Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte dell&#39;Istituto di Medical System Engineering (IMSE) e Gist-Caltech Fondo Collaborative (K04592) da GIST e dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso la NRF della Corea finanziato dal Ministero della Scienza, ICT e la pianificazione futura (NRF-2013R1A2A2A01067890).

Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida istituzionali di Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), e tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa a GIST. 1. Passi pre-lesione <ol><li> Identificazione della zona zampa anteriore nella capsula interna con AAV-GFP <ol><li> Casa e maniglia ratti Sprague Dawley (~ 400 g, 11 - 13 settimane) in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e gli elettrodi utilizzando uno sterilizzatore adeguato (a vapore o sterilizzazione al plasma). Utilizzare sterilizzatore a vapore a 121 ° C come impostazione di 30 minuti per la sterilizzazione e 30 min per secca. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) con una iniezione intramuscolare. Controllare la profondità dell&#39;anestesia con la zampa pizzicare. Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C tramite una piastra elettrica sottoil corpo dell&#39;animale. </li><li> Posto l&#39;animale in un frame stereotassico utilizzando una barra orecchio e titolare bocca. </li><li> Pulire e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di alcol e la soluzione di iodio povidone. Infiltrati 2% lidocaina cloridrato sotto il cuoio capelluto nella zona del cranio di incisione destinati a ridurre il dolore intraoperatorio. </li><li> Applicare veterinario pomata oftalmica per evitare l&#39;essiccazione degli occhi. Posizionare un telino sterile sopra l&#39;animale ai siti operativi. Mantenere tutte le procedure in condizioni sterili. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana del cranio di 2 cm con un bisturi e ritrarre la pelle bilateralmente con divaricatori filo. Asciugare il cranio con tamponi di cotone e acqua ossigenata al 30%. </li><li> Fare un foro con un trapano a mano pezzo sopra la zona degli arti anteriori di corteccia motoria (AP: +2,5 dal bregma, ML: ± 2,5 dalla linea mediana) e cancellare il tratto con micro-currette per il virus-iniezione. </li><li> Scongelare la AAV-GFP (2 x 10 12 molecole di virus / ml) sul ghiaccio e di carico 1 ml divirus in una siringa da 10 microlitri. Posizionare la siringa sul telaio stereotassico. </li><li> Spostare l&#39;ago al foro pre-made e abbassare l&#39;ago 1 mm di profondità nella dura. </li><li> Iniettare il virus lentamente (0,1 ml / min) con una elevata precisione micropompa e lasciare l&#39;ago in posizione per altri 10 minuti per consentire al virus di diffondere fuori. </li><li> Dopo la pulizia del sito operatorio con irrigazione salina, fissare la ferita con 3-0 sutura in nylon; rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo ad una camera di recupero. Somministrare ketoprofene (2 mg / kg) tramite un&#39;iniezione intramuscolare per il controllo del dolore post-operatorio. </li><li> Mantenere la temperatura corporea (37 ° C) con il rilievo di riscaldamento e somministrare antibiotici cefemi classe di seconda generazione (0,1%, 1 ml) mediante una iniezione intramuscolare e 2% lidocaina cloridrato per via sottocutanea come necessario. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a manteneredecubito sternale. Casa singola l&#39;animale fino al completo recupero. </li><li> Dopo 2 - 3 settimana di recupero, profondamente anestetizzare il ratto con una overdose di ketamina cloridrato (300 mg / kg) tramite un&#39;iniezione intramuscolare nel cappuccio. Confermare la morte di animali per mancanza di punta pizzicare risposta, il polso e la respirazione. Posizionare la supina topo nella cappa. </li><li> Aprire la cavità addominale attraverso un &#39;incisione a forma Y&#39;per aprire la cavità toracica. Fissare di aorta discendente con una pinza emostatica e rottura nell&#39;atrio destro del cuore di ratto per il drenaggio del sangue. Avviare perfusione nel ventricolo sinistro del cuore con fredda 1% paraformaldeide per 5 min (10 ml / min) seguito da 4% paraformaldeide per 30 min (10 ml / min). </li><li> Togliere la testa topo da carcasse con un paio di forbici. Effettuare una incisione mediana dal collo al naso e rimuovere i muscoli del collo con forbice o rongeur in modo che il cranio è esposto. sezionare delicatamente le ossa del cranio e Duras fuori dal cervello. </li><li>Estrarre il cervello e posizionare il cervello di ratto in una provetta conica da 50 ml riempito con 4% paraformaldeide overnight. Il giorno dopo, lavare il cervello con PBS 1X 3 volte e posizionarlo in una soluzione di saccarosio al 30%. </li><li> Dopo il cervello affonda completamente al fondo della soluzione di saccarosio al 30%, posizionare il cervello in cryomold con OCT a -20 ° C in cryotome. Tagliare il cervello in piano coronale per uno spessore di 40 micron e un intervallo di 200 micron. </li><li> Eseguire GFP colorazione immunoistochimica utilizzando il metodo di scorrimento 14. Applicare l&#39;anticorpo primario (1: 200 di proteina anti-verde fluorescente, frazione IgG di coniglio) a fettine di cervello notte a 4 ° C. Il 2 ° giorno, lavare con 1% Phosphate Buffered Saline con (PBST) soluzione Tween-20 per 3 volte e applicare l&#39;anticorpo secondario (1: 500 di capra anti-coniglio IgG (H + L)) per 1 ora. Sciacquare il vetrino con 1% PBST 3 volte. Posizionare il vetro di copertura sulla fetta cervello. </li><li> Utilizzando un microscopio a fluorescenza (lunghezza d&#39;onda di eccitazione470 nm, lunghezza d&#39;onda di emissione di 525 nm, ingrandimento 