The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Questo protocollo segue le linee guida della University of Arizona Ufficio per una gestione responsabile della Ricerca ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usa Istituzionale 1. Allevamento Zebrafish e Embryo manutenzione <ol><li> Preparare E3 embrione media 8. Fare 60x soluzione madre, sciogliere 34,8 g di NaCl, 1,6 g KCl, 5.8g CaCl 2 ● 2H 2 O, e 9,78 g MgCl 2 ● 6H 2 O a 1,95 L ddiH 2 O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e HCl Regolare il volume a 2 L utilizzando ddiH 2 O. </li><li> Per preparare 1x E3 medio embrione, diluire 16,5 ml 60x magazzino in 1 L ddiH20. Aggiungere 100 ml 1% di blu di metilene. </li><li> Allevamento <ol><li> Casa Maschio e femmina nidiata magazzino (7 - 18 mesi di età) separatamente per massimizzare la fecondità. </li><li> Spegnere le luci 1-2 ore prima del giorno precedente uova sono desiderati. Impostare l&#39;accoppiamento (1 maschio e 1 - 2 femmine) in cgabbie Rossing come precedentemente descritto 9. Gabbie Crossing consentono per le uova di sfuggire predazione che passano attraverso la base forata dell&#39;inserto vasca in cui i pesci adulti sono detenuti. </li><li> Optional:. Per la riproduzione temporizzata, (come sarebbe necessario per gli studi che coinvolgono morfolino iniezione), separare il maschio e pesce femmina da un chiaro divisorio in plastica, Rimuovi questa mattina di provocare temporizzato deposizione delle uova e la fecondazione. Per morpholino studi, eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pesci embrionale necessaria per il trattamento. Senza una stima della dimensione dell&#39;effetto o variazione, una prova preliminare può essere eseguito con un n = 8. </li></ol></li><li> Versare le uova da gabbia traversata in una capsula di Petri (100 - 150 embrioni / 10 centimetri di Petri). Lasciare le uova di depositarsi sul fondo del piatto e versare l&#39;acqua. Rimuovere eventuale acqua residua con una punta fine trasferimento monouso pipetta. Aggiungere indietro medio E3 embrione fatto in fase 1.1. </li><li> Fai afzoppo pipetta monouso lucido per il futuro di uova e il trasferimento del pesce. Utilizzando le forbici, tagliare una pipetta di trasferimento monouso diplomato al diploma 0,25 ml. Per rimuovere i bordi irregolari, polacco fiamma la punta taglio sopra un becco Bunsen. </li><li> Mantenere pesce embrionale a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) di 10 cm capsule di Petri in zebrafish media E3 embrione a 28,5 ○ C. Due volte al giorno, utilizzare fiamme lucido laureato monouso pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti (aspetto bianco opaco). Una volta al giorno, sostituire E3 medio embrione. Eliminare E3 medio embrione, rimuovere il liquido restante con una punta fine trasferimento monouso pipetta e aggiungere di nuovo pre-riscaldato (28,5 ○ C) E3 medio embrione. </li></ol> 2. Preparare Assay Solution <ol><li> Preparare la soluzione test secondo la Tabella 1. Soluzione saggio Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,22 micron. Prima del dosaggio iniziazione, scaldare la soluzione test sterile in una 28,5 ○ Cbagnomaria. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % Del totale </td><td> Volume (ml / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embrione Media </td><td> 1.667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Doppia deionizzata (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9.623,3 </td></tr><tr><td> Alamar blu </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NaOH 400 mm </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Assay Media 3. Eseguire Assay <ol><li> Sciacquare embrioni di zebrafish 3 volte con sterile filtrata medio embrione E3. Unire tutti gli embrioni vitali zebrafish dalla frizione in un bicchiere. Filtro sterile da 75 ml E3 medio embrione. Utilizzando una punta fine trasferimento monouso pipetta, rispostare tanto del mezzo embrione E3 dagli embrioni zebrafish possibile. Aggiungere 20 ml di nuovo sterile filtrata medio embrione E3. Rimuovere e sostituire E3 medio embrione 3 volte. </li><li> Tavola 1 pesce in ciascuno dei 93 pozzetti di una nera 96 ​​pozzetti lati chiara piatto fondo. Trasferire il pesce embrionale alla piastra catturando individualmente un embrione all&#39;interno di una fiamma lucido laureato plastica pipetta usa e getta (punto 1.5) e l&#39;espulsione delicatamente nel pozzo. Trasferire E3 embrione medio tratto dal bicchiere contenente pesce risciacquati nei 3 pozzetti del bianco. Questo assicura che i pozzi vuoti sono stati esposti per la stessa acqua dei pozzi che contengono pesci. Entrambi i pozzetti che contengono pesce e pozzetti vuoti devono essere almeno a metà (200 microlitri) al termine di questa fase. </li><li> Sostituire E3 medio embrione con la soluzione di test in tutti i 96 pozzi, tra cui pozzetti del bianco. Questa operazione deve essere eseguita 1 colonna alla volta per ciascuna delle 12 colonne in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una punta fine e getta transfer pipetta, rimuovere E3 medio embrione da ciascun pozzetto in una colonna della piastra (8 pozzetti). Fare attenzione a non toccare l&#39;embrione zebrafish. Aggiungere 300 ml di soluzione di dosaggio per ciascun pozzetto da cui l&#39;acqua è stata rimossa. Ripetere la rimozione di E3 medio embrione e sostituzione con la soluzione test per tutte le colonne 12 della piastra. </li><li> Opzionale: Per testare il cambiamento di tasso metabolico in risposta ad un composto, fare una soluzione che è 100 volte (100x) la concentrazione trattamento desiderato. Di nota, assicurarsi che la soluzione 100x non supera il 10% DMSO a limitare la concentrazione finale di DMSO a non più di 0,1%. Aggiungere 3 ml di soluzione 100x a ciascuno dei pozzetti di trattamento. NOTA: eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pozzi di trattamento. Tuttavia, senza una stima della entità della risposta o variazione, una prova preliminare può essere eseguito in 8 compound trattata e 8 veicoli trattati pozzetti di controllo contenenti pesci. <ol><li> Aggiungere 3 ml di controllo del veicolo al controllo (senza drug trattamento) pozzi che contengono pesci. Per assicurare che la risposta fluorescente composto è un risultato di azioni ai pesci, applicare trattamenti farmacologici e veicoli a 3 pozzetti di bianco in una piastra da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Leggi pesce piatto pieno su lettore fluorescente piatto con lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 530 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione a 590 nm. </li><li> Posizionare la piastra in incubatore umidificato impostata a 28,5 ○ C (mantenere piastra al buio per tutta test per evitare photobleaching di soluzione test). Il saggio può essere eseguito per periodi di tempo che vanno da 1 ora a 24 ore. La durata del saggio dipende dallo scopo dello studio. Per testare la risposta ad una breve composto non stabile recitazione breve durata può essere più adatto. Tuttavia, per le prove di composti stabili o test di effetti genetici, massimizzando durata saggio è preferibile sfruttare i vantaggi connessi con il segnale cumulativo. </li><li> In un punto tempo predeterminato (vedere la fase 3.6 per aiutare a determinare i tempi)leggere la fluorescenza di piatto di pesce pieno di nuovo con le stesse impostazioni di passo 3.5. </li></ol> 4. Valutare la variazione relativa a fluorescenza associata al trattamento con <ol><li> Calcolare variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto sottraendo la fluorescenza al tempo 0 dal fluorescenza al termine dello studio. Wells senza pesce (spazi) devono avere valori prossimi a 0, ben al di sotto dei valori da pozzi che contengono pesci. Cambia in Fluorescenza = Fluorescenza a conclusione - Fluorescenza al tempo 0 </li><li> Per accertare la variazione relativa di fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per pozzetti di controllo poi dividono la variazione di fluorescenza di ciascun bene dal variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo. Da segnalare, i controlli potrebbero essere sia comandi del veicolo o controlli genetici. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

