Name: fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids
Uploaded: 2016-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids at JoVE.com

Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

Etica dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti campo di campionamento e di animali sono stati approvati dalla Scuola di animali, rurale e Scienze Ambientali (ARES) alla Nottingham Trent University. 1. Raccolta di campioni di feci NOTA: I guanti devono essere indossati durante la manipolazione dei campioni fecali e metanolo. Se c&#39;è un forte sospetto che un animale possa essere affetto da una zoonosi, indumenti protettivi, come un camice da laboratorio dovrebbe essere indossati. <ol><li> Raccogliere i campioni fecali appena possibile (entro min a qualche ora) dopo la defecazione e metterli in un sacchetto di campionamento. Prendere tre a cinque sotto-campioni di qualsiasi campione defecato con un peso totale di circa 10 g. Etichettare il sacchetto con l&#39;ora e la data di raccolta, ID individuale, e congelare il campione a -20 ° C fino al momento dell&#39;analisi. </li><li> Per ridurre al minimo errore, congelare tutti i campioni a -20 ° C fino a quando lo studio è completo quindi di raccogliere i campioni insieme per l&#39;analisi in un unico lotto. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. fecale Hormone Estrazione <ol><li> Lasciare i campioni di feci per scongelare a temperatura ambiente. </li><li> Assicurarsi che i campioni sono omogeneizzati miscelando manualmente ogni campione nel proprio sacchetto di campionamento. </li><li> Per ogni campione pesa 0.50 (± 0,003 g) di materiale fecale su una microbilancia in una barca pesare poi trasferire le feci in una fiala di vetro 8 ml. Utilizzare una nuova barca pesare per ogni campione e pulire le pinzette con il 30% di metanolo tra ogni campione. </li><li> Unire la 0,5 g di materiale fecale con 5 ml di metanolo al 90%: acqua e agitare O / N in un agitatore orbitale a RT. </li><li> La mattina seguente, Vortex il campione e quindi si centrifuga per 20 minuti a 600 g. </li><li> Decantare la frazione di metanolo in un tubo di vetro 16 x 125 mm 2 e posto in un rack in un bagnomaria regolato ad una temperatura di 37 ° C. Portare a secco con aria sotto cappa. Sciacquare la fiala di estrazione e posizionare il pellet fecale rimanente in un sacchetto di rifiuti clinici per lo smaltimento. </li><li> Risospendere gli estratti fecali in 100%, 1 ml di metanolo e trasferire in una provetta di polipropilene da 12 x 75 mm 2. Immediatamente tappo e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol> 3. Analisi Hormone <ol><li> Effettuare l&#39;analisi con un collegato-immuno-enzimatico (EIA) utilizzando antisiero policlonale corticosterone CJM006. NOTA:. Un secondo EIA è stato testato (cortisolo R4866 antisiero, ma questo non è riuscito a raggiungere la fase di validazione biochimica (vedere paragrafo 4.1) L&#39;antisiero policlonale corticosterone CJM006 e cortisolo R4866 antisiero e la rispettiva HRP del sono forniti da CJ Munro, University of California, Davis, CA. </li><li> Diluire l&#39;antisiero a 1: 15.000 in tampone di rivestimento (0,05 M NaHCO3, pH 9.6) con una pipetta ripetitiva e un puntale 50 microlitri, caricare una micropiastra a 96 pozzetti con 50 microlitri / bene. Coprire la piastra con un sigillante ed incubare O / N a 4 ° C. Lascia due pozzi non rivestiti per rappresentare i pozzi legame non specifico (NSB). </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso lavare i piatti microtitolazione cinque volte utilizzando un lavatore micropiastra automatizzato (soluzione di lavaggio; 0,15 M di NaCl, 0,05% di Tween 20). </li><li> Caricare le piastre con 50 microlitri per bene per la NSB di e pozzi [tampone EIA (0,1 M NaPO 4, 0,149 M di NaCl, 0,1% di albumina sierica bovina, pH 7,0) soltanto] &#39;zero&#39;, standard (corticosterone, 3.9 - 1000 pg / bene) o campioni fecali estratto (opportunamente diluiti a 1:20 tampone EIA, vedere paragrafo 4.1). Norme e zeri devono essere eseguiti in triplice copia e quadruplice, rispettivamente. Diluito campioni estratto fecale e NSB di dovrebbero essere eseguiti in duplicato. </li><li> Seguire questa immediatamente con l&#39;aggiunta di 50 ml / pozzetto dell&#39;etichetta perossidasi coniugato ᵻ diluito in tampone EIA a 1: 70.000. </li><li> Incubare le piastre microtitolazione al buio per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le piastre microtitolazione con soluzione di lavaggio 5 volte e incubare le piastre a RT al buio con 100 l / well di RT substrato [0,4 mM 2,2&#39;-Azino-di- (3-ethylbenzthiazoline solfonico) sale diammonico, 1.6 mM H 2 O 2, 0,05 M citrato, pH 4,0]. Preparare il substrato immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Utilizzare un Spettrofotometro alla lunghezza d&#39;onda di 405 nm per leggere le piastre di microtitolazione. L&#39;incubazione delle piastre è considerata completa quando la densità ottica dei pozzetti di zero raggiunge da 0,8 o 1,0. </li><li> Per assicurare la ripetibilità, utilizzare i controlli [standard EIA o un campione biologico diluiti in tampone EIA di consolidare a circa il 30% (standard EIA), il 50% (un campione per esempio biologica, pool di cavallo domestico estratto fecale) e il 70% (standard EIA) ] a dimostrare un intra e inter-assay coefficienti di variazione di &lt;10% e &lt;15%, rispettivamente. </li></ol> 4. Enzyme Linked-immunologico: convalida per la specie di studio e sesso <ol><li> Biochimica Validation (parallelismo) <ol><li> Utilizzando tampone EIA, eseguire una diluizione seriale del pool fecale in piùct, idealmente preso da presunti campioni di alta e bassa concentrazione di ormoni da diversi individui (range: pulito, 1: 2 a 1: 8192) ed eseguire sulla VIA, come descritto nella sezione 3. NOTA: Un parallelismo si considera raggiunto quando le diluizioni seriali di estratti fecali producono una curva spostamento parallelo ai risultati della curva e di regressione lineare standard di dimostrare R2&gt; 0,90, una pendenza&gt; 0,50 e p &lt;0.05. L&#39;estratto fecale diluito seriale che lega circa il 50% sulla curva standard dovrebbe essere considerata la diluizione ideale per eseguire tutti gli estratti fecali (ad esempio, 1:20). Non vi è alcuna interferenza considerato sul test quando i risultati di regressione lineare dimostrano R2&gt; 0,90 e p &lt;0.05. </li></ol></li><li> Biochimica Validation (Interference) <ol><li> Spike 200 ml di standard diluite in serie (zero, 3.9 a 1000 ng / pozzetto corticosterone) con 200 ml di estratto fecale opportunamente diluito in pool [diluito al 50% legame determinati da Parallelism (1:20)] ed eseguire sulla VIA, come al punto 3. A seguito di trama analisi EIA la concentrazione osservata meno il fondo (concentrazione del campione zero) rispetto alla concentrazione prevista. NOTA: se l&#39;aggiunta di estratto fecale pool diluito per gli standard non altera in modo significativo la quantità prevista e lineari risultati della regressione produce R 2&gt; 0,90, un pendio vicino al 1.0 e p &lt;0.05. Nessuna interferenza con l&#39;EIA è stato raggiunto. </li></ol></li><li> Validazione biologica: NOTA: Una dimostrazione che la VIA scelta ha la capacità di misurare le variazioni biologicamente rilevanti di ormone di interesse [ad esempio, l&#39;aumento delle concentrazioni di glucocorticoidi a seguito di un farmacologica (ACTH è spesso una procedura di licenza) o una sfida biologica (ad esempio, psicologica e / o ambientale; più probabile che sia un evento non regolamentata opportunistica)]. <ol><li> Selezionare, estrarre e analizzare i campioni di feci per le concentrazioni del metabolita glucocorticoidiutilizzando il processo descritto nelle sezioni 1 - 3 prima e dopo un evento impegnativo. NOTA: Un evento impegnativo sarà determinate specie. Un metodo esempio è riportato qui sotto cavallo domestico. Esempi di eventi impegnativi per i cavalli sono stati pubblicati in precedenza compreso l&#39;uso di gestione 9 e allevamento procedure 16. Un aumento significativo della concentrazione di metaboliti glucocorticoidi dopo l&#39;evento impegnativo deve essere osservato e confermato con l&#39;analisi statistica. Questo deve incorporare, se del caso, l&#39;effetto delle misure ripetute, data campione e singoli. validazione biologica è quindi considerato raggiunto. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Morm&#232;de, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+hypothalamic-pituitary-adrenal+function+as+a+tool+to+evaluate+animal+welfare.">Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare.</a> Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).</li><li>Lane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+non-invasive+glucocorticoid+measures+be+used+as+reliable+indicators+of+stress+in+animals?.">Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?.</a> Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).</li><li>Morgan, K. N., Tromborg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sources+of+stress+in+captivity.">Sources of stress in captivity.</a> Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).</li><li>Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).</li><li>Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Do+Glucocorticoids+Influence+Stress+Responses?+Integrating+Permissive,+Suppressive,+Stimulatory,+and+Preparative+Actions.">How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions.</a> Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).</li><li>Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+steroids+in+the+human+gut.">Degradation of steroids in the human gut.</a> Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).</li><li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+monitoring+of+adrenocortical+activity+in+carnivores+by+fecal+glucocorticoid+analysis.">Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis.</a> General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).</li><li>Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+causes+increased+concentrations+of+glucocorticoid+metabolites+in+horse+faeces.">Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces.</a> Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).</li><li>Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domesticated+horses+differ+in+their+behavioural+and+physiological+responses+to+isolated+and+group+housing.">Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing.</a> Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).</li><li>Wielebnowski, N., Watters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+fecal+endocrine+monitoring+to+conservation+and+behaviour+studies+of+wild+mammals:+important+considerations+and+preliminary+tests.">Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests.</a> Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).</li><li>Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+steroids:+guidelines+for+a+practical+application.">Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).