5X), osservare la AAV-GFP assoni trasdotte nella capsula interna. Confrontare le posizioni di assoni trasdotti con il cervello di ratto Atlas 15 per determinare le coordinate stereotassica degli assoni trasdotte </li></ol></li><li> Regolazione dell&#39;intensità luminosa appropriata per capsulare Infarct Modeling Pre-la lesione <ol><li> Costruzione della Optical Neural Interface <ol><li> Tagliare una lunghezza appropriata (4 cm) di un ago spinale calibro 27 con un mandrino all&#39;interno utilizzando un trapano taglio. NOTA: taglio può comprimere e schiacciare la punta dell&#39;ago spinale; rimuovere il mandrino e lucidare la punta dell&#39;ago spinale per rimuovere la porzione schiacciata dell&#39;ago spinale e mantenere il calibro interno dell&#39;ago spinale. </li><li> Striscia di lunghezza appropriata (10 cm) della guaina della fibra ottica (125 micron con un nucleo 62,5 micron) del cavo di zona un lato. </li><li> Inserire il fi ottica unjackedber nel tubo di metallo (diametro esterno 3,8 mm, diametro interno 3,3 mm e lunghezza 17 mm), che viene poi serrato intorno alla fibra. Il tubo di metallo è utile per riempire lo spazio tra la fibra ottica e il mozzo dell&#39;ago spinale. Bloccare minore di 1/2 del tubo metallico con un pressore due volte. </li><li> Applicare la resina epossidica induribile a caldo sulla fibra ottica e inserire la fibra ottica nel ago spinale. Applicare una resina epossidica aggiuntivo allo spazio vuoto nel mozzo. Cura il epossidica per 20 min a 100 ° C per il fissaggio stabile. </li><li> Cleave la fibra ottica che sporge fuori l&#39;ago spinale e lucidare la fibra ottica sulla punta dell&#39;ago spinale mediante lappatura diamante (lucidatura) fogli. </li><li> Collegare la parte del connettore FC / PC del cavo di zona per l&#39;accoppiatore del sistema laser verde e misurare l&#39;intensità della luce dalla punta della fibra ottica utilizzando potere ottico digitale e contatore di energia. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. PhotothromBotic Infarct lesione nella capsula interna <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e gli elettrodi utilizzando uno sterilizzatore adeguato (a vapore o sterilizzazione al plasma). Utilizzare sterilizzatore a vapore a 121 ° C come impostazione di 30 minuti per la sterilizzazione e 30 min per secca. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale (~ 400 g, 11 - 13 settimane) con una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg) e xilazina (7 mg / kg) con una iniezione intramuscolare. Controllare la profondità dell&#39;anestesia con la zampa pizzicare. Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C tramite una piastra elettrica sotto il corpo dell&#39;animale. </li><li> Posto l&#39;animale in un frame stereotassico utilizzando una barra orecchio e titolare bocca. </li><li> Pulire e disinfettare il sito chirurgico con il 70% di alcol e la soluzione di iodio povidone. Infiltrati 2% lidocaina cloridrato sotto il cuoio capelluto nella zona del cranio di incisione destinati a ridurre il dolore intraoperatorio. Applicare veterinario pomata oftalmica per evitare l&#39;essiccazione degli occhi. </li><li> Applicare una garza sterile sopra il unIMAL ed esporre i siti operativi. Mantenere tutte le procedure in condizioni sterili. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana del cranio di 2 cm e ritrarre la pelle bilateralmente con divaricatori filo. Asciugare il cranio con swap di cotone e perossido di idrogeno. </li><li> Regolare l&#39;altezza del morsetto naso fino al bregma e lambda sono allineate allo stesso livello. PUNTO CRITICO: Questo allineamento è fondamentale per avvicinarsi correttamente una struttura più profonda, come nell&#39;eseguire una lesione infarto nella capsula interna nell&#39;esperimento principale. </li><li> Fare un foro (diametro: 2 mm; AP: -2,04 da bregma; ML: ± 3.0 dalla linea mediana) utilizzando un trapano per indurre photothrombosis. </li><li> Polacco e pulire la punta della fibra ottica dell&#39;interfaccia ottica. Fissare la ONI al telaio stereotassico senza piegarsi. Controllare la punta del ONI e pulirla chiaramente prima e dopo l&#39;inserimento dell&#39;interfaccia ottica. </li><li> Misurare l&#39;intensità del laser dalla punta della fibra ottica prima dell&#39;inserimento del Optical interfaccia al sito di destinazione del cervello di ratto. Regolare l&#39;intensità del laser di 3,5 mW, come confermato dalle fasi pre-operatorie, sulla punta della fibra ottica. </li><li> Inserire la ONI nella zona di destinazione della capsula interna (-7,8 mm confermati dalla fase di pre-chirurgia) attraverso il foro. </li><li> Mantenere la temperatura corporea a 37,5 ± 0,5 ° C durante photothrombosis. Una temperatura corporea inferiore non può produrre la misura attesa di infarto. Iniettare Rosa Bengala (2 ml / kg) attraverso la vena della coda. </li><li> Accendere il 532 nm laser verde per 90 sec 1 min dopo l&#39;iniezione Rosa Bengala. Dopo l&#39;irradiazione, rimuovere delicatamente la ONI dal cervello. Dopo aver pulito la sede operativa, fissare la ferita fissare la ferita con 3-0 sutura in nylon; rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo ad una camera di recupero. </li><li> Per il gruppo sham-operated (SOG), eseguire una procedura di lesione fabbricazione identici, tranne per l&#39;iniezione di soluzione fisiologica (0,2 ml / 100 g) invece di Rose-Bengala. </li><li>Mantenere la temperatura corporea (37 ° C) con il rilievo di riscaldamento dopo l&#39;intervento chirurgico e somministrare antibiotici (cefalosporine di seconda generazione, 0,1%, 1 ml) mediante una iniezione intramuscolare. Non lasciare