraffin oil (light)&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>For isolating GVs in oil</td></tr><tr><td>Adhesive &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; PCR and hybridization chambers (25 &amp;micro;L)</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>Silicone isolators</td><td>Grace-Biolabs</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin jars and staining dishes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>select from catalog link</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

isolation of giant lampbrush chromosomes from living oocytes of frogs and salamanders

Descriviamo i metodi per lo studio dei giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi (LBCs) in ovocita o uovo posata, di rane e salamandre. LBCs individuali possono essere fino a 1 mm di lunghezza e risiedere in un nucleo gigantesca, per sé fino a 0,5 mm di diametro. Le grandi dimensioni dei cromosomi permette osservazioni ineguagliabile geni attivi di microscopia ottica luce, ma allo stesso tempo tecniche speciali sono necessari per isolare il nucleo, la rimozione della membrana nucleare, e diffondere i cromosomi su un vetrino da microscopio. Il nucleo di ovociti, detto anche germinale vescicole (GV), è isolato in un mezzo che permette di gelificazione parziale della actina nucleare e preserva la delicata struttura dei LBCs. Questa fase viene effettuata manualmente sotto un microscopio da dissezione con pinze del gioielliere. Successivamente, l&#39;involucro nucleare viene rimosso, sempre manualmente con le pinze del gioielliere. I contenuti nucleari sono rapidamente trasferiti in un mezzo che VerniceRSES il gel actina e permette ai LBCs intatti di stabilirsi su un vetrino da microscopio. A questo punto i LBCs e altri organelli nucleari possono essere visualizzati da contrasto di fase o microscopio a contrasto di interferenza differenziale, anche se i dettagli più fini sono oscurati da moto browniano. Per l&#39;alta risoluzione di osservazione microscopica o analisi molecolare, tutta la preparazione viene centrifugato per fissare saldamente le LBCs delicati alla diapositiva. Una breve fissazione in paraformaldeide è poi seguita da immunofluorescenza colorazione o ibridazione in situ. LBCs sono in uno stato trascrizionalmente attivo e le loro enormi dimensioni permette l&#39;analisi molecolare a livello di singolo gene utilizzando confocale o la microscopia super-risoluzione.