La contaminazione con batteri o funghi limiterà notevolmente l&#39;applicazione di questo test. Il blu di metilene in mezzo embrione E3 limita la possibilità di contaminazione fungina. Nel corso embrione rialzando è fondamentale che la cura è presa per eliminare l&#39;embrione è morto due volte al giorno. Inoltre, è essenziale risciacquare abbondantemente gli embrioni con E3 sterile medio embrione del giorno di dosaggio iniziazione. Questi 2 passaggi limitano il potenziale di contaminazione batterica degli embrioni. L&#39;inclusione dei pozzi vuoti descritte al punto 3.2 permette di individuare qualsiasi contaminazione batterica. La contaminazione batterica che produce un segnale misurabile è rara. Tuttavia, se i pozzetti del bianco fanno mostrano un segnale più forte, il test deve essere ripetuto con cura in modo da mantenere la pulizia embrione. Se l&#39;utente si aspetta che la contaminazione è sorgendo prima della raccolta degli embrioni, gli embrioni possono essere sbiancate come descritto in precedenza (p. 22) 10. In alternativa, se lo sperimentatore sospetta checontaminazione sta avvenendo dopo la raccolta l&#39;utente può utilizzare E2 con la penicillina e la streptomicina a posteriori gli embrioni di 4 dpf (pag. 23) 10. Anche se questo test è utile per applicazioni in embrioni, non abbiamo testato per la validità di zebrafish adulto. Abbiamo il sospetto che la funzionalità di questo test sarebbe limitata a pesci adulti dalla scarsa penetrazione nei tessuti di AlamarBlue. Inoltre, nel pesce alimentazione flora intestinale può produrre un segnale profonda, non indicativa del metabolismo dei pesci. Pertanto, questo test è limitato ad utilizzare nel tuorlo d&#39;alimentazione dei pesci embrionale. La relativa inattività del pesce embrionale fornisce un vantaggio unico, poiché ciò limita la variabilità che risulterebbe da indotto dispendio energetico 11. Così questo saggio è uno strumento unico per lo screening della risposta tasso metabolico alla manipolazione genetica o farmacologica in un sistema animale intero. Il pesce zebra sta rapidamente diventando un modello di punta per il mperturbazioni etabolic che accompagnano l&#39;obesità. In realtà, ci sono pubblicati modelli sia transgeniche e obesità indotta dalla dieta zebrafish 12,13. Simile a modelli murini, dieta obesità indotta nel zebrafish aumenta i trigliceridi sierici e lipidico epatico accumulo 12. Inoltre, zebrafish sovralimentati hanno elevato glucosio a digiuno, suggerendo glucosio intolleranza 14. Utilizzando il test descritto qui abbiamo dimostrato che 24 ore di pre-trattamento con Metformina, un sensibilizzatore dell&#39;insulina, aumenta la risposta tasso metabolico a trattamento insulinico 5. Così, il pesce zebra può rivelarsi un modello ideale animale intero per scoprire farmaci che aumentano la sensibilità all&#39;insulina (embrione) e di stabilire la loro efficacia nell&#39;alleviare obesità correlati insulino-resistenza (adulto). Lo sviluppo di modelli di zebrafish obesi genetici e dieta indotta che imitano i fenotipi osservati nei mammiferi obesi crea l&#39;impulso per l&#39;avvio di stu zebrafishmuore incentrata sulla malattia metabolica. Saggi high throughput sono essenziali per apprezzare pienamente il valore del modello zebrafish agli studi di omeostasi energetica. Strumenti innovativi progettati per valutare unità fagica consentiranno schermi incentrati sul consumo di energia, mentre i test di archiviazione elevato throughput di lipidi porterà a studi su tutto il corpo lipidi omeostasi 15-17. Il test che descriviamo qui fornisce uno strumento ad alto rendimento per valutare il ruolo dei geni, composti o loro interazioni su tutto il dispendio energetico del corpo.