l&#39;animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire animali post-chirurgica alla gabbia occupata da altri animali fino alla completa guarigione. NOTA: esperimento preliminare è stata eseguita nelle stesse procedure per trovare l&#39;intensità della luce ottimale da 1 mW a 5 mW e la procedura può essere richiesto di acquisire la misura soddisfacente di lesione in condizione diversa. </li></ol> 3. Valutazione di capsulare Infarct lesione <ol><li> Behavioral Test e raggruppamento degli animali <ol><li> Eseguire singolo pellet raggiungendo compiti come descritto da Whishaw et al. 14 per valutare il deficit motorio dell&#39;arto anteriore ogni giorno per 1 settimana dopo la modellazione ictus. Eseguire una singola attività pellet raggiungere(SPRT) in animali da limitato (90% del controllo del peso corporeo) usando plexiglass trasparente (30 x 15 x 35 cm di altezza) ad un&#39;ampia feritoia 1 cm e una mensola cibo nel fronte al centro della parete anteriore. </li><li> Mettere una pallina sullo scaffale cibo obliquamente controlaterale alla zampa anteriore preferito. Somministrare 20 pellet per sessione per 3 settimane. NOTA: Un numero di successo di termometri campioni a resistenza è definita come una portata in cui l&#39;animale afferra un pellet cibo e la mette in bocca senza farla cadere. </li><li> Calcolare il punteggio come percentuale raggiunge successo, che è definito dalla seguente formula: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> NOTA: Dividiamo gli animali in 3 gruppi: il gruppo sham-operated (SOG), gruppo di recupero moderato (MRG), e poveri gruppo di recupero (PRG). Se il punteggio SPRT post-stroke&gt; 50%, classifichiamo i ratti come MRG, che indica la presenza di una lesione sostanziale, ma distruzione non completa della target. Se il punteggio SPRT post-ictus è &lt;50% rispetto al punteggio SPRT pre-corsa, classifichiamo il gruppo come PRG, che indica la lesione completa nel target. </li></ol></li><li> Conferma neuroistologici di Infarct lesione <ol><li> Eseguire perfusione cardiaca con 4% paraformaldeide come precedentemente descritto. Dopo il cervello affonda completamente nella soluzione di saccarosio al 30%, eseguire sezionamento coronale per uno spessore di 10 um e un intervallo di 200 micron utilizzando un microtomo o cryotome 4. </li><li> Stain con H &amp; E, Nissl, Luxol veloce blu-PAS, Neurofilament proteina-L o gliali colorazione della proteina acida fibrillare e osservare i reperti istologici per determinare l&#39;intensità della luce ottimale in grado di coprire l&#39;intera larghezza della capsula interna nella zona di destinazione di osservare colorazione 4,17. </li><li> Utilizzando il software ImageJ, misurare il volume della zona infartuata photothrombotic della capsula interna sugli scivoli cerebrali.<ol><li> Per misurare il volume della zona dell&#39;infarto, avviare il software &#39;ImageJ&#39;. Per aprire i file da essere impilati, selezionare &#39;immagine per Stacks&#39; ( &#39;Immagine&#39; → &#39;pile&#39; → &#39;immagine per pile&#39;). Modificare il nome del file e selezionare &#39;impostare la scala&#39; ( &#39;Analisi&#39; → &#39;Impostazione della scala&#39;) per modificare in scala. </li><li> In &#39;Plugin&#39;, selezionare &#39;Misura pile&#39; per calcolare il volume o la zona di immagini. Inserire l&#39;intervallo di distanza di 2 immagini in &#39;Fetta spacing&#39;. Fare un disegno del ROI (regione di interesse) di tutte le immagini e cliccare su &#39;misura&#39;. NOTA: Il software &#39;ImageJ&#39; calcola automaticamente la superficie e il volume di ciascuna immagine e il volume totale di essi. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il modello di infarto capsulare presentato qui dimostra una lesione mirata con disabilità motoria marcata e persistente della funzione degli arti anteriori. Modelli precedenti di ictus capsulare sottocorticale hanno dimostrato un insufficiente grado di compromissione motoria e un rapido 6,8,9 processo di recupero. In questo senso, questo modello assomiglia casi capsulare infarto clinici che presentano compromissione funzionale a lungo termine. Le fasi più critiche nello sviluppo di un modello capsulare infarto circoscritto sono: 1) identificare correttamente la rappresentazione somatotopic della parte del corpo destinata per disabilitare la funzione all&#39;interno della capsula interna; 2) identificare l&#39;intensità ottimale del laser verde, che può distruggere l&#39;intera larghezza della capsula interna con minima invasione della vicina strutture sostanza grigia; e 3) per posizionare con precisione la fibra ottica nella struttura finale. Anche se le tecniche presentate possono indurre circoscrivered modello infarto capsulare con un tasso di replicazione elevata (&gt; 70%), piccole differenze nel targeting e grado di completezza di distruzione coprono l&#39;intera larghezza della capsula interna può rappresentare differenti deficit motori. Il tratto corticospinale si trova nella metà anteriore dell&#39;arto posteriore nella capsula interna nell&#39;uomo nonostante la controversia dell&#39;organizzazione somatotopica 15. Al contrario, non vi è stata alcuna classificazione equivalente o spiegazione dettagliata dell&#39;organizzazione somatotopica della capsula interna nei roditori. La mancanza di conoscenza per quanto riguarda l&#39;organizzazione somatotopica spesso porta a obiettivi errate di infarto lesione all&#39;interno della capsula interna con diversi esiti motori tra modelli capsulare infarto. Tuttavia, abbiamo identificato gli assoni GFP-trasdotte nella porzione caudale della capsula interna, che probabilmente rappresentano il percorso delle fibre motorie degli arti anteriori. Inoltre, la