Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

Gli animali sono stati tenuti presso l&#39;impianto di Medicina Sperimentale (FEM, Charité, Berlino, Germania), e tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dall&#39;Ufficio di Stato per gli Affari Salute e locali (LAGeSo, Berlino, Germania; Reg. No. O 0365 / 11). 1. Fegato raccolta <ol><li> Preparazione pre-chirurgica <ol><li> Utilizzare una piastra di sughero per il fissaggio. Mettere un drappo medico sul piatto. Utilizzando quattro aghi, fissare una maschera di inalazione sulla piastra di sughero per intraoperatoria inalazione narcosi. </li></ol></li><li> Predisposizione del Portale venoso cannula <ol><li> Collegare un catetere venoso periferico (G 20) ad un rubinetto a tre vie. Il catetere venoso deve essere tagliato obliquamente, con una lunghezza di circa. 1,5 centimetri. </li><li> De-air sistema utilizzando una siringa da 10 ml contenente una soluzione Ringer. E &#39;molto importante per cura de-aria, perché embolia gassosa può influenzare negativamente il decellularization perfusione. </li></ol></li><li> Predisposizionedella cannula arteriosa <ol><li> Usare una cannula farfalla e tagliare l&#39;ago ad una lunghezza di 5 mm. Montare un tubo di 5 centimetri (ID 0,58 millimetri; diametro 0,96 millimetri) per l&#39;ago 5 mm e fissarlo con colla. Inserire una provetta 2 cm di lunghezza (ID 0,28 millimetri; diametro 0,61 millimetri) nel tubo più grande e fissarlo con colla. </li><li> Infilare un altro tubo su questa costruzione da riscontro e fissarlo con colla. De-air cannula arteriosa con una siringa da 5 ml riempito con soluzione di Ringer. </li></ol></li><li> Anestesia e Analgesia <ol><li> Indurre narcosi del topo nella camera di induzione di anestesia del 3,5% isoflurano in ossigeno ad un flusso di 1,5 l / min. </li><li> Per garantire l&#39;analgesia sicuro durante il funzionamento, iniettare metamizol (100 mg / kg di peso corporeo) e basse dosi di ketamina / medetomidina (10 mg / 0,1 mg per kg di massa corporea) per via intraperitoneale. </li><li> Fornire 1,5% isoflurano in 1 L / min di ossigeno attraverso la maschera di inalazione per il successivo mantenimento dell&#39;anestesia chirurgica. </li></ol></li><li> Accordi preoperatori &lt;ol&gt; <li> Radere l&#39;addome liberamente con una macchina di taglio elettrica. Inumidire il sito di incisione rasata sull&#39;addome con il 70% di etanolo per la disinfezione. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina sul piatto preparato, inserire la testa nella maschera di inalazione e fissare le arti con nastro medico e perni. Rimuovere l&#39;eccesso di etanolo e pelliccia con un impacco di garza. </li></ol></li><li> Anestesia Assessment <ol><li> Valutare la profondità dell&#39;anestesia guardando la frequenza respiratoria. Quando l&#39;anestesia sembra abbastanza profondo (40-60 respiri / min), controllare che l&#39;analgesia sia sufficiente cercando di attivare il riflesso pizzico punta con pinze chirurgiche per pizzicare la pelle tra le dita di entrambi gli arti posteriori. </li></ol></li><li> Approccio addominale <ol><li> Effettuare una incisione mediana nella parete addominale caudale sopra la vescica. Tagliare da questo punto in entrambe le arcate costali laterali in modo a forma di V. Fate attenzione a non tagliare nel diaframma. Tirare la parete addominale tagliata sul petto. </li&gt; <li> Fissare il xifoideo con un morsetto Overholt, tirarlo craniale e fissarlo con un elastico. Usare tamponi di cotone umido per evacuare l&#39;intestino. Avvolgere l&#39;intestino in una benda di garza umida. Inoltre, coprire tutti i margini addominale, con un bendaggio umido. </li></ol></li><li> Fegato Preparazione <ol><li> Sezionare il legamento falciforme. Utilizzare una benda di garza bagnata per contenere i lobi del fegato mediali e sinistra craniale sotto la cupola del diaframma. Esporre il legamento epatoduodenale e il lobo epatico