</li><li>Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+liquid+and+solid+digesta+retention+in+ruminants,+equines+and+rabbits+given+timothy+hay.">The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay.</a> British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+monitoring+of+hormones+in+bird+droppings:+biological+validations,+sampling,+extraction,+sex+differences+and+the+influence+of+diet+on+hormone+metabolite+levels.">Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).</li><li>Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sex+and+time+of+day+on+metabolism+and+excretion+of+corticosterone+in+urine+and+feces+of+mice.">Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice.</a> General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).</li><li>Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+corticosterone+metabolites+in+chicken+droppings.">Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings.</a> British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).</li><li>Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+aversive+nature+of+an+animal+management+procedure+using+behavioural+and+physiological+measures.">An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures.</a> Physiology &amp; Behaviour. 118, 32-39 (2013).</li><li>Goymann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+use+of+non-invasive+hormone+research+in+uncontrolled,+natural+environments:+the+problem+with+sex,+diet,+metabolic+rate+and+the+individual.">On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual.</a> Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).</li><li>Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+stress+in+wildlife:+techniques+for+quantifying+glucocorticoids.">Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids.</a> Oecologia. 166, 614-619 (2011).</li><li>Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+versatile+enzyme+immunoassay+for+non-invasive+assessment+of+glucocorticoid+metabolites+in+a+diversity+of+taxonomic+species.">Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species.</a> General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).</li><li>Touma, C., Palme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fecal+glucocorticoid+metabolites+in+mammals+and+birds:+the+importance+of+validation.">Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).</li><li>Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fecal+glucocorticoid+metabolite+measures+in+conservation+biology+research:+considerations+for+application+and+interpretation.">Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation.</a> General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Analisi corticosterone fecale fornisce un mezzo per valutare i modelli a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli. La natura non invasiva del metodo supera gli effetti confondenti di altri metodi di campionamento utilizzati per valutare l&#39;attività del surrene tra cui saliva e nel plasma analisi 9. Inoltre la tecnica ha un vantaggio non invasivo chiaro se lo studio cavalli liberi che vanno. Ci sono diversi punti chiave da discutere riguardo a questo metodo e il suo uso appropriato. Un passo fondamentale per il protocollo è la validazione del test per la specie in questione e la scelta degli anticorpi appropriata. Se l&#39;anticorpo utilizzato cross-reagisce con metaboliti di glucocorticoidi strutturalmente simili, ma funzionalmente differenti questo potrebbe confondere i risultati 17. Pertanto, saggi per misurare metaboliti dell&#39;ormone richiedono una validazione fisiologica o biologica attenta, esistono cui dettagli in letteratura 18,19 e nel descr protocolloibed. Deve essere considerato incluso freschezza del campione e l&#39;esposizione ambientale che hanno entrambi dimostrato di influenzare i livelli di metaboliti ormonali 20 La condizione del campione fecale. Pioggia eccessiva o l&#39;esposizione del sole sono noti per causare aumenti o diminuzioni delle concentrazioni dei metaboliti a causa di metabolizzazione batterica 21. I ricercatori che desiderano raccogliere campioni di vari gradi di freschezza devono studiare gli effetti del tempo sulla integrità del campione, oltre all&#39;impatto ambientale. Questo può essere fatto prima dello studio attraverso la creazione di un piccolo esperimento e periodicamente il campionamento di feci da individui di sesso maschile e femminile, con vari gradi di freschezza e l&#39;esposizione a variabili climatiche. Nella maggior parte degli scenari di ricerca, campioni provenienti da individui noti sarà utile o necessario 10. In cavalli domestici ciò può essere ottenuto controllando un gruppo per defecazione o utilizzando marcatori alimenti ingeriti per identify feci provenienti da individui in gruppi più grandi 12. Nelle specie che vanno liberi questo potrebbe rivelarsi molto tempo come sarà richiesto il monitoraggio individuale. Nella scelta del metodo di analisi glucocorticoidi si deve considerare che i risultati del test corticosterone fecale rappresentano un campione riunito nel tempo piuttosto che un punto nel tempo misura; Pertanto, ci sarà meno fluttuazione nei dati. Se il ricercatore è interessato a effetti a lungo termine di una situazione, tecnica di allevamento o pratica di gestione, allora l&#39;analisi fecale offre una tecnica appropriata. Se è necessaria una valutazione di modelli a breve termine nella concentrazione dell&#39;ormone poi plasma o analisi salivare sarebbe il metodo preferito.