lesione di questa zona dimostrativecato un deficit marcata e persistente di raggiungere abilità degli arti anteriori. Pertanto, si consiglia la porzione caudale della capsula interna per lesione stereotassica per migliorare la validità del modello di capsula infarto. Pre-regolazione dell&#39;intensità luminosa è obbligatoria per produrre una misura uniforme infarto lesione modelli ictus perché il ceppo animale, il peso corporeo, la sorgente luminosa e tipi di ONI possono generare diverse dimensioni di infarto. Pertanto, esperimenti preliminari con diverse intensità di luce negli animali da esperimento con lo stesso ceppo e peso corporeo dovrebbero essere condotte fino a quando la lesione infartuale soddisfacente si ottiene con l&#39;intensità della luce minima. Forte intensità della luce che possono distruggere l&#39;intera larghezza della fibra capsulare (anteriore-posteriore e misura dorsoventrale) che corrisponde alla zona forelimb con il minimo danno alle strutture adiacenti è considerato l&#39;intensità della luce ottimale. il forelimb zona della capsula interna è delimitata dal talamo superiormente e inferiormente tratto ottico. Pertanto, la profondità di inserimento ONI deve essere accurata per distruggere l&#39;intera estensione della IC in direzione dorsoventrale, con la conservazione simultanea delle strutture adiacenti superiori e inferiori. posizionamento impreciso della ONI provoca una distruzione incompleta di IC, che porta ad un rapido recupero del deficit motorio a seguito della plasticità sinaptica dei rimanenti fibre piramidali nella capsula interna. In esami istologici seriali, il fattore più confusione nell&#39;induzione di un deficit motorio persistente era il posizionamento non corretto del ONI, che porta al fallimento di distruggere l&#39;intera larghezza del PLIC 4,16. Pertanto, particolare attenzione dovrebbe essere prestata per raggiungere l&#39;obiettivo corretto. Recentemente, Blasi et al. Riportato che duratura deficit puro-motore può essere prodotto facendo una lesione infarto in capsula posteriore internautilizzando endotelina-1 (ET-1) 17. Tuttavia, ET-1 può distruggere la struttura della materia grigia vicina dalla diffusione di ET-1. test comportamentale è un riferimento immediatamente disponibile nel laboratorio di valutare la formazione di infarto lesione capsula interna. Tuttavia, si raccomanda la valutazione delle prestazioni del motore una settimana dopo infarto lesione di dividere gli animali in gruppi ripresa moderata e poveri. ripresa moderata stata definita come un aumento del punteggio prestazioni&gt; 50% rispetto al punteggio prima lesione, mentre scarso recupero è stata definita come recupero &lt;50%. Tra i test comportamentali motore zampa anteriore, il singolo pellet raggiungimento compito è uno dei test più sensibili per entrambe le misurazioni quantitative e qualitative delle prestazioni motorie ictus indotta 14. Il compito misura quantitativamente il successo raggiungendo contemporaneamente fornire un&#39;analisi dell&#39;uso forelimb, come afferrare e recuperare un alimentopellet. L&#39;analisi qualitativa del movimento di raggiungere è anche utile per differenziare la qualità del recupero ictus distinguendo genuino recupero funzionale o di compensazione 20. Qui, abbiamo descritto brevemente la misurazione quantitativa della SPRT; Tuttavia, l&#39;analisi qualitativa con le riprese e il punteggio sulla base di un&#39;analisi fotogramma per fotogramma è consigliato per ulteriori analisi dettagliata. Le tecniche qui presentate non devono essere limitate alla induzione di modellazione circoscritto capsulare infarto. La tecnica può essere applicata alla induzione di una lesione infarto in altri settori della materia bianca, come il corpo calloso, commissure anteriori e fibre di collegamento tra strutture neurali. La combinazione del minuscolo ONI e photothrombotic tecnica basata sulle proprietà ottiche della materia bianca è probabile distruggere le strutture target con il minimo danno alle strutture adiacenti. Ad esempio, infarti lacunari possono produrre facilmented di mira le strutture sottocorticali relativi alle funzioni motorie, cognitive e di memoria. Quando la struttura di destinazione è grande, più inserimenti della ONI e diverse di targeting e angolati traiettorie possono essere necessari per produrre la misura desiderata delle lesioni. Esistono diverse limitazioni di questa tecnica. La tecnica è sufficiente per dimostrare la conseguenza di infarto lesione nel PLIC e il successivo recupero. Tuttavia, questo modello non rispecchia l&#39;intera gamma di WMS umani, perché la distruzione photothrombotic della sostanza bianca differisce leggermente da WMS umani. Di conseguenza, i risultati di imaging neurobiologici o MRI possono presentare caratteristiche diverse nella fase iniziale della lesione photothrombotic. Pertanto, questo modello dovrebbe essere opportunamente utilizzato per il commercio fuori vantaggi e gli svantaggi del modello. Tecnicamente, non tutti gli interventi chirurgici in grado di produrre il deficit motorio marcata e permanente in questo modello perché richiede procedure molto precise. Specifically, mani esperte ed esperti sono necessari per produrre l&#39;alta riproducibilità nella generazione di questo modello. In conclusione, l&#39;uso combinato di una tecnica photothrombotic, ottimizzazione dell&#39;intensità luminosa, e correggere il targeting è una tecnica utile per produrre un modello capsulare infarto circoscritto. Questo modello sarà utile non solo per studiare WMS alla comportamentale, il circuito, e livelli cellulari, ma anche per valutare l&#39;utilità di nuovi interventi terapeutici e riabilitativi.

