Name: rapid verification of terminators using the pgr-blue plasmid and golden gate assembly
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere Malcolm Campbell e Todd Eckdahl con il Genome Consortium per l&#39;insegnamento attivo (GCAT) e il HHMI-Science Education Alliance - Cacciatori fagi Avanzando Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi). Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Center for Research Resources (P20RR016460) e l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (P20GM103429) dal National Institutes of Health. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla National Science Foundation sotto concessione # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) fondi Inoltre istituzionali sono stati forniti attraverso il JD Patterson Estate Research Fellowship.

1. Progettazione e ordinare oligonucleotidi con le appropriate Sticky Ends <ol><li> Identificare i potenziali terminatori Rho-indipendente attraverso l&#39;analisi genomica utilizzando programmi che sono liberamente disponibili online. 7 </li><li> Quando si lavora con DNA a doppio filamento, determinare l&#39;orientamento del terminatore da testare. 7 Il plasmide PGR-Blue verifica solo terminatori legatura in 5 &#39;a 3&#39; sulla parte superiore (filamento in avanti). <ol><li> Convertire un fondo (reverse) Strand terminatore al suo complemento invertita per riorientare la sequenza di test in PGR-blu utilizzando il software gratuito on-line, ad esempio, scimmia. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;orientamento è determinato per essere corretta, aggiungere alla fine appiccicoso &quot;5&#39;-CGAC-3 &#39;&quot; al 5&#39; estremità del filo superiore. Aggiungere fine appiccicoso &quot;5&#39;-CCGC-3 &#39;&quot; al 5&#39; estremità del filo inferiore. 8 Questo assicurerà che inserto legatura sarà inserito nell&#39;appositoorientamento utilizzando GGA. </li><li> Una volta che le sequenze sono determinati, ordinare come singoli oligonucleotidi bloccati commercialmente. </li></ol> 2. ricottura oligonucleotidi (si applica solo a liofilizzato DNA) <ol><li> Risospendere singoli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 pM. </li><li> Fare 10x tampone ricottura: 1 M NaCl e 100 mM Tris-HCl pH 7,4. buffer di ricottura può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. Una volta buffer di ricottura è fatto e oligonucleotidi sono ri-sospesi, iniziare la ricottura 8. </li><li> Per ogni terminazione da testare, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 2 ml di 10x tampone di ricottura ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di oligonucleotide filo superiore (100 micron) dal terminatore desiderato. </li><li> Aggiungere 1 ml di oligonucleotide fondo filamento (100 micron) dal terminatore desiderato. </li><li> Creare un bollente ba acquaesimo con un bicchiere di 1.000 ml contenente circa 400 ml di acqua di rubinetto e posto su un piatto caldo. </li><li> Mettere le provette da microcentrifuga dal punto 2.6 in un galleggiante e far bollire per 4 minuti. Dopo 4 minuti, spegnere il calore a piastre, ma lasciare il tubo e galleggiare nel bagno d&#39;acqua per raffreddare lentamente O / N (18 ore) 8. Conservare le terminazioni ricotto a -20 ° C. </li></ol> 3. Golden Gate Assembly (Mix Standard - Costo efficiente) <ol><li> Fare un nM diluizione dei terminatori ricotto 40. Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi di 1 ml di Terminator mix ricotto (100 micron). <ol><li> campioni di centrifugazione per 30 secondi a 10.000 xg e memorizzare sul ghiaccio. </li></ol></li><li> In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore in uso, aggiungere 6 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Aggiungere 1 ml di commerciale DNA Ligase Buffer [300 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT, e 10 mm ATP]. Eseguire tutti i passaggi successivi su ghiaccio. </li><li> Aggiungere1 ml di PGR-blu (35-50 ng / ml) plasmide destinazione alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri commerciale ad alta fedeltà BsaI endonucleasi di restrizione alla provetta. </li><li> Aggiungere 0,5 microlitri di DNA ligasi commerciale alla provetta. </li><li> Centrifugare la miscela di reazione a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore. </li><li> Eseguire il programma termociclatore: 20 cicli di 1 minuto a 37 ° C seguita da 1 min a 16 ° C, seguiti da 1 ciclo di 15 min a 37 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. 