Gli obiettivi metodo descritto per analizzare le concentrazioni di corticosterone nelle feci equine per fornire una valutazione non invasiva dell&#39;attività surrenale. Misurazione dell&#39;attività (HPA) dell&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene è un approccio accettato di studiare la risposta a situazioni potenzialmente avversi in entrambe le specie in cattività e nazionali. La tecnica di riferimento e il metodo più diffuso è l&#39;uso di plasma sanguigno 1 Tuttavia, metodi alternativi come l&#39;analisi fecale sono state sviluppate per superare lo stress indotto mediante campionamento sangue stesso e permettere la possibilità di monitorare le specie che vanno. Durante una situazione di avversione, l&#39;omeostasi fisiologica è interrotta. L&#39;ipotalamo nel cervello rilascia ormone di rilascio della corticotropina (CRH), che agisce sulla ghiandola pituitaria anteriore e stimola il rilascio di ormone adrenocorticotropo (ACTH). ACTH entra nel flusso sanguigno e stimola la corteccia surrenale a secernere species glucocorticoidi specifici (GC). I glucocorticoidi sono strettamente legate ad eventi stressanti piuttosto che essere prodotta in modo coerente in tutti gli stati di energia accresciuta quindi sono spesso misurati in preferenza rispetto ad altri di stress legato ormoni 2. I glucocorticoidi sono responsabile di diversi effetti di adattamento nei cavalli. Energia viene rapidamente mobilizzato da siti di stoccaggio nel corpo sotto forma di acidi grassi e glucosio, assunzione di ossigeno viene aumentata, funzione sensoriale è migliorata 3 e il flusso di sangue è diminuita ad aree non necessarie per il movimento 4. Così come in qualità di un meccanismo di coping, l&#39;aumento indotto stress nella glucocorticoidi può anche aiutare a preparare l&#39;animale per il prossimo 5 fattore di stress. Valutare livelli dell&#39;ormone nel plasma e nella saliva coinvolge misurare l&#39;ormone effettivo circolante Tuttavia, misurando i metaboliti nelle misure feci il prodotto finale del metabolismo dell&#39;ormone. steroidi circolanti sono catabolizzati nella liver prima di escrezione della bile dove subiscono ulteriori modifiche facilitati dalle attività enzimatiche della flora batterica intestinale all&#39;interno della traccia 6. Pertanto, saggi immunologici diretti verso glucocorticoidi nel sangue può non essere adatto per l&#39;analisi dei metaboliti fecali glucocorticoidi 7. Come raccolta fecale può essere effettuata con nessun disturbo al cavallo, analisi delle feci per corticosterone, è stato ampiamente utilizzato per monitorare l&#39;attività HPA in una serie di circostanze. Corticosterone elevata nelle feci dei cavalli è stata riportata in risposta a situazioni potenzialmente avversi anche durante post-operatorio trattamento veterinario 8 e nelle abitazioni restrittiva 9. Campionamento fecale riflette un livello di glucocorticoide pool nel corso del tempo, piuttosto che il punto di campionamento in tempo offerto dal plasma e la saliva che lo rende adatto per il monitoraggio a lungo termine, cronica o modelli stagionali 10. A causa della non-invasivanatura del metodo, i campioni possono essere ritirati ripetutamente per un individuo senza la necessità di cattura o di ritenuta 11. Tuttavia, specie specifica il tempo di transito intestinale deve essere preso in considerazione quando si pianifica un protocollo di campionamento. Nei cavalli, il tempo di transito intestinale è di circa 18 ore 12 Pertanto, la risposta surrenale e successive metaboliti corticosterone possono essere rilevati nelle feci un giorno dopo attivazione iniziale dell&#39;asse HPA. Quando utilizzando tecniche non invasive immunodosaggio una validazione accurata per le specie oggetto di indagine è essenziale 13. Inoltre, le differenze di sesso ormone metaboliti sono stati segnalati probabilmente a causa di differenze nel tasso metabolico e il tipo di metabolita corticosterone escreto nelle varie specie, tra cui topi, 14 e polli 15. Era quindi importante nell&#39;ambito di questo metodo che il test è stato convalidato per l&#39;uso in maschi e femmine cavalli domestici come dettagliato in the protocollo. Questa differenza nel metabolismo ormonale tra i generi ha conseguenze per la qualità dei dati eppure raramente si rivolge e incluso come parte di convalida del test. Questo metodo non invasivo consente la valutazione a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli domestici. I dettagli del protocollo sia la validazione del test e la tecnica di analisi in sé.