Fino a poco tempo, il &quot;colpo materia grigia (GMS) modelli&quot; sono stati utilizzati esclusivamente per capire la fisiopatologia di ictus e per guidare lo sviluppo di nuovi trattamenti. Tuttavia, vi è stato un aumento della prevalenza di ictus che colpisce la sostanza bianca sottocorticale in individui anziani, che costituisce 15 - 25% di tutti gli ictus 1,2. Numerosi studi sono stati condotti per quanto riguarda corsa utilizzando modelli GMS, mentre ci sono pochi studi che hanno utilizzato sostanza bianca ictus modelli (WMS). La sostanza bianca nei roditori è sostanzialmente inferiore della sostanza bianca in esseri umani o primati. Di conseguenza, è più difficile accedere selettivamente e distruggere le regioni bersaglio nella materia bianca 3. Inoltre, non strumenti efficaci sono stati sviluppati fino ad oggi per distruggere selettivamente nella misura prevista della sostanza bianca mirato. Pertanto, vi è stata mancanza di modelli appropriati per lo studio di colpi materia bianca. st Animalmodelli Roke sono spesso utilizzati per monitorare l&#39;andamento della ripresa motore per lo sviluppo di nuovi metodi terapeutici e riabilitativi. E &#39;ideale per utilizzare un modello animale che presenta un deficit neurologico a lungo termine concorde con le alterazioni anatomiche dimostrato in corsa umana 4,5. A questo proposito, il rapido recupero del deficit motorio e in largo coinvolgimento del cervello seguente lesione infartuale non può essere realistico nel perseguimento della ricerca ictus. Precedenti modelli capsulare infarto sono state fatte da occlusione della carotide interna o arterie coroide anteriori e diffusione di endotelina-1 (ET-1) nella capsula interna 6-9. Tuttavia, occlusione dell&#39;arteria richiede un&#39;attenta dissezione delle arterie, ma produce una vasta area di infarto lesioni, compresa la capsula interna, senza deficit comportamentali persistenti. Inoltre, ET-1 non era diffusa distruggere completamente la parte posteriore della capsula interna, e quindi meno marcato o persistente behdeficit avioral. Un modello infarto photothrombotic è stato ampiamente utilizzato per generare vari tipi di lesioni infarto nella corteccia e strutture sottocorticali 10. La tecnica comprende la somministrazione endovenosa seguita da illuminazione focale, che conduce all&#39;aggregazione piastrinica nei piccoli vasi e la generazione delle lesioni infarto 10. Tecnica Photothrombotic è stato ampiamente utilizzato per creare lesioni GMS, mentre è stato raramente utilizzato per generare WMS lesioni 5,11. Per questa tecnica, una combinazione di Rosa Bengala tintura e irradiazione di luce è stata dimostrata per essere utile nella distruzione della struttura bersaglio, causando corrispondente deficit funzionali. L&#39;elemento chiave della tecnica photothrombotic è irradiazione di luce, perché determina la dimensione delle lesioni infarto. risultati irradiazione di luce in effetti diversi sulla materia grigia e materia bianca, perché la diffusione della luce è superiore a 4 volte superiore a ma biancotter rispetto a materia grigia 12; Di conseguenza, se l&#39;intensità della luce ha un sufficientemente basso irraggiamento (&lt;1.140 mW / mm 2), si può limitare l&#39;estensione a cui lesione photothrombotic influenza il grado di sostanza bianca (es., Capsula interna). Ad esempio, la luce di energia più elevata può indurre infarti sia in materia grigia e bianca, ma più bassa di luce di energia può indurre photothrombosis solo in materia bianca. Inoltre, la penetrazione di energia luminosa era molto limitata. Circa il 99% di energia luminosa è stato perso oltre 1 mm dalla sorgente di luce 13. Pertanto, si prevede che accuratamente mirata, minore energia luce induce photothrombosis solo nella materia bianca con una limitazione minima della sostanza grigia vicina. Qui, descriviamo un nuovo metodo per creare lesioni infarto nell&#39;area forelimb della capsula interna nei roditori. Descriviamo il metodo di identificazione della zona forelimb in ca internapsule, la tecnologia di irradiazione di luce, compresa la regolazione e la consegna di luce, e la generazione di una lesione infarto. Abbiamo anche descrivere test comportamentali utilizzati per valutare la completezza della modellazione capsulare.