Per esaminare giganti cromosoma a spazzola si comincia isolando ovociti da una rana o di salamandra. La figura 1 mostra un gruppo di oociti maturi in una soluzione salina tamponata dopo la rimozione dal ovaio della rana, Xenopus. Tali ovociti rimangono in buone condizioni per giorni a temperatura ambiente. Il nucleo (o vescicola germinale) sono eliminati da un ovocita con una pinza di gioielli, sia in soluzione salina (Figura 2) o in olio (figura 3). I contenuti nucleari di un nucleo di petrolio-isolato possono essere esaminati da schiacciamento delicatamente il nucleo e l&#39;osservazione per contrasto di fase o microscopia differenziale contrasto interferenziale (DIC). Per esaminare il contenuto di un nucleo che è stato isolato in una soluzione salina, si deve prima rimuovere la membrana nucleare con una pinza di gioielli e consentire il contenuto di stabilirsi su un vetrino da microscopio. La preparazione viene poi centrifugato per attaccare tsi cromosomi saldamente alla slitta, dopo di che i cromosomi possono essere colorati con un anticorpo (Figura 4) o sottoposti a ibridazione in situ. I cromosoma a spazzola di salamandre sono molto maggiori di quelle delle rane (Figura 5). In entrambi i casi singole unità di trascrizione (geni) possono essere visti come anelli di cromatina sporgenti lateralmente dall&#39;asse cromosoma. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig1.jpg" /> Figura 1: ovociti maturi dal X. tropicalis rana. L&#39;ovaio di una rana femminile maturo contiene migliaia di ovociti in diversi stadi di maturazione. La più piccola sono le dimensioni delle cellule somatiche e hanno già raggiunto profase della prima divisione meiotica. Come l&#39;ovocita cresce, si accumula a poco a poco tuorlo, che dà la cellula un aspetto bianco opaco. Il più grande tappetoovociti ure, mostrato qui, acquisiscono un berretto scuro a causa di accumulo di pigmento melanina. I maggiori oociti di X. tropicalis sono di circa 0,8 mm di diametro, quelli di X. laevis circa 1,4 mm, mentre quelli della axolotl sono un enorme 2,2 mm. Fatta eccezione per dimensioni, tutti e tre sono simili in aspetto generale. Barra di scala = 1 mm. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig2.jpg" /> Figura 2: rimozione del GV da un ovocita di X. tropicalis. Sinistra. Un piccolo foro è stato fatto con una pinza del gioielliere nel polo animale più scuro di un ovocita e GV è stato gentilmente estruso. In questo esempio, il GV era quasi privo di tuorlo come è venuto fuori l&#39;ovocita. tuorlo aderente può essere rimosso da succhiare GV dentro e fuori di una pipetta con una punta di diametro leggermente maggiore del diametro del GV stesso. Destra. Three GVs di X. tropicalis. Questi GVs stati lasciati alcuni minuti in un (soluzione GV isolamento portata a pH 5,8) leggermente acido medio, che provoca l&#39;involucro nucleare a gonfiarsi lontano dal contenuto nucleari gelificati. GVs trattati in questo modo non si diffonderanno per l&#39;esame citologico. Tuttavia, tali GVs sono ideali per l&#39;analisi molecolare: la busta può essere rimosso con una pinza gioiellerie, fornendo un campione di contenuti nucleari completamente liberi di contaminazione citoplasmatica. 17,18 Barra di scala = 0,5 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54103/54103fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig3.jpg" /> Figura 3: GV di X. tropicalis Isolato in olio. Sinistra. Dopo una piccola puntura è stata presentata nell&#39;ambito ovocita vicino al Po animale scurole, GV cominciò a estrudere. In questo caso il GV è uscito con quasi nessun tuorlo aderente. In mezzo. Il GV è ora completamente libero dal citoplasma dell&#39;ovocita. Tali GVs continuano a trascrivere l&#39;RNA per ore. Destra. Dopo il GV è leggermente schiacciato in olio sotto un vetrino, organelli nucleari possono essere visualizzati da DIC, come mostrato qui, o per contrasto di fase. L&#39;intera GV è molto più grande della piccola area mostrata qui. HLB = corpo istone locus con tre macchie sulla sua superficie. Barra di scala = 0,5 mm per primi due pannelli, 10 micron per il terzo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54103/54103fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig4.jpg" /> Figura 4: Lampbrush cromosomi (LBCs) dal Axolotl A. mexicanum. Sinistra. </strong&gt; Le 14 coppie di cromosomi da un unico GV in profase della prima divisione meiotica, immunostained con un anticorpo contro RNA polimerasi II fosforilata. I piccoli &quot;punti&quot; macchiati sono corpi locus istoni. Destra. La stessa preparazione visto da illuminazione campo scuro. Si può ora vedere le numerose nucleoli amplificati non colorati. Barra di scala = 250 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54103/54103fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54103/54103fig5.jpg" /> Figura 5: Un LBC singolo dal Axolotl A. mexicanum e le tropicalis Rana X., allo stesso ingrandimento. Queste immagini illustrano la differenza di dimensioni tra estrema LBCs di una salamandra e una rana (nel riquadro). Le dimensioni difference correla con il contenuto di DNA totale dei genomi (circa 30 sterline per A. mexicanum vs 1,7 Gbp per X. tropicalis). anse laterali individuali (unità di trascrizione) sono anche molto più a lungo nella salamandra che nella rana. Barra di scala = 100 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54103/54103fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

Vi presentiamo semplici tecniche per isolare giganti cromosoma a spazzola trascrizionalmente attivi da ovociti di rane e salamandre vivono. Descriviamo come osservare questi cromosomi &quot;vivo&quot; di contrasto di fase o differenziale contrasto interferenziale, e come risolverli per fluorescente ibridazione in situ o di immunofluorescenza colorazione.

Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

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Biologia dello sviluppo

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Biochimica

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultanea di pre-e post-sinaptica registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo-muscolo Co-colture

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Neuroscienze

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Biologia

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, respectively, play essential roles in embryonic development and adult homeostasis. Members of the Tgf&#223; family are made as inactive precursors that dimerize and fold within the endoplasmic reticulum. The precursor is subsequently cleaved into ligand and prodomain fragments. Although only the dimeric ligand can engage Tgf&#223; receptors and activate downstream signaling, there is growing recognition that the prodomain moiety contributes to ligand activity. This article describes a protocol that can be used to identify cleavage products generated during activation of Tgf&#223; precursor proteins. RNA encoding Tgf&#223; precursors are first microinjected into X. laevis embryos. The following day, cleavage products are collected from the blastocoele of&#160;gastrula stage embryos and analyzed on Western blots. This protocol can be completed relatively quickly, does not require expensive reagents and provides a source of concentrated Tgf&#223; cleavage products under physiologic conditions.

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

When Transforming Growth Factor &#223; family precursor proteins are ectopically expressed in Xenopus laevis embryos, they dimerize, get cleaved and are secreted into the blastocoele, which begins at the late blastula to early gastrula stage. We describe a method for aspirating cleavage products from the blastocoele cavity for immunoblot analysis.

Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produzione di<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Uovo Estratti per identificare RNA associata ai microtubuli

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Isolamento di gigante Lampbrush cromosomi da Living ovociti di rane e salamandre

Riepilogo

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Manipolazione e

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

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Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

Analisi dei prodotti di scissione della famiglia Transforming Growth Factor ß secreti nel blastocoelo di embrioni di Xenopus laevis

Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

Produzione di

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