<table><tbody><tr><td>Corticosterone antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Cortisol antibody &amp;amp; HRP kit</td><td>Coralie Munro - UC Davis</td><td></td><td>No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays</td></tr><tr><td>Corticosterone synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-23-7</td><td>Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Cortisol synthetic standard hormone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15087-01-1</td><td>Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>497-19-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10049-21-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-92-9</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>ABTS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30931-67-0</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 4</td><td>VWR</td><td>332732B</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 7</td><td>VWR</td><td>332742D</td><td></td></tr><tr><td>Buffer capsules - pH 10</td><td>VWR</td><td>332762H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td>Irritant. Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Irritant</td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>BFS-525-010A</td><td></td></tr><tr><td>Air compressor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer +printer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fridge-freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drying apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>+tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flammable liquid storagecabinet</td><td>VWR</td><td>649-002</td><td></td></tr><tr><td>Fume cupboard</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot-plate stirrer</td><td>VWR</td><td>640-282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate washer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research&amp;reg; pipettes - multipack option 2</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 1,000 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 200 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette - 20 &amp;micro;l</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette filler</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Progen Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Hilsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water purification system</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal glucocorticoid analysis: non-invasive adrenal monitoring in equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

cavalli domestici (n = 16, 8 cavalle, 8 castroni), con un&#39;età media di 15 anni (± 3) sono stati raggruppati in base al sesso e sottoposti a quattro disegni abitative con crescenti livelli di isolamento sociale (n = 4 cavallo / trattamento). Housing 1 coinvolti cavalli che vivono in un ambiente mandria, simulando attentamente il loro habitat naturale. Housing 2 coinvolti cavalli che vivono in coppie in una stalla coperta. Housing 3 cavalli coinvolti alloggiati solo nelle stalle, ma con il contatto visivo per altri cavalli e abitazioni 4 totale isolamento coinvolti dei cavalli. L&#39;esposizione a ciascun trattamento era in un disegno a blocchi randomizzati per un periodo di cinque giorni. A seguito di questo i cavalli erano risultate in paddock in erba nei loro gruppi sperimentali per due giorni prima dell&#39;esposizione al successivo trattamento custodia. I campioni fecali sono stati prelevati una volta al giorno nei giorni 1, 2, e 3 spese all&#39;interno di ogni trattamento della custodia n = 8 cavalli (n = 2 cavalli all&#39;interno di ogni trattamento). I campioni fecali sono stati raccolti appena possibile ed entro 1 ora dopo la defecazione. Tutti i campioni sono stati raccolti dopo 1.200 ore il primo giorno intero di senso stallaggio che il primo campione il primo giorno è stato raccolto almeno 20 ore dopo che il cavallo è stato introdotto per il trattamento degli alloggi. I campioni di giorno uno, due e tre (totale di 24 campioni al design del corpo) sono stati valutati per i livelli di corticosterone fecali riflettenti del passato 18 ore a causa della velocità di passaggio del contenuto gastrointestinale 12. Gli stessi singoli cavalli sono stati usati per l&#39;analisi fecale durante lo studio. Per tutti i dettagli di questa sfida biologica, compresi i parametri misurati supplementari si prega di fare riferimento alle pubblicati lavoro 9 esempi alternativi di eventi impegnativi per cavalli domestici si possono trovare anche nella letteratura 16. Questa sezione fornisce esempi di risultati di una convalida biochimica (parallelismo) sia per corticosterone e cortisolo nelle feci cavallo domestico maschili e femminili. Questa sezione fornisce anche dati rappresentativi ottenuti dall&#39;estrazione fecale e l&#39;analisi EIA. I risultati sono stati ottenuti come parte di un più ampio studio che ha indagato l&#39;impatto di isolamento sociale causato dal design del corpo, sul comportamento e la fisiologia equina 9. I risultati della convalida biochimica ha rivelato che la VIA corticosterone era appropriato per misurare l&#39;attività surrenalica vincolante [Figura campione maschile 1A% = 25,349 + 0,729 (vincolante% standard), R2 = 0,9545, F (1, 7) = 146,710, p meno di 0.001); Figura 1B campione femminile% vincolante = 29,989 + 0,7198 (vincolante% standard), R2 = 0,95,594 mila, F (1, 7) = 151,865, p inferiore a 0,001] ma non il cortisolo EIA [Figura 1C campione maschile% vincolante = 79,089 + 0,0629 (vincolante% standard), R2 = 0,175, F (1, 7) = 1.485, p = 0,262); campione femminile Figura 1D% Di legame = 81,652 + 0,0772 (vincolante% standard), R2 = 0,257, F (1, 7) = 2.422, p = 0,164]. Come la VIA corticosterone ha dimostrato il parallelismo a differenza della VIA cortisolo e di test di interferenza sul corticosterone VIA ha mostrato segni di interferenza della matrice, come aggiunta di estratto fecale diluito per gli standard di corticosterone non ha modificato l&#39;importo previsto (maschio: Osservato = 1.302 + 1.017 (expected) , R2 = 0,9972, F1, 7 = 1287,128, p &lt;0.001; femminile: Osservato = 0,3169 + 1,0931 (atteso), R2 = 0,9972, F1, 7 = 2432,65, p &lt;0.001;). I risultati della VIA è emerso che non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di corticosterone tra cavalli maschi (M = 37.7, DS = 14,1) e cavalli di sesso femminile (M = 33,8, DS = 12,7; t (70) = 1.23, p = 0.22) . Il livello di corticosterone fecale aumentato il livello di isolamento aumentato. cavalli isolati (design del corpo 4) era significativamente elevatoer i livelli di corticosterone fecale rispetto a tutti gli altri disegni di alloggio (Wilks Lambda = 0.58, F (3, 18) = 4.29, p = 0,01, multivariata eta parziale quadrato = 0.42; p ≤0.02). Il livello di corticosterone fecale era superiore per tutti i cavalli su tutte tre giorni di esempio durante l&#39;alloggiamento più isolato rispetto agli altri trattamenti abitative. Le concentrazioni di corticosterone fecale medio per ogni disegno dell&#39;alloggiamento per ogni giorno sono presentati in Tabella 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53479/53479fig1.jpg" /> Figura 1. biochimica Validation (parallelismo) di un Corticosterone e cortisolo Enzyme Linked-immunoenzimatico per maschi e femmine Cavalli. Questa cifra dettagli il legame di piscine seriali diluite di maschio e femmina cavallo domestico estratti fecali contro l&#39;aumento delle concentrazioni curva standard di corticosterone e cortisolo su cento una VIA. I risultati dimostrano che lacorticosterone (A, maschile, B, femmina) e non il cortisolo VIA (C, maschile, D, femmina). ha prodotto un successo curva di spostamento parallelo con la curva di corticosterone standard EIA <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53479/53479fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table><tbody><tr><td rowspan="3"></td><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> Medio (± SD) CORTICOSTERONE FECALE (ng / g) IN OGNI TRATTAMENTO CORPO </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HOUSING TRATTAMENTO </td><td> Giorno 1 </td><td> Giorno 2 </td><td> 3 ° giorno </td><td> COMPLESSIVAMENTE </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 31.73 ± 10.2 </td><td> 32.18 ± 8.0 </td><td> 29.22 ± 5.9 </td><td> 31.05 ± 7.8 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 32.75 ± 10.0 </td><td> 33.66 ± 12.9 </td><td> 34.67 ± 9.3 </td><td> 33,69 ± 10.3 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 35.06 ± 14.6 </td><td> 35.14 ± 15.9 </td><td> 33.13 ± 12.5 </td><td> 34.44 ± 13.6 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td><td> * </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 38.16 ± 17.8 </td><td> 42.00 ± 16.7 </td><td> 41.52 ± 17.6 </td><td> 40.56 ± 16,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Media (± DS) fecale Corticosterone (ng / g) per ogni trattamento alloggio per giorni uno, due e tre e medio fecale Corticosterone (ng / g) per tutti i tre giorni (totale) in ogni trattamento Housing. Questa tabella mostra i valori medi per corticosterone fecale (ng / g) ± deviazione standard per ciascun trattamento alloggiamento durante giorno uno, due e tre. I campioni sono stati raccolti almeno 20 ore dopo cavalli iscritti l&#39;alloggiamento. Essa mostra anche corticosterone fecale media (ng / g) ± deviazione standard per tutti i tre giorni (fuori tutto) in ogni trattamento abitazioni. Il concentrat corticosterone fecaleion era significativamente più alta (*) durante la progettazione dell&#39;alloggiamento isolato. La più bassa concentrazione di corticosterone fecale per tutti i giorni è stato trovato nel gruppo ospitato trattamento (trattamento 1). Adattato da Yarnell et al. (2015), con il permesso del Journal of Physiology e comportamento.