<table><tbody><tr><td>DC Temperature controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td>ATC1000</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stereotaxic Instruments</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>Electrical Stimulator</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy&amp;nbsp;</td><td>Precision Fiber Products, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>Mix Ratio:&lt;br/&gt; 10(A):1(B-hardener) by weight&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Curing Schedule:&lt;br/&gt; 1 min @150 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 2 ~ 5 min @120 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 5 ~ 10 min @100 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 15 ~ 30 min @80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fiber Optic Scribe&amp;nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>Fiber patch cable</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>Outer diameter: 3 mm&lt;br/&gt; &amp;Oslash;200 &amp;micro;m&lt;br/&gt; 0.39 NA&lt;br/&gt; FC/PC-FC/PC&lt;br/&gt; 1 m</td></tr><tr><td>Laser Power Supply</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>Crimp ring&amp;nbsp;</td><td>DAWOOTECH CO.,LTD.</td><td></td><td>Length: 19 mm&lt;br/&gt; Inner diameter: 3 mm&lt;br/&gt; Outer diameter: 3.8 mm&lt;br/&gt; Material: SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro syringe pump controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>Optical Power Meter</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>Grit : 3 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>Grit : 6 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>SIGMA-ALDRICH CO. LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle)&amp;nbsp;</td><td>B.BRAUN MELSUNGEN AG&amp;nbsp;</td><td>4502027</td><td>Size: 27 G&lt;br/&gt; Length: 88 mm&lt;br/&gt; Needle: 0.40 mm</td></tr><tr><td>Waterproof sandpaper&amp;nbsp;</td><td>DEERFOS CO.,LTD</td><td>CC261</td><td>Grit : 1,000 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Nanofil 10&amp;nbsp;&amp;micro;l syringe</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&amp;nbsp;G BVLD needle</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP virus</td><td>UNC Vector Core</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 10&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt; virus molecules/ml</td></tr><tr><td>Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>primary antibody (1:200)</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>secondary antibody (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%, 1 ml</td></tr><tr><td>Lidocain hydrochloride injection</td><td>JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>Hand Piece Drill</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital optical power and energy meter</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