Il mouse è attualmente il modello predominante per la ricerca di obesità. L&#39;intervallo breve generazione e strumenti genetiche disponibili nel topo sono stati fino ad oggi senza pari. Tuttavia, il pesce zebra ha anche un intervallo di generazione breve (3 - 4 mesi) e supera anche il mouse in facilità di manipolazione genetica 1,2. Il pesce zebra mantiene quasi il 90% dei geni dei mammiferi, mentre di gran lunga superiore il mouse in numero di figli e il potenziale per l&#39;uso in schermi genetici e droga 3. Per sfruttare il potenziale del modello di zebrafish per gli studi in obesità, le analisi devono essere sviluppati per indagare i fattori che influenzano il corpo regolazione del peso, comprese le spese di energia. Come metaboliti vengono elaborati tramite β-ossidazione e l&#39;ossigeno ciclo degli acidi tricarbossilici viene consumato e NADH 2 viene prodotto. Così, NADH 2 è un indicatore diretto del flusso di metaboliti attraverso vie metaboliche (metabolita ossidazione). In poikilotherms, H + perdite attraverso la membrana mitocondriale interna, che disaccoppia NADH 2 ossidazione dalla sintesi di ATP, è 4 - 5 volte inferiore negli esseri omeotermi 4. Di conseguenza, in NADH zebrafish 2 è molto strettamente legata alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Qui, descriviamo un metodo che misura NADH 2 produzione nel zebrafish larvale come proxy per dispendio energetico 5. Il consumo di ossigeno è il gold standard per la misurazione della spesa energetica. Tuttavia, per sfruttare al meglio l&#39;elevato potenziale rendimento del zebrafish, saggi di dispendio energetico devono essere suscettibili di high-throughput. Sistemi di consumo di ossigeno che dipendono da una camera chiusa sistema di circolazione sono limitati nella velocità per il numero di camere disponibili 6. Open air consumo di O 2 / CO 2 test di produzione è stato applicato anche nel zebrafish 5,7. Questi all&#39;aperto 96 pozzetti piastra di basesistemi d sono suscettibili di throughput elevato. Sfortunatamente, lo scambio di gas con l&#39;ambiente limita sensibilità di questi test. Abbiamo recentemente pubblicato l&#39;applicazione di un metodo che monitora NADH 2 utilizzando l&#39;indicatore redox alamarBlue 5. Questo saggio supera i limiti di produttività e sensibilità comune per analisi di consumo di ossigeno in zebrafish. Il pesce zebra sta diventando un modello sempre più importante per gli studi di tutto omeostasi energia del corpo. In parte, perché zebrafish sono suscettibili di utilizzare schermi genetici avanti e schermi di droga. Inoltre, mirata manipolazione genetica, tra cui knockdown e knock-in, può essere applicato rapidamente. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test può essere combinato con l&#39;applicazione di droga bagno e atterramento genetica o knockout per identificare i composti e geni che alterano il tasso metabolico 5. Inoltre, questo test è stato progettato per sfruttare i vantaggi di throughput elevati inerenti il ​​pesce zebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