Watch this Scientific Journal Video about Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids at JoVE.com

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

fecal-glucocorticoid-analysis-non-invasive-adrenal-monitoring

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Views.  Nottingham Trent University. Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Video: Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal experimentation whenever possible. When there is no alternative to animal experimentation, the total number of laboratory animals used should be the minimum needed to obtain valuable data. Moreover, appropriate refinement measures should be applied to minimize pain, suffering, and distress accompanying the experimental procedure. The categories used to classify the degree of pain, suffering, and distress are non-recovery, mild, moderate, or severe (EU Directive 2010/63). To determine which categories apply in individual cases, it is crucial to use scientifically sound tools.
The well-being-assessment protocol presented here is designed for procedures during which general anesthesia is used. The protocol focuses on home cage activity, the Mouse Grimace Scale, and luxury behaviors such as burrowing and nest building behavior as indicators of well-being. It also uses the free exploratory paradigm for trait anxiety-related behavior. Fecal corticosterone metabolites as indicators of acute stress are measured over the 24-h post-anesthetic period.
The protocol provides scientifically solid information on the well-being of mice following general anesthesia. Due to its simplicity, the protocol can easily be adapted and integrated in a planned study. Although it does not provide a scale to classify distress in categories according to the EU Directive 2010/63, it can help researchers estimate the degree of severity of a procedure using scientifically sound data. It provides a way to improve the assessment of well-being in a scientific, animal-centered manner.

We developed a protocol to assess well-being in mice during procedures using general anesthesia. A series of behavioral parameters indicating levels of well-being as well as glucocorticoid metabolites were analyzed. The protocol can serve as a general aid to estimate the degree of severity in a scientific, animal-centered manner.

Valutazione sistematica del benessere nei topi per procedure usando l'anestesia generale

In keeping with the 3R Principle (Replacement, Reduction, Refinement) developed by Russel and Burch, scientific research should use alternatives to animal ...

Ricerca

Comportamento

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial species, the koala (Phascolarctos cinereus), faces prolonged exposure to anthropogenic-induced stressors and assessment of chronic stress in wild populations is urgently warranted. One of the most effective ways to measure chronic stress is through analyzing the glucocorticoid hormone cortisol in hair or fur, as it supports physiological and behavioral responses. This laboratory validation study aims to test current techniques to validate an optimal hormone extraction method to be used as a non-invasive measure of cortisol in koala fur. It is recognized that using non-invasive techniques to measure stress hormones is preferred over traditional, invasive techniques due to their ideal practical and ethical standpoints. Additionally, it is comparatively easier to acquire fur from koalas than it is to acquire samples of their blood. This study used samples of koala fur acquired from the Adelaide Koala and Wildlife Hospital to run a number of hormone extraction techniques in an attempt to validate an optimal cortisol extraction method. Results showed that 100% methanol provided the most optimal solvent extraction compared to 100% ethanol or 100% isopropanol based on parallelism results. In conclusion, this method of cortisol extraction from koala fur provided a reliable non-invasive assay that could be used to study chronic stress in koalas.

Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

We present a protocol to determine the optimal extraction solvent to measure cortisol from koala fur. The solvents used in this protocol are methanol, ethanol and isopropanol. Determining an optimal extraction solvent will aid in reliably measuring fur to determine the impact of chronic stress on koalas.

Misurazione del cortisolo a Koala (Phascolarctos cinereus) Pelliccia

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Biochimica

A Cross-Disciplinary and Multi-Modal Experimental Design for Studying Near-Real-Time Authentic Examination Experiences

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies that rely on objective measures of emotional experience, limitations on utilizing multi-modal data sources exist. Studies of emotion and emotional regulation in classrooms traditionally rely on survey instruments, experience-sampling, artifacts, interviews, or observational procedures. These methods, while valuable, are mainly&#160;dependent on participant or observer subjectivity and is limited in its authentic measurement of students&#39; real-time performance to a classroom activity or task. The latter, in particular, poses a stumbling block to many scholars seeking to objectively measure emotions and other related measures in the classroom, in real-time.
The purpose of this work is to present a protocol to experimentally study students&#39; real-time responses to exam experiences during an authentic assessment situation. For this, a team of educational psychologists, engineers, and engineering education researchers designed an experimental protocol that retained the limits required for accurate physiological sensor measurement, best-practices of salivary collection, and an authentic testing environment. In particular, existing studies that rely on physiological sensors are conducted in experimental environments that are disconnected from educational settings (e.g., Trier Stress Test), detached in time (e.g., before or after a task), or introduce analysis error (e.g., use of sensors in environments where students are likely to move). This limits our understanding of students&#39; real-time responses to classroom activities and tasks. Furthermore, recent research has called for more considerations to be covered around issues of recruitment, replicability, validity, setups, data cleaning, preliminary analysis, and particular&#160;circumstances (e.g., adding a variable in the experimental design) in academic emotions research that relies on multi-modal approaches.

An experimental design was developed to investigate the real-time influences of an examination experience to assess the emotional realities students experience in higher education settings and tasks. This design is the result of a cross-disciplinary (e.g., educational psychology, biology, physiology, engineering) and multi-modal (e.g., salivary markers, surveys, electrodermal sensor) approach.

Una progettazione sperimentale interdisciplinare e multimodale per studiare esperienze di esame autentico quasi in tempo reale

Over the past ten years, research into students&#39; emotions in educational environments has increased. Although researchers have called for more studies ...

Providing Meaningful Environmental Enrichment and Measuring Saliva Cortisol in Pigs Housed on Slatted Flooring

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a substantial pressure coming from customers, legislators and other stakeholders, to make management changes to improve the well-being of these animals. Several studies have demonstrated that providing environmental enrichment to pigs allows them to express their natural behavior, such as rooting and exploring, as well as nesting prior to farrowing, and is associated with reduced stress and improved production and welfare. However, many considerations should be taken into account when providing environmental enrichment, such as the type of floor, drainage and sewage systems, the pigs&#39; stage in life, the material, as well as its hanging method, height and location within the pen. The objectives of this paper are (1) to give methodologic information on how to provide a relatively simple and practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted floors during the different stages of their life, and (2) to demonstrate how to collect saliva samples for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress. Protocols include information regarding the use of jute, cotton ropes, straw in racks, as well as chewable silicone sticks devices as environmental enrichment in pens of farrowing and lactation, weaners and finishers. In addition, the use of cotton rope for a non-invasive saliva samples collection for cortisol concentrations analysis is detailed. The protocols provided are relevant for professionals aiming to improve and monitor animal welfare, in both research and industrial swine farming.