8 </li></ol> 4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - tempo efficiente) <ol><li> Aggiungere 124 ml di acqua priva di nucleasi a 1 l di 100 micron terminazioni creato nel passaggio 2. Questo diluisce la concentrazione di DNA di terminazione a 40 nm ricottura.Eseguire questo passaggio in una nuova, etichettato 1,5 ml provetta. </li><li> In un nuovo tubo appropriata per il termociclatore, aggiungere 14 ml di acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che il nuovo tubo è etichettato di conseguenza. </li><li> Aggiungere 2 ml di Commercial Master Mix Buffer alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di PGR-Blue plasmide (35-50 ng / mL) alla provetta. </li><li> Aggiungere 2 ml di i 40 nm terminatori ricotto alla provetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di Commercial Master Mix alla provetta. </li><li> Centrifugare il tubo di 40 Nm a 10.000 xg per 120 sec. Quindi inserire il tubo direttamente nel termociclatore. </li><li> Eseguire il programma termociclatore: 1 ciclo di 60 min a 37 ° C seguita da 1 ciclo di 15 min a 55 ° C. Utilizzare i campioni immediatamente o congelare e conservare a -20 ° C. </li></ol> 5. Trasformazione e selezione Colony <ol><li> Preparare Luria Base (LB) piastre di agar Petri contenenti 1 mM concentratione di ampicillina (Amp) e una concentrazione di 10 mM di arabinosio (ARB). Preparare almeno 10 ml di 1 M L -arabinose soluzione madre perché questa soluzione madre verrà utilizzato nei passaggi successivi. </li><li> Utilizzare qualsiasi alta efficienza (10 8 - 10 9 trasformanti / mg) E. chimicamente competente coli (JM109), le cellule per la trasformazione. 9 Per ottenere i migliori risultati, aggiungere 3-5 ml della reazione legatura a 50 ml di cellule competenti. Quando si usano le cellule chimici competenti, seguire il protocollo di trasformazione specifico per le cellule utilizzate. </li><li> Stendere la metà (25 ml) delle cellule trasformate sul pre-riscaldato LB (Amp / ARB) piastre di agar utilizzando una sterile forma di L &quot;bastone da hockey&quot; e incubare O / N a 37 ° C. A causa del rapido tasso ampicillina di decomposizione, non incubare a 37 ° C superiore a 24 ore. </li><li> Eseguire la selezione delle colonie in base al colore mediante ispezione visiva. Una legatura di successo deve essere di colore bianco / giallo in luce visibile e fluorescenza verde undeR blu (450 nm) o la luce UV. Una legatura successo produrrà una colonia che è di colore blu sotto la luce visibile dopo 18 - 20 ore. </li></ol> 6. Verifica e quantificazione dei Terminator <ol><li> Preparare 5 ml sterili tubi LB-brodo con 1 mM ampicillina e 10 mm arabinosio. Il numero di tubi necessari dipende dal numero di terminatori essere testati più controlli (cellule con resistenza all&#39;ampicillina che non fluorescenti e cellule contenenti l&#39;uncut plasmide PGR-blu). </li><li> Sotto la luce visibile raccogliere 2-3 colonie bianche / gialle (passo 5,4) utilizzando un&#39;ansa sterile. Permettere ai campioni di incubare in brodi su un agitatore a 37 ° C e 160 rpm per 16-18 ore. Non incubare questi campioni per più di 24 ore. <ol><li> Facoltativamente, utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità cellulare ottica a 600 nm (OD 600) per garantire un&#39;adeguata crescita cellulare. In generale, un diametro esterno 600 di ~ 0,8-1,0 si osserva dopo 16-18 ore di crescita. </li></ol></li><li> Usouna piastra a 96 pozzetti sterili per i passaggi rimanenti. Eseguire questi passaggi in un ambiente asettico e in triplicato. Aggiungere 199 ml di brodo sterile LB + Amp / arabinosio (1 mM ampicillina / 10 mM arabinosio) in ciascun pozzetto. Includere camera sul piatto per tre comandi separati. <ol><li> Utilizzare i seguenti tre controlli: solo un bene (1) contenente brodo / arabinosio LB + Amp e un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (vuote) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Vedere la Figura 1 per il layout lettore di piastre. </li></ol></li><li> Pipettare 1 ml di soluzione di cella dal O / N brodi in singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti. </li><li> piastre di tenuta con una copertura traspirante e agitare per 18-20 ore a 37 ° C e 160 giri al minuto. </li><li> Utilizzando un lettore di piastre, determinare OD 600 con la letturaassorbanza a 600 nm. Misurare la fluorescenza GFP come segue: eccitazione 395 ed emissione 509. Misura RFP fluorescenza come segue: eccitazione 575 ed emissione 605. Dopo 18-20 ore, l&#39;OD 600 deve essere di circa 0,5. </li><li> Per normalizzare le variazioni nella crescita, utilizzare l&#39;equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" /> sia per la GFP e RFP. </li><li> Dopo la normalizzazione, determinare la resistenza di terminazione relativa utilizzando l&#39;equazione <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" /></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il passo più importante in questo protocollo è corretta progettazione oligonucleotide prima di ordinare. Gli oligonucleotidi devono avere le estremità coesive opportune aggiunte alla estremità 5 &#39;della parte superiore e inferiore trefoli per garantire che GGA incorporazione è possibile. Inoltre, è importante cambiare l&#39;orientamento delle terminazioni rivolto verso sinistra (terminatori che fermano la trascrizione sul filamento basso) a quella di destra di fronte (termina la trascrizione sul filo alto) terminatori perché GFP e RFP espressione è in alto a destra di fronte (in alto a filamento ) direzione. Due protocolli GGA separati e miscele tampone può essere utilizzato per testare terminatori in PGR-blu. Il mix standard di economia consiste di acquisto materiale individualmente e poi mescolati in laboratorio 8. Il secondo protocollo utilizza un master mix GGA pre-fatto commerciale. Mentre entrambi funzionano bene; il master mix commerciale è più tempo efficiente, ma è relativamente costoso rispetto alla miscela standard.In un ambiente di istruzione, può essere più economico per realizzare il mix GGA standard anticipo e congelare aliquote per uso singolo studente. Come risultato della modifica PGR per GGA e aggiungendo amilCP nell&#39;orientamento indietro per la selezione del colore, l&#39;espressione della GFP e RFP viene limitata nello uncut plasmide PGR-Blue e non devono essere utilizzati come controllo di riferimento per determinare la forza terminatore relativa. Tuttavia, tutte le modifiche vengono rimossi durante il processo di clonazione permettendo una corretta quantificazione di forza terminatore relativa. Anche se è meglio usare i non modificati PGR plasmide risultati simili originali può essere ottenuto mediante la clonazione di una sequenza nota di non essere un terminatore in PGR-blu. Entrambi i controlli hanno mostrato livelli uguali di GFP e l&#39;espressione RFP (Figura 5) e, cosa ancora più importante, ha avuto simili rapporti GFP / RFP. Per stretta regolazione dell&#39;espressione genica, il plasmide PGR-blu esprime costitutivamente il regolatore AraCdel pBAD (arabinosio inducibile) promotore. 10,11 A seconda della linea cellulare utilizzata una concentrazione elevata arabinosio può essere richiesto per l&#39;espressione di GFP e RFP. Buoni risultati sono stati ottenuti utilizzando una concentrazione di 10 mM arabinosio in E. linea cellulare coli JM109. cellule trasformate devono essere o bianco / giallo o blu sotto la luce visibile. Sotto la luce UV o luce blu (450 nm), è comune vedere solo la fluorescenza verde, ma non rosso in cellule trasformate positivamente. Tuttavia, la fluorescenza RFP è stato rilevato utilizzando il lettore di piastre. Le terminazioni utilizzate come prova di concetto per questo protocollo sono stati identificati nel mycobacteriophage Bernal13. Tuttavia, PGR-blu funziona solo in E. coli e non è un vettore navetta che può essere espresso in altre specie di batteri. Il risultato è che non sappiamo esattamente come le terminazioni individuati funzionerebbero nel loro ambiente di accoglienza ed è una potenziale limitazione. Il socio cassetta di espressioneD con PGR-Blue è fiancheggiato da siti di clonazione tradizionali e potrebbe essere spostato in un vettore shuttle appropriata. Ciò consentirebbe singoli ricercatori di adattare PGR-blu alla loro specie batteriche specifiche, se lo si desidera. Mentre ci sono altre procedure di analisi di sequenza high-throughput disponibili, la maggior parte utilizza un approccio di genetica in avanti. Questi approcci utilizzano mutagenesi sito-specifica o oligo-sintesi per generare centinaia di migliaia di potenziali combinazioni sequenza. 12,13 Una volta creato, l&#39;effetto di ogni modifica sequenza è poi catalogato. Tuttavia, PGR-blu è stato progettato per una più diretta applicazione genetica inversa. Quando si analizza un romanzo genoma in silico, è comune osservare più terminatori potenziali in una data zona. PGR-blu è stato progettato per aiutare i ricercatori a perfezionare rapidamente il loro nelle previsioni in silico, consentendo loro di testare le sequenze putative in vivo. Va notato PGR test terminatore Plasmid è stato usato per quantificare la forza terminatore in 582 sequenze 4, tuttavia PGR utilizza uno standard di assemblaggio di restrizione enzimatica (ad esempio, basic assembly bio-mattone (BBA)), un processo di clonazione relativamente tempo rispetto al GGA. 7 Il plasmide PGR-Blue è stato progettato per funzionare in modo simile a PGR ma utilizza una più rapida selezione procedura di clonazione e il colore delle colonie. Queste modifiche, insieme al nostro protocollo semplificato, rendono PGR-blu adattabile sia per l&#39;educazione e laboratori di ricerca orientata.

Large synthetic biology projects necessitate the use of highly effective transcription terminators to help regulate gene expression. Identification of novel terminators requires bioinformatic analysis of novel genomes. However, as increasing amounts of bioinformatic software are developed, each with a unique algorithm utilized for prediction, more discrepancy between putative results occurs. Because this process is somewhat subjective and is done in silico, these predictions need biological confirmation.1 Additionally, the volume of putative terminators identified through in-silico analysis requires the use of cloning strategies that can be completed in a relatively short time frame. 
The PGR-Blue plasmid is a modification of the PGR plasmid that has been redesigned to use Golden Gate Assembly (GGA) to simplify the cloning procedure by allowing for all reaction steps to be simultaneously performed in one micro-centrifuge tube.2,3 Color selection was incorporated into the plasmid to increase the ease of identifying positive colonies. A successful ligation should be white/yellow in visible light and fluoresce green under blue (450 nm) or ultraviolet (UV) light when grown on plates containing arabinose. Because uncut pGR-blue contains a blue chromo protein (amilCP), colonies containing an unmodified plasmid are blue under visible light. This simplification along with the streamlined protocol allows researchers to proceed from bioinformatic identification to biological confirmation in three to four days. The design nature of this system can be beneficial both in the research lab and in educational settings.
The pGR-Blue plasmid allows for quantification of terminator strength.4 A single arabinose inducible promoter is used to produce green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (RFP). The terminator is cloned into the plasmid after the GFP sequence but before the RFP sequence, thus stopping the transcription of the RFP protein. The strength of the terminator is determined by the ratio of GFP produced to RFP produced. 
The Vision and Change5 report suggested that Science, Technology, Engineering and Math (STEM) education incorporate research based experiences into the classroom.6 However, this requires the development of protocols that can be done by students with limited skill sets in a defined time frame. While the protocol can be accomplished in as little as three days, it was also designed so that each major step could be accomplished in a separate weekly (2-3 hr) lab period to create a Course Research Experience (CRE). When used in this manner, the procedure will take between three and six weeks and is appropriate for both introductory and advanced courses in Genetics, Cell Biology or Bioinformatics.

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue Plasmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(Sterile Sheets)</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Sterile Sheets only</td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligase Buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>The non-HF enzyme will work but is less heat stable.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix refered to in the protocol.</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Round Microcentrifuge Floating Rack</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-(+)-Arabinose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-Arabinose will not induce the pBAD promoter</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Broth, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Plate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix &amp;amp; Go Competent Cells - Strain JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Use company recommended transformation protocol</td></tr><tr><td>ApE: A plasmid editor-software</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Comercial Oligonucleotide synthesis</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>mycobacteriophage &quot;Bernal13&quot;</td><td>Genebank</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell</td><td>Life Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</td><td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid verification of terminators using the pgr-blue plasmid and golden gate assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

Questo protocollo produrrà cellule contenenti PGR-blu con un terminatore legatura tra la GFP e RFP utilizzando il Golden Gate di montaggio (Figura 2). colonie positive contenenti inserto legatura possono essere selezionati in base al colore. Alla luce visibile colonie positive saranno bianco / giallo e falsi positivi produrranno colonie blu dopo 18-20 ore di incubazione a 37 ° C (Figura 3). Dopo la selezione delle colonie, un lettore di piastra può essere utilizzata per determinare la resistenza di terminazione. Come prova di concetto, sei terminazioni putativi (T1-6) sono stati identificati bioinformatically nel mycobacteriophage Bernal13. I risultati in Figura 4 mostrano forza terminatore relativa con cellule esprimenti uncut / non modificato PGR come controllo. Se un terminatore predetto ha un rapporto GFP / RFP simile a PGR (~ 0.0) o al di sotto di 0,1, quindi la sequenza era determinato a non essere un terminatore(T5 e T6). Tuttavia, numericamente ogni decimo aumento rappresenta un aumento volte forza terminatore rispetto al controllo. Ad esempio, T3 ha un alto rapporto di espressione GFP rispetto alla RFP e ha mostrato un aumento di 5 volte (0,5 sul grafico) nella resistenza di terminazione rispetto al controllo ed era considerato un terminatore forte (Figura 4). I dati sono stati raccolti in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva. Per determinare il miglior controllo di riferimento per la quantificazione resistenza di terminazione, abbiamo confrontato i dati grezzi utilizzando il plasmide PGR originale che non contiene terminatore e PGR-Blue clonato con una sequenza conosciuta non essere un terminatore. Entrambi i controlli hanno mostrato livelli simili di GFP e di espressione RFP (Figura 5) e, cosa ancora più importante, ha prodotto simili GFP / RFP rapporti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54064/54064fig1.jpg" /> FIGURA 1. S chematic Detailing Piastra Reader layout. camera dovrebbe essere incluso nel lettore di piastre per tre comandi separati (verde). Un brodo / arabinosio LB + Amp bene (1) contenente solo ed un pozzo (2) per le cellule competenti non trasformate (in bianco) per servire come un vuoto. Per la quantificazione (3) della forza terminatore, cellule contenenti non tagliati PGR originale o contenenti PGR-blu legatura con un non-terminazione sequenza dovrebbero essere incluse (controllo di riferimento per la quantificazione). Il resto della piastra (giallo) può essere utilizzato per testare terminatori putativi. Si suggerisce di tutte le cellule essere coltivate in triplice copia e mediate prima dell&#39;analisi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54064/54064fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54064/54064fig2.jpg" /> Figura 2. Orientamento clonazione del sito ed espressione diPGR-blu. espressione costitutiva di AmilCP (Blu Chromo Protein) è guidato nella direzione opposta (in basso a filo) di GFP e RFP. Quando digerito con BsaI, AmilCP ed i siti di riconoscimento BsaI vengono rimossi e il terminatore da testare è legatura in modo permanente nel plasmide. Il filo superiore e filo inferiore di un terminatore con le estremità appiccicose appropriati sono mostrati. I geni regolatore AraC e ampicillina resistenza sono nel plasmide, ma non mostrati. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54064/54064fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54064/54064fig3.jpg" /> Figura 3. Colony Selezione dopo la clonazione. (A) Piastra Rappresentante dopo PGR-blu / terminazione legatura (mix standard) e trasformazione cellulare. colonie blu rappresentano legature falliti e bianco col / gialloOnies (indicato dalla freccia) sono legature di successo. (B) Un ingrandita immagine della stessa piastra mostrando colonie rappresentativi dopo trasformazione. Il colore di sfondo è stata modificata digitalmente per evidenziare ulteriormente le differenze di colore colonia. Cellule trasformate (E.coli -JM109) sono stati placcati in plats agar LB contenenti ampicillina e arabinosio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54064/54064fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54064/54064fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione dei sei Terminator diversi in PGR-blu. Sei terminazioni putativi (T1-6) sono stati bioinformatically identificato nella mycobacteriophage Bernal13. I risultati mostrano relativa fluorescenza. Tutti i risultati sono stati normalizzati utilizzando cellule contenenti uncut / non modificato PGR come controllo. T3 è risultato essere un forteTerminator. Tutti i risultati rappresentano le singole colonie cresciute in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva. Le barre di errore rappresentano le deviazioni tra i punti medi di dati. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54064/54064fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54064/54064fig5.jpg" /> Figura 5. GFP e RFP espressione nei controlli. Espressione di GFP e RFP in uncut / non modificato PGR e due diverse sequenze di terminazione non inserita in PGR-blu. Tutti i risultati rappresentano le singole colonie cresciute in triplice copia e in media per la rappresentazione visiva. Le barre di errore rappresentano le deviazioni tra i punti medi di dati. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54064/54064fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.6K Views.  Ouachita Baptist University. This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Ricerca