omentale superiore. </li><li> Utilizzare due microforceps e forbici primavera di sezionare con cura il legamento attaccato al lobo omentale superiore fino al lobo è mobile. Spostare il lobo utilizzando tamponi di cotone bagnato sotto l&#39;impacco di garza, tenendo i lobi mediali e lasciate in luogo. </li><li> Dopo la mobilitazione del lobo epatico omentale superiore, spostare lo stomaco verso sinistra. Fissare lo stomaco con un morsetto e sezionare il omento minore con microforceps e le forbici primavera. </li><li> Mobilitare la omenta bassal lobo epatico finché non è mobile e successivamente spostare il lobo indietro nella sua cavità. Utilizzare un morsetto Backhaus per mantenere il duodeno. Spostare il duodeno verso sinistra per allungare ed esporre il legamento epatoduodenale. Circoscrivere il dotto biliare comune nel legamento epatoduodenale allungato. </li><li> Sezionare il dotto biliare dal adiposo e tessuto pancreatico. Tagliare il dotto biliare 1,5 cm dal biforcazione dotto biliare. Sezionare la vena porta dal tessuto adiposo circostante. Esporre la vena gastroduodenale. </li><li> Legare la vena gastroduodenale due volte con la seta 6-0 e dividere la vena tra i 2 legature. Sezionare il tronco celiaco e l&#39;arteria epatica comune dal tessuto circostante fino a quando tutti rami arteriosi si rivelano. </li><li> Liberare l&#39;arteria gastroduodenale dal tessuto circostante. Tie l&#39;arteria gastroduodenale due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare l&#39;arteria gastroduodenale tra i 2 legature. </li><li> Liberate splenicadal tessuto circostante. Tie splenica due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare splenica tra i 2 legature. </li><li> Liberare l&#39;arteria gastrica sinistra dal tessuto circostante. Tie l&#39;arteria gastrica sinistra due volte con seta 6-0, con i legami distanti tra loro. Sezionare l&#39;arteria tra i 2 legature. </li><li> Circoscrivere la vena cava inferiore tra il rene destro e il lobo destro del fegato laterale. Sezionare la vena dallo spazio retroperitoneale. Esporre l&#39;aorta seguendo il tronco celiaco. </li><li> Sezionare il tessuto adiposo retroperitoneale. Iniettare 1.000 eparina IE in 1 ml di soluzione salina nella vena cava inferiore. Ritrarre la cannula e chiudere l&#39;incisione con un batuffolo di cotone. Attendere 1-2 min per l&#39;effetto sistemico dell&#39;eparina. </li><li> Circoscrivere l&#39;aorta con una pinza. Staccare l&#39;aorta e Exsanguinate ratto. Inoltre, sezionare la vena cava inferiore distale dal rene. </li></ol></li><li> Portale venosa Incannulazione (Usa la cannula preparata nella sezione 1.2) <ol><li> Effettuare una incisione pesce-bocca nella vena porta distale. Aprire l&#39;incisione con una pinza e incannulare la vena porta. Lavare il fegato con una soluzione di 20 ml Ringer fino agli decolorizes fegato e fissare la cannula con legature (seta 6-0). </li></ol></li><li> Arterioso Incannulazione (Usa la cannula preparata nella sezione 1.3) <ol><li> Sezionare l&#39;aorta sopra il tronco celiaco. Liberate il segmento dell&#39;aorta dallo spazio retroperitoneale. Tagliare il segmento dell&#39;aorta longitudinalmente per generare una patch aortica. Inserire la cannula auto-costruito in un supporto statico. </li><li> Utilizzare 2 pinze a scivolare la patch aortica sopra la cannula. Legare l&#39;arteria epatica con la seta 6-0 sopra la cannula e fissare la patch il pilastro. </li></ol></li><li> Fegato espianto <ol><li> Aprire il diaframma, fare un&#39;incisione circolare e sezionare il fegato dalle strutture circostanti. </li></ol></li><li> Immagazzinamento <ol><li> Store il fegato in una sterile serbatoio 500 ml riempito con 350 ml soluzione Ringer fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. detergenti Solutions <ol><li> Soluzione al 10% Triton X-100 magazzino <ol><li> Riempire una bottiglia da 1.000 ml con 900 ml di acqua distillata. e