circumscribed capsular infarct modeling using a photothrombotic technique

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.

Il metodo presentato qui è destinata a creare un infarto capsulare circoscritta con un deficit motorio persistente. Pertanto, è fondamentale per determinare correttamente il bersaglio all&#39;interno della capsula interna nella fase pre-operatoria. La mappatura somatotopica di fibre piramidali nella capsula interna non è stata risolta fino ad oggi. Per identificare correttamente il bersaglio all&#39;interno della capsula interna, l&#39;area zampa anteriore deve essere delineata. Un&#39;iniezione di AAV-GFP nell&#39;area forelimb della corteccia motoria può tracciare gli assoni delle fibre piramidali nella capsula interna (figura 1). Altri rivelatori neurali, come biotinilato destrano ammina (BDA), può essere utilizzato per lo stesso scopo. Le coordinate stereotassica del bersaglio all&#39;interno della capsula interna possono essere chiariti tracciando le proiezioni assoni che provengono dalla zona zampa anteriore della corteccia motoria alla capsula interna. Figura 1. Identificazione della zona zampa anteriore nella capsula interna 2 settimane dopo l&#39;iniezione di fibre assonali AAV-GFP. GFP-trasdotte che ha avuto origine dalla zona zampa anteriore della corteccia motoria sono mostrati nel nucleo ventrolaterale del talamo (frecce) e la porzione caudale della capsula interna (freccia). La linea tratteggiata indica il contorno della capsula interna, ed i numeri si riferiscono alle distanze da bregma. Hippo, ippocampo; CPU, putamen caudato; VL, nucleo ventrolaterale; IC, capsula interna. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53281/53281fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;intensità della luce ottimale può essere diverso a seconda del ceppo e peso corporeo dell&#39;animale ei tipi e diametri di<html> fibre ottiche. Pertanto, l&#39;intensità della luce ottimale dovrebbe essere determinato separatamente prima del principale dell&#39;infarto la lesione esperimento. Utilizzando la procedura photothrombotic, l&#39;intensità della luce può essere gradualmente aumentata fino alla estensione della lesione copre l&#39;intera larghezza della capsula interna senza distruggere le vicine strutture sostanza grigia (Figura 2). L&#39;intensità della luce ottimale può essere verificato confrontando la misura istologica della lesione dell&#39;infarto e posizioni. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53281/53281fig2.jpg" /> Figura 2. Estensione della dell&#39;infarto lesioni Attraverso diversa intensità della luce laser da 2 mW a 5 mW 2 settimane dopo la lesione Photothrombotic. L&#39;intensità della luce ottimale è considerato tra i 3 MW e 4 MW in questo contesto sperimentale. Le frecce indicano la lesione infartuale./53281/53281fig2large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Noi preferiamo utilizzare il ONI in cui la fibra ottica è contenuto in un tubo metallico sottile (ago spinale). La fibra ottica può produrre dispersione della luce minima dal lato della fibra, che è in grado di generare ulteriori danni neurali lungo il tratto di fibra ottica. Encasement della fibra ottica è anche vantaggioso per impedire la flessione della fibra ottica in obiettivi più profondi, nonché per fissare la ONI al telaio stereotassico (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53281/53281fig3.jpg" /> Figura 3. Costruzione della interfaccia ottico-neurale (ONI). (A) Taglio di ago spinale. (B) spelatura della fibra ottica. (C &amp; d) Il tubo metallico di ancoraggio è inserita nelfibra ottica spogliato e stretta per fissare la fibra ottica al mozzo dell&#39;ago spinale. (E) La fibra ottica epossidica aggiunto viene inserito l&#39;ago spinale. (F) La resina epossidica è indurito a 100 ° C per 20 min. (G) La fibra ottica viene scisso sulla punta dell&#39;ago spinale. (H) La fibra ottica è lucidato. (i) L&#39;intensità della luce è misurata dalla punta della fibra ottica. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53281/53281fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La procedura photothrombotic produrrà lesioni riproducibili e le posizioni con ~ 70% di successo in caso di insufficienza del motore. Tipica capsulare infarto lesione comprende la dimensione ventrodorsale di fibre capsulari (Figura 4A). Inoltre, la lesione infartuale estende lungo l&#39;asse antero-posteriore della capsula interna a causa di una maggiore diffusione della luce all&#39;interno della fibra capsulare. (Figura 4B) Il tratto ottico situato sotto la capsula interna è costituita da fibre di sostanza bianca; pertanto, è spesso danneggiato da irradiazione di una maggiore intensità luminosa. Sezioni seriali e colorazione sono necessari per confermare tutto il volume e l&#39;estensione dell&#39;infarto. Il volume dell&#39;infarto era 0,63 ± 0,37 millimetri 3. Per valutare la distruzione della capsula fibra, neurofilamenti e Luxol macchie veloce blu-PAS sono utili. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53281/53281fig4.jpg" /> Figura 4. aspetto microscopico di capsulare infarto 3 settimane dopo Photothrombosis. Aspetto microscopico di capsulare infarto 3 settimane dopo photothrombosis. A) fetta di cervello di sezione coronale nel cervello di ratto. Arrowhead indica il tratto dell&#39;ago contenente fibra ottica nel talamo e fino a capsula interna. B) Serial colorazione Nissl del coronale fette di cervello showi<html> ng tutta l&#39;estensione dell&#39;infarto lesione nella capsula interna. Punte di freccia indica la lesione infartuale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53281/53281fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Il successo della modellazione può essere valutata mediante test comportamentali utilizzando un singolo pellet raggiungendo compito. Le prestazioni comportamentali dopo 1 settimana a seguito della lesione infartuale è una buona guida per confermare la lesione accurata, che accompagna la perdita di valore persistente e marcata di SPRT nonostante l&#39;allenamento quotidiano singolo pellet raggiungere (Figura 5). Una volta che il deficit motorio è mostrato nella PRG, il deficit neurologico persistente durante 3 mesi di osservazione. gruppo sham non ha mostrato la significativa diminuzione delle prestazioni SPRT dopo l&#39;operazione. caricare / 53281 / 53281fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Variazione singolo pellet che raggiungono punteggi dopo capsulare Infart 4,20. I gruppi sperimentali (PRG e MRG) esposti significativamente diminuito immediatamente i punteggi dopo la lesione infartuale rispetto al gruppo sham-operated (SOG). Il MRG mostra una graduale ripresa di spettacoli sPRT, mentre il PRG esibisce danno motorio persistente nel tempo. Op, photothrombotic infarto lesione; PRG, povero gruppo di recupero; MRG, gruppo di recupero moderato. La significatività statistica è stata determinata con l&#39;analisi misura ripetuta degli scostamenti. + SOG contro MRG; * SOG contro PRG. I dati sono media ± SEM. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53281/53281fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente.