This protocol demonstrates how to provide practical meaningful environmental enrichment for pigs which are housed on slatted flooring during the different stages of their lives, and how to collect saliva samples in a non-invasive manner for the measurement of cortisol concentrations, as a biomarker for acute stress.

Fornire un significativo arricchimento ambientale e misurare il cortisolo saliva nei suini ospitati su pavimenti a doghe

As pork is the most consumed meat worldwide, the welfare of animals in the swine industry has increasingly become a major public concern, which imposes a ...

Thermal Imaging to Study Stress Non-invasively in Unrestrained Birds

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood flow that results in a net influx of blood to key organs and an increase in core temperature. This stress-induced hyperthermia is used to assess stress. However, measuring core temperature is invasive. As blood flow is redirected to the core, the periphery of the body can cool. This paper describes a protocol where peripheral body temperature is measured non-invasively in wild blue tits (Cyanistes caeruleus) using infrared thermography. In the field we created a set-up bringing the birds to an ideal position in front of the camera by using a baited box. The camera takes a short thermal video recording of the undisturbed bird before applying a mild stressor (closing the box and therefore capturing the bird), and the bird&#8217;s response to being trapped is recorded. The bare skin of the eye-region is the warmest area in the image. This allows an automated extraction of the maximum eye-region temperature from each image frame, followed by further steps of manual data filtering removing the most common sources of errors (motion blur, blinking). This protocol provides a time series of eye-region temperature with a fine temporal resolution that allows us to study the dynamics of the stress response non-invasively. Further work needs to demonstrate the usefulness of the method to assess stress, for instance to investigate whether eye-region temperature response is proportional to the strength of the stressor. If this can be confirmed, it will provide a valuable alternative method of stress assessment in animals and will be useful to a wide range of researchers from ecologists, conservation biologists, physiologists to animal welfare researchers.

There is a need for a non-invasive assessment of stress. This paper describes a simple protocol using thermal imaging to detect a significant response in eye-region temperature in wild blue tits to a mild acute stressor.

Thermal Imaging per studiare lo stress in modo non invasivo in Uccelli sfrenato

Stress, a central concept in biology, describes a suite of emergency responses to challenges. Among other responses, stress leads to a change in blood ...

Neuroscienze

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Medicina

A Novel Method: Super-selective Adrenal Venous Sampling

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts of aldosterone and cortisol, respectively. The conventional adrenal venous sampling (cAVS) method collects blood samples from both adrenal central veins and is useful for identifying the laterality of excess hormone production in a unilateral lesion(s), as documented in PA cases. In cAVS, plasma cortisol concentrations (PCCs) are used to normalize plasma aldosterone concentrations (PACs). A novel &#34;super-selective&#34; adrenal venous sampling (ssAVS) method was developed using a micro-catheter, which collects blood samples from adrenal tributary veins (TVs). PACs in ssAVS samples do not require PCC normalization because samples contain a limited amount of systemic venous blood, if any. The ssAVS method enabled segmental lesion(s) to be detected in both adrenal glands, which may be treated by bilateral adrenalectomy, thereby sparing lesion-free segment(s). Right and left adrenals typically have three TVs each, i.e., the superior, lateral, and inferior TVs in the right adrenal as well as the superior-median, superior-lateral, and lateral TVs in the left adrenal. In the ssAVS method, specific parent catheters and a technique to handle them are required, and have been described herein. Furthermore, ssAVS results from three cases of PA are presented: bilateral aldosterone-producing adenoma (APA) (Case #1), left APA and right possible cortisol-producing adenoma causing SCS (Case #2), and idiopathic hyperaldosteronism in which bilateral adrenal segments produced excessive amounts of aldosterone (Case #3). The ssAVS method is not difficult for expert angiographers, and, thus, is recommended worldwide to treat PA cases for which cAVS does not represent a viable surgical treatment option.

&#39;Super-selective&#39; adrenal venous sampling (ssAVS, also called segmental adrenal venous sampling: sAVS)&#160;was performed using a micro-catheter to identify adrenal segment(s) that produce excessive amounts of hormones. The ssAVS technique was described, cases in which adrenal segmental lesion(s) were identified by ssAVS were presented, and the usefulness of ssAVS in future adrenal research was discussed.

Un metodo novello: Campione venoso adrenale Super-selettivo

Primary aldosteronism (PA) and subclinical Cushing&#39;s syndrome (SCS) are conditions in which the adrenal glands autonomously produce excessive amounts ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Biologia

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Colture primarie di cellule corticosurrenali ratto e saggi di Steroidogenic funzioni

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...