aggiungere 100 ml di Triton X-100 (99,9%). Utilizzare un agitatore per sciogliere il Triton X-100. Riempire la bottiglia con acqua distillata. fino ad un volume totale di 1000 ml viene raggiunto. </li></ol></li><li> 1% Triton X-100 <ol><li> Aggiungere 100 ml della soluzione madre (10%) per un flacone 1000 ml. Aggiungere 900 ml di acqua distillata. e agitare la bottiglia per due volte. Filtrare la soluzione Triton X-100 1% attraverso un filtro sterile. </li></ol></li><li> 10% SDS Stock Solution <ol><li> Riempire una bottiglia da 1.000 ml con 900 ml di acqua distillata. e aggiungere 66.99 g SDS (99,9%, di densità 0,67). Utilizzare un agitatore per sciogliere la SDS. Riempire la bottiglia con acqua distillata. fino ad un volume totale di 1000 ml viene raggiunto. </li></ol></li><li> 1% SDS <ol><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di riserva (10%) per un bot 1.000 mlTLE. Aggiungere 900 ml di acqua distillata. e agitare la bottiglia per due volte. Filtrare la soluzione SDS 1% attraverso un filtro sterile. </li></ol></li></ol> 3. Decellularization <ol><li> Set-up del dispositivo di perfusione <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figura 1:. Schema del dispositivo di perfusione selettiva per arterioso e venoso portale Perfusione di Quattro Rat Livers sotto oscillanti Condizioni Pressione (. Modificato da Struecker et al 14) <ol><li> Collegare lo scarico di un rubinetto a tre vie e un&#39;estensione Heidelberger per regolare il livello di riempimento e riempire il reattore da 500 ml 0,9% NaCl. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figura 2:. Schema della perfusione set-up Collegare la camera di perfusione (1.400 cm 3) (1) all&#39;estremità distale (4) del gorgogliatore (5) tramite l&#39;accesso venoso portale (2) o tramite ac arteriosaprocesso (3). Il gorgogliatore (5) deve essere dotato di un otturazione (4) in corrispondenza dell&#39;estremità distale e uno sfiato (6). Collegare il gorgogliatore (5) ad un&#39;estensione Heidelberger (7). Collegare l&#39;estensione Heidelberger al segmento della pompa (8). Inoltre, collegare il segmento della pompa (8) a un altro interno Heidelberger (9). Inserire l&#39;ultima estensione Heidelberger (9) nella bottiglia di soluzione detergente (10). Collegare il respiratore (11) alla camera di perfusione (o al distributore pressione in caso di più perfusioni). Per drenare i fluidi reattore, collegare il deflusso alla bottiglia rifiuti (12). <ol><li> Inserire il segmento pompa nella pompa. Avviare la pompa per riempire il ciclo con PBS, chiudere l&#39;estremità distale del gorgogliatore e aprire la bocchetta. Quando il fondo della bolla è coperto saldamente con PBS (2-3 cm), chiudere lo sfiato e aprire l&#39;estremità distale del gorgogliatore. </li><li> Fegato di installazione <ol><li> Collegare il rubinetto a tre vie della cannula vena porta al relativo accesso reattore. Collegare la cannula arteriosa all&#39;accesso arteriosa. Fare attenzione al fine di garantire che l&#39;aria non entra nei sistemi. </li></ol></li><li> Applicazione di oscillanti Condizioni Pressione <ol><li> Utilizzare un respiratore con una frequenza di 15 bpm e un&#39;ampiezza di 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Collegare il respiratore alla camera di distribuzione della pressione e collegare la camera al reattore. Avviare l&#39;applicazione di pressione. </li></ol></li><li> Decellularization Protocol <ol><li> Eseguire passaggi perfusione con un flusso di 5 ml / min. Avviare il decellularization con perfusione del fegato con 1% Triton X-100 per 90 min. Consentire effluence rifiuti tramite il deflusso del dispositivo perfusione per mantenere il livello del fluido all&#39;interno della camera di perfusione e costante del fegato perfuso. Dopo 90 min, cambiare il detergente 1% SDS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figura 3: perfusione Protocollo per tutti i gruppi sperimentali.

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	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. 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Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Anche se la tecnica presentata per la raccolta del fegato di ratto e decellularization è facilmente riproducibile, ci sono alcuni passaggi critici da considerare: Durante la preparazione per la raccolta del fegato, è importante evitare emorragia grave perché attiverà la coagulazione del sangue e può portare alla formazione di coaguli di sangue all&#39;interno del fegato. A nostro avviso, è vantaggioso incidere aorta addominale direttamente prima incannulazione della vena porta per evitare afflusso di sangue attraverso l&#39;arteria epatica durante la perfusione attraverso la vena porta. Una volta che il fegato è incannula e chiaramente perfuso, la formazione di coaguli di sangue non è più un problema. Dopo la raccolta del fegato e trasporto per il dispositivo di perfusione, il collegamento di fegati al dispositivo perfusione è una fase particolarmente critica perché la voce di bolle di gas nel cerchio perfusione deve essere evitato per prevenire embolia gassosa. È utile precompilare la valvola a tre vie, che is collegato alla cannula del fegato, con PBS usando una siringa e una cannula sottile direttamente prima di collegare la valvola al sistema di perfusione. Una volta stabilita la perfusione, se tutti i connettori dei tubi, a tre vie tubi e valvole sono perfettamente collegati deve essere ricontrollata. Se fegati sono perfusi per periodi più lunghi (ad es., O / N), anche un piccolo errore nella connessione può portare all&#39;aria riflusso dell&#39;acqua nel sistema di perfusione, portando così a risultati di perfusione fatali. I dati presentati sono limitate dal fatto che la pressione ottimale e la frequenza delle variazioni di pressione oscillanti per i migliori risultati Decellularization rimangono poco chiari. Inoltre, la perfusione a pressione controllata può portare a risultati migliori e più stabili di perfusione-flusso controllato fa. Perfusione pressione controllata consente l&#39;applicazione di un protocollo perfusione fegati di diverse dimensioni e pesi, con lo stesso risultato, perché automaticamente il flusso sarà be adattato. L&#39;arteria epatica e vena porta sono significativamente differenti in termini di dimensioni e portate fisiologici. Così, un tasso di perfusione costante (5 ml / min) risulterà certamente differenti pressioni di perfusione all&#39;interno dei due sistemi vascolari. Allo stesso modo, una pressione di perfusione costante comporta diversi tassi di perfusione. Un metodo per confrontare l&#39;efficacia decellularization attraverso i due percorsi di perfusione sarebbe quello di eseguire la perfusione a pressioni di perfusione fisiologiche o tassi di perfusione attraverso entrambe le vie. Tuttavia, per rendere i risultati comparabili in questo studio, abbiamo scelto un tasso di perfusione costante per entrambe le rotte. Purtroppo, con il nostro dispositivo, non siamo stati in grado di misurare la pressione di perfusione in fegati perfusi. I nostri dispositivi perfusione prossima generazione saranno più piccole per minimizzare la quantità di materiale necessaria perfusione. Inoltre, i dispositivi di pompe permetteranno perfusione a pressione controllata. The presentato tecnica appare molto utile per riproducibili, omogenea decellularization fegato di ratto. Sia la tecnica presentata è appropriato per Recellularization e maturazione organo in vitro deve essere ulteriormente affrontati. Se le condizioni di pressione oscillanti hanno un impatto sulle cellule ripopolati sarà oggetto di ulteriori esperimenti. La tecnica presentata è più sofisticato di altri dispositivi di perfusione di fegato di ratto e mostra diversi vantaggi: 1) Il decellularization omogenea è riproducibile, con buoni risultati quando vengono applicate condizioni di pressione oscillanti. 2) Il dispositivo di perfusione è sigillato e permette decellularization sterili, che è un prerequisito per il ripopolamento della matrice e la perfusione a lungo termine. 3) Il protocollo presentato è più breve di altri protocolli pubblicati ma è ancora molto efficace. 4) perfusione selettiva della vena porta e l&#39;arteria epatica rende ripopolamento cellulare selettiva con sistemi diversi possibili,che può essere un importante strumento. Il dispositivo di perfusione sarà applicata in ulteriori esperimenti decellularization per affinare e ottimizzare ratto decellularization fegato. L&#39;effetto di perfusione pressione controllata sarà sperimentalmente valutata e confrontata con perfusione-flusso controllato. L&#39;aggiunta di ulteriori elementi (ad es., Una &quot;unità di dialisi&quot;, uno scambiatore di calore, un ossigenatore) per ripopolamento, cultura e maturazione esperimenti appare possibile e ragionevole per sviluppare ulteriormente il dispositivo presentato.

Decellularization e Recellularization possono consentire la generazione di funzionali, organi trapiantabili in vitro 1. By cellule rimozione e materiale antigenico (es., DNA, epitopi alfa-Gal) da un organo, la matrice extracellulare mancato o meno immunogenico (ECM) può essere ottenuto. Questa matrice conserva microanatomia tridimensionale di un organo e può servire come biomatrice ideale per ripopolamento con cellule di un differente, origine eventualmente xenogenico 2. Così, un ratto di matrice fegato decellularized potrebbe essere ripopolata con le cellule di fegato umano. Questo umanizzato micro-fegato potrebbe servire come modello ex vivo per la ricerca sulle malattie (ad es., Le malattie metaboliche congenite, malattie virali o tumori maligni) o per test farmaceutici preclinici 3. Diversi protocolli diversi per fegato di ratto perfusione decellularization sono già stati pubblicati 4-13. In tutti i protocolli, decellularzione è stato ottenuto mediante perfusione di detergenti ionici o non ionici alcaline tramite la vena porta cannulata. Per quanto a nostra conoscenza, siamo stati il primo gruppo a riferire di ratto decellularization fegato perfusione selettiva attraverso la vena porta e / o il ratto arteria epatica 14. Attivazione della perfusione selettiva dei diversi sistemi vascolari nel fegato può consentire migliori risultati Decellularization e, inoltre, può giocare un ruolo importante nel ripopolamento cellulare. Nello studio qui descritto, fegati sono stati perfusi in un dispositivo di perfusione di proprietà su misura, consentendo di perfusione in condizioni di pressione oscillanti. Queste condizioni di pressione imitano la perfusione respiratorie dipendente fisiologica del fegato: in situ, fegato pende sotto la copula del diaframma, il cui movimento durante la respirazione ha un impatto diretto sulla perfusione del fegato. Inspiration conduce specificamente abbassamento del diaframma e spremitura del fegato, ottimizzandoepato-deflusso venoso, che conduce alla scadenza elevazione del fegato e abbassamento della pressione intraddominale ottimizzare afflusso portale-venosa 15. Il nostro obiettivo era quello di valutare se le condizioni di pressione oscillanti hanno un impatto sulla omogeneità del fegato di ratto perfusione decellularization imitando condizioni intraabdominal ex vivo. L&#39;omogeneità del processo decellularization può essere un fattore sottovalutato perfusione decellularization. Tutti gli agenti noti utilizzati per decellularization fegato causa alterazioni della ECM. Le cellule in zone poco irrorate rimangono all&#39;interno della ECM, mentre altre zone sono già completamente decellularized. Per sciogliere le cellule rimanenti, la durata di perfusione o pressione devono essere elevate, causando più alterazioni alle aree ben irrorate-. Così, detergenti per decellularization devono essere distribuiti in modo omogeneo all&#39;interno dell&#39;organo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

L&#39;omogeneità e quindi l&#39;efficacia dei protocolli Decellularization differenti sono stati valutati mediante l&#39;osservazione macroscopica, analisi istologica, e l&#39;analisi del contenuto di DNA rimanendo entro matrici fegato decellularized. Inoltre, la corrosione colata è stata effettuata per visualizzare il microanatomia intatto di fegati dopo decellularization. Macroscopia Durante decellularization, fegati diventano Lucent, che indica la rimozione del contenuto cellulare. Livers perfusi attraverso la vena porta ha mostrato delucidazione disomogeneo (e quindi decellularization), con le cellule rimanenti macroscopicamente visibili durante e dopo decellularization (frecce bianche). Livers perfusi attraverso l&#39;arteria epatica è stato osservato un corso decellularization più omogenea e non le cellule residue visibili. Se fegati sono stati perfusi con l&#39;applicazione di condizioni di pressione oscillanti, non le cellule rimanenti erano visibili, indipendentemente dal percorso perfusione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> Figura 4: I risultati macroscopici di fegato di ratto Decellularization senza oscillante Condizioni Pressione. A sinistra: fegato di ratto decellularized attraverso l&#39;arteria epatica. Il fegato appare lucente, senza cellule rimanenti macroscopicamente visibili. A destra: fegato perfuso attraverso la vena porta. Il fegato appare disomogeneamente decellularized, con le cellule macroscopicamente visibili <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig5.jpg" /> Figura 5: risultati macroscopici di ratto decellularization fegato in condizioni di pressione oscillanti. A sinistra: fegato di ratto decellularized attraverso l&#39;arteria epatica. A destra: fegato perfuso attraverso la vena porta. Entrambi i fegati appaiono lucente, senza le cellule residue visibili. La valutazione istologica Una valutazione istologica delle decellularized sostegno matrici di fegatocati i risultati macroscopici. Fegati perfusi attraverso l&#39;arteria epatica non mostravano celle rimanenti, indipendentemente dal fatto che sono stati perfusi in condizioni di pressione oscillanti. Fegati perfusi attraverso la vena porta mostrato zone di celle rimanenti, anche se sono stati perfusi con l&#39;applicazione di condizioni di pressione oscillanti. Tuttavia, l&#39;applicazione di condizioni di pressione oscillanti ridotto la rimanente massa cellulare in fegati perfusi attraverso la vena porta. L&#39;ECM di fegato è stata conservata, senza differenze visibili in tutti i protocolli applicati. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig6.jpg" /> Figura 6: H / E La colorazione di decellularized fegato Matrici. AP: matrix fegato decellularized perfuso attraverso l&#39;arteria epatica senza oscillante condizioni di pressione. A + P: matrice fegato decellularized perfusi attraverso l&#39;arteria epatica in condizioni di pressione oscillanti. PA-P: decellularized matr fegatoix perfusi attraverso la vena portale senza oscillante condizioni di pressione. PA + P: matrice fegato decellularized perfuso attraverso la vena porta in condizioni di pressione oscillanti. Frecce: Rimanendo gruppi di cellule. Contenuto di DNA Il contenuto di DNA per peso secco di matrice fegato è diminuito in tutti i gruppi sperimentali rispetto a quella in fegati nativi, anche se le differenze erano statisticamente significativa solo nei gruppi perfuse in condizioni di pressione oscillanti (PV + P; A + P). La quantità più bassa di DNA per peso secco è stato trovato in fegati perfuse attraverso l&#39;arteria epatica in condizioni di pressione oscillanti. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig7.jpg" /> Figura 7: Contenuto DNA Per peso a secco di fegato Matrix (modificato da Struecker et al. 14). Livers decellularized attraverso l&#39;arteria epatica mostra meno rimanente DNA di quelli nei profumid attraverso il portale vena fare. Livers perfusi in condizioni di pressione oscillanti mostrano DNA meno residuo di quelli decellularized senza queste condizioni fanno. Così, fegati perfusi attraverso l&#39;arteria epatica in condizioni di pressione oscillanti mostrano il contenuto almeno restante DNA. Corrosione Casting Corrosione colata di matrici fegato decellularized confermato che la microanatomia fegati (compreso il quadro proteine ​​del sistema venoso portale, il sistema arterioso e sistema biliare) viene conservata durante decellularization. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig8.jpg" /> Figura 8: Fotografia di un Casting Corrosione di un decellularized Rat Liver Matrix (modificato da Struecker et al. 14). Nonostante la rimozione di tutte le cellule, microanatomia dell&#39;organo, compresa la vena porta (blu) e sistemi (rosso) arteriosi, sono conservati. Il remaining rami principali del sistema biliare sono fusi in giallo. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /> Tabella 1: Gruppi sperimentali per valutare l&#39;effetto di oscillanti Condizioni Pressione e la Strada di perfusione su Rat Liver Decellularization.

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Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization e Recellularization di fegati interi

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Ricerca

Bioingegneria

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Biochimica

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Ingegneria

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Una nuova tecnica chirurgica come una Fondazione per In Vivo parziale ingegneria del fegato nel ratto

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto<em&gt; In situ</em&gt; Fegato perfusione

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biologia

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Approvvigionamento e perfusione-decellularizzazione di lembi vascolarizzati suini in un bioreattore di perfusione personalizzato

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Approvvigionamento e decellularizzazione degli arti posteriori di ratto utilizzando un bioreattore ex vivo basato sulla perfusione per allotrapianto composito vascolarizzato

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Medicina

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...