Circoscritto capsulare Infarct Modeling usando una tecnica Photothrombotic

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

circumscribed-capsular-infarct-modeling-using-photothrombotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K Views.  Gwangju Institute of Science and Technology.  Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente. 

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Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected light-sensitive dye. Following illumination, the dye is activated and produces singlet oxygen that damages components of endothelial cell membranes, with subsequent platelet aggregation and thrombi formation, which eventually determines the interruption of local blood flow. This approach, initially proposed by Rosenblum and El-Sabban in 1977, was later improved by Watson in 1985 in rat brain and set the basis of the current model. Also, the increased availability of transgenic mouse lines further contributed to raise the interest on the photothrombosis model. Briefly, a photosensitive dye (Rose Bengal) is injected intraperitoneally and enters the blood stream. When illuminated by a cold light source, the dye becomes activated and induces endothelial damage with platelet activation and thrombosis, resulting in local blood flow interruption. The light source can be applied on the intact skull with no need of craniotomy, which allows targeting of any cortical area of interest in a reproducible and non-invasive way. The mouse is then sutured and allowed to wake up. The evaluation of ischemic damage can be quickly accomplished by triphenyl-tetrazolium chloride or cresyl violet staining. This technique produces infarction of small size and well-delimited boundaries, which is highly advantageous for precise cell characterization or functional studies. Furthermore, it is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Photothrombosis is a quick, minimally-invasive technique for inducing small and well-delimited infarction in areas of interest in highly reproducible manner. It is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Ischemia Photothrombotic: un modello fotochimico lesione corticale minimamente invasiva e riproducibile per mouse Studi Stroke

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

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Medicina

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis-indotta ischemia focale come un modello di lesioni del midollo spinale nei topi

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Neuroscienze

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, there remain limited therapeutic options for stroke patients. Therefore, more research is needed for pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Given the inability of in vitro models to reproduce the complexity of the brain, experimental stroke models are essential for the analysis and subsequent evaluation of novel drug targets for these mechanisms. In addition, detailed standardized models for all procedures are urgently needed to overcome the so-called replication crisis. As an effort within the ImmunoStroke research consortium, a standardized photothrombotic mouse model using an intraperitoneal injection of Rose Bengal and the illumination of the intact skull with a 561 nm laser is described. This model allows the performance of stroke in mice with allocation to any cortical region of the brain without invasive surgery; thus, enabling the study of stroke in various areas of the brain. In this video, the surgical methods of stroke induction in the photothrombotic model along with&#160;histological analysis are demonstrated.

Described here is the photothrombotic stroke model, where a stroke is produced through the intact skull by inducing permanent microvascular occlusion using laser illumination after administration of a photosensitive dye.

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

Iniezione di scaffold di idrogel Biomateriale al cervello dopo l'ictus

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

Biologia

Modello MCAO/R modificato con ECA conservato per una migliore riperfusione e stabilità

A Modified Model Preparation for Middle Cerebral Artery Occlusion Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion reperfusion (MCAO/R) model is crucial for understanding the pathological mechanisms of stroke and for drug development.However, among the commonly used modeling methods, the Koizumi method often faces scrutiny due to its ligation of the common carotid artery (CCA) and its inability to achieve adequate reperfusion. Similarly, the Longa method has been criticized for disconnecting and ligating the external carotid artery (ECA). This study aims to introduce a modified model preparation method that preserves the integrity of the ECA, involves inserting a monofilament nylon suture through the CCA, repairing the ligated CCA incision, and maintaining reperfusion from the CCA. Reperfusion of blood flow was confirmed using laser speckle flow imaging. Evaluation methods such as the Longa scale, Modified Neurological Severity Score, triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining, and immunofluorescence labeling of neurons demonstrated that this approach could induce stable ischemic nerve damage. This modified MCAO/R model protocol is simple and stable, providing valuable guidance for practitioners in the field of cerebral ischemia.

Autore in primo piano: Un nuovo approccio alla modellazione dell'ischemia cerebrale - Miglioramento della riperfusione e semplificazione della procedura

This protocol describes the process of preparing for middle cerebral artery occlusion reperfusion via the common carotid artery.

Circoscritto capsulare Infarct Modeling usando una tecnica Photothrombotic

Riepilogo

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