Genetica

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here is a powerful experimental approach for analyzing the transcription termination defect under physiological conditions. Like the traditional TRO assay, it relies on the presence of a transcriptionally active polymerase beyond the 3&#8242; end of the gene as an indicator of a transcription termination defect1. It overcomes two major problems encountered with the traditional TRO assay. First, it can detect if the polymerase reading through the termination signal is the one that initiated transcription from the promoter-proximal region, or if it is simply representing a pervasively transcribing polymerase that initiated non-specifically from somewhere in the body or the 3&#8242; end of the gene. Secondly, it can distinguish if the transcriptionally active polymerase signal beyond the terminator region is truly the readthrough sense mRNA transcribing polymerase or a terminator-initiated non-coding anti-sense RNA signal. Briefly, the protocol involves permeabilizing the exponentially growing yeast cells, allowing the transcripts that initiated in vivo to elongate in the presence of the BrUTP nucleotide, purifying BrUTP-labelled RNA by the affinity approach, reverse transcribing the purified nascent RNA and amplifying the cDNA using strand-specific primers flanking the promoter and the terminator regions of the gene2.

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 nuclease or a nuclease-dead dCas9 fusion protein) is targeted to a specific site in the genome by a small synthetic RNA known as the guide RNA, or gRNA. The bipartite nature of the CRISPR system enables its use in screening approaches since plasmid libraries containing expression cassettes of thousands of individual gRNAs can be used to interrogate many different sites in a single experiment. 
To date, gRNA sequences for the construction of libraries have been almost exclusively generated by oligonucleotide synthesis, which limits the achievable complexity of sequences in the library and is relatively cost-intensive. Here, a detailed protocol for CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity), a simple and cost-effective method for the generation of highly complex gRNA libraries based on enzymatic digestion of input DNA, is described. Since CORALINA libraries can be generated from any source of DNA, plenty of options for customization exist, enabling a large variety of CRISPR-based screens.

Methods for generating large-scale gRNA libraries should be simple, efficient and cost-effective. We describe a protocol for the production of gRNA libraries based on enzymatic digestion of target DNA. This method, CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) presents an alternative to costly custom oligonucleotide synthesis.

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Biochimica

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Bioingegneria

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the CRISPR-Cas systems and their natural inhibitors-the anti-CRISPR proteins (Acrs)-provides a new tool to design and implement in vivo gene digital circuits. Here, we describe a protocol that follows the idea of the "Design-Build-Test-Learn" biological engineering cycle and makes use of dCas9/dCas12a together with their corresponding Acrs to establish small transcriptional networks, some of which behave like Boolean gates, in Saccharomyces cerevisiae. These results point out the properties of dCas9/dCas12a as transcription factors. In particular, to achieve maximal activation of gene expression, dSpCas9 needs to interact with an engineered scaffold RNA that collects multiple copies of the VP64 activation domain (AD). In contrast, dCas12a shall be fused, at the C terminus, with the strong VP64-p65-Rta (VPR) AD. Furthermore, the activity of both Cas proteins is not enhanced by increasing the amount of sgRNA/crRNA in the cell. This article also explains how to build Boolean gates based on the CRISPR-dCas-Acr interaction. The AcrIIA4 fused hormone-binding domain of the human estrogen receptor is the core of a NOT gate responsive to &#946;-estradiol, whereas AcrVAs synthesized by the inducible GAL1 promoter permits to mimic both YES and NOT gates with galactose as an input. In the latter circuits, AcrVA5, together with dLbCas12a, showed the best logic behavior.

CRISPR-Cas systems and anti-CRISPR proteins were integrated into the scheme of Boolean gates in Saccharomyces cerevisiae. The new small logic circuits showed good performance and deepened the understanding of both dCas9/dCas12a-based transcription factors and the properties of anti-CRISPR proteins.

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Biologia

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

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Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

Un protocollo universale per gRNA su larga scala produzione di libreria da qualsiasi fonte di DNA

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Circuiti digitali genici basati su sistemi CRISPR-Cas e proteine anti-CRISPR

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Plasmidi derivati da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

Rapida verifica di Terminator Uso del PGR-blu plasmidi e Golden Gate Assembly

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Plasmidi derivati da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici