This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Il protocollo di essere dimostrato è stata eseguita sotto la guida e l&#39;approvazione del regolamento dell&#39;ufficio IT Home 1. perfusione e Cell Collection (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Fegato perfusione Dopo anestesia del mouse, il tratto digerente è lateralmente spostato a sinistra dell&#39;addome in modo da rendere la vena porta (PV) accessibile. Il PV è cannulata con una bassa velocità di flusso (1-3 ml / min) della soluzione EGTA / HBSS e Veina cava inferiore (IVC) è immediatamente rotto per evitare qualsiasi eccesso di pressione all&#39;interno del fegato. Entro il primo minuto di perfusione, la portata viene gradualmente aumentata a 7 ml / min. La soluzione di collagenasi viene perfuso a 10 ml / min fino a raggiungere la sua piena digestione. <ol><li> Prepari appena tutti i reagenti descritti nella tabella materiale. </li><li> Scaldare il EGTA (glicole etilenico Tetra-acetico) / HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Solution (50 ml per mouse) e la soluzione di collagenasi (100 ml per il mouse) per 30 minuti a 40 ° C. </li><li> Sciacquare il tubo flessibile della pompa prima con il 70% di etanolo. Versare 40 ml di EGTA / HBSS soluzione in un tubo da centrifuga immerso nel bagno di acqua e risciacquare il tubo flessibile della pompa con pre-riscaldato EGTA / HBSS soluzione. </li><li> Eseguire anestesia terminale utilizzando un barbiturico per produrre in modo affidabile di incoscienza prima depressione respiratoria e morte. Iniettare phenobarbitone a 1 mg / kg, ip in un topo CD1 femminile o maschile (35-45 g). Confermare l&#39;anestesia da pizzicare punta. </li><li> Shave peli addominali e sterilizzare la superficie addominale utilizzando una soluzione di etanolo al 70%. </li><li> Tagliare attraverso la cavità addominale ed esporre la vena porta e la vena cava inferiore spostando l&#39;intestino lateralmente a sinistra dell&#39;addome. </li><li> Stellat la pompa ad una velocità di 1-3 ml / min con la soluzione EGTA / HBSS e cannulate la vena porta con un ago 23 g farfalla (ali tagliate). Fissare la sezione della vena porta cannulata con l&#39;ago 23 G e quindi capovolgere la pinza serrefine sulla superficie dell&#39;addome del mouse aperto. Il fegato dovrebbe rapidamente pallido entro i primi 30 secondi di EGTA / HBSS soluzione perfusione. </li><li> Rapidamente incidere la parte inferiore della vena cava inferiore per evitare edificio sovrappressione nel fegato, e quindi aumentare la portata gradualmente a 7 ​​ml / min, il primo minuto di perfusione. L&#39;animale muore a causa di sanguinamento secondario a Vena prelievo venoso cavale. </li><li> Quando meno di 5 ml di EGTA / HBSS soluzione è rimanente in provetta, riempire con collagenasi Solution (40-50 ml). Aumentare la portata gradualmente a 10 ml / min, più di 30 sec. </li><li> Rendere il rigonfiamento del fegato applicando pressione alla vena cava inferiore, utilizzando una pinzetta, per 5-10 intervalli sec. This può essere fatto periodicamente (5-10 volte durante la digestione). Questa fase permetterà di migliorare la dissociazione delle cellule del fegato e ridurre il tempo di perfusione con collagenasi. </li><li> Quando meno di 10 ml di soluzione di Collagenasi rimane all&#39;interno del tubo da centrifuga, versare 40-50 ml di soluzione pre-riscaldato Collagenase nel tubo da centrifuga. </li><li> Dopo 10-15 minuti di perfusione e circa 70-80 ml di collagenasi Solution perfusi, applicare una piccola pressione sulla superficie del fegato con una pinza. Una stampa di pressione indica che le cellule epatiche sono dissociate. </li><li> Rimuovere il fegato dalla cavità addominale come un unico pezzo e metterlo in una provetta da centrifuga contenente 20-30 ml di