Zebrafish sono un importante organismo modello con vantaggi inerenti che hanno il potenziale per fare zebrafish un modello ampiamente utilizzato per lo studio della omeostasi energetica e obesità. Le piccole dimensioni di zebrafish permette di saggi sugli embrioni da condurre in un formato piatto 96- o 384 pozzetti, tecnologie Morpholino e CRISPR basate promuovere la facilità di manipolazione genetica, e il trattamento farmacologico per applicazione bagno è praticabile. Inoltre, zebrafish sono ideali per schermi genetici a termine che consentono di scoperta del gene romanzo. Data la relativa novità di zebrafish come modello per l&#39;obesità, è necessario sviluppare strumenti che sfruttino appieno questi benefici. Qui, si descrive un metodo per misurare il dispendio energetico in migliaia di zebrafish embrioni contemporaneamente. Abbiamo sviluppato una piattaforma completamente microplacca animale in cui usiamo piastre a 96 pozzetti per isolare singoli pesci e noi valutare cumulativo NADH 2 produzione utilizzando il disponibile in commercio coltura cellulare vitalità reagente alamarBlue. Nel poichilotermi il rapporto tra NADH 2 produzione e la spesa energetica è strettamente legata. Questo test dispendio energetico crea il potenziale per lo screening rapido manipolazioni farmacologiche o genetiche che alterano direttamente la spesa energetica o alterano la risposta ad un farmaco applicato (ad esempio sensibilizzatori dell&#39;insulina).

Soluzione Assay non aumenta la fluorescenza in assenza di pesci embrionali (Figura 1). Tuttavia, l&#39;analisi è molto sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico nel pozzo. Un singolo pesce entro un ben crea un segnale significativamente diverso da pozzetti bianchi entro 1 ora (p &lt;0,0001). La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva dei segnali generati dai pesci embrionale dopo 24 ore di incubazione. Ai fini di questa immagine sono stati utilizzati chiare pozzi lati. Eppure, i pozzi neri lati sono preferiti per le prestazioni del dosaggio per prevenire la lisciviazione del segnale fluorescente da fonti vicine. Poiché la riduzione NADH 2 indotta alamarBlue è irreversibile, il segnale accumula con il tempo. Questo permette piccoli cambiamenti da amplificare. Per mostrare che le differenze accumulano e quindi aumentare col tempo, abbiamo monitorato la variazione relativa di fluorescenza indotta da 1 a 5 pesci a 1, 2, e 4 ore (Figura 3). Ad ogni numero di pesci / pozzetto la variazione relativa della fluorescenza aumentata significativamente nel tempo (p &lt;0.001). Ancora più importante, perché il segnale accumula con il tempo, la grandezza delle differenze di cambiamento di fluorescenza che derivano da manipolare il numero di pesci / pozzetto è più solido a 4 ore a 1 ora di incubazione. Pertanto, aumentando la durata di esposizione è possibile migliorare la capacità di rilevare differenze associati con un dato trattamento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297fig1.jpg" /> Figura 1. Confronto tra rumore di segnale. Un cambiamento rilevabile della fluorescenza è generata da uno zebrafish in una piastra ben 96 in 1 ora. Wells che non contengono pesci (spazi) generano poco segnale. Barre di errore rappresentano SEM (n = 5-8). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53297/53297fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande</a>questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53297/53297fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione visiva di test di germi a 24 ore. Immagine Rappresentante dei risultati ottenuti con questo test. Pozzi rosa sono indicativi di pesce con un alto tasso metabolico, pozzi viola un tasso metabolico moderata, e pozzi blu un basso tasso metabolico. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53297/53297fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53297/53297fig3.jpg" /> Differenze Figura 3. Amplificazione segnale con il tempo. La differenza nel segnale fluorescente generato variando il numero di pesci / pozzetto aumenta con il tempo. Perché il segnale si accumula con il tempo, l&#39;entità della variazione di fluorescenza diverge con betweensamples tempo tcappello si differenziano per velocità di generazione del segnale. Barre di errore rappresentano SEM (n = 7).

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High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Ricerca

Genetica

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitoc

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione funzionale mitocondriale nei mitocondri del fegato di lucertola a spazzola

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Biochimica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

High Throughput

Riepilogo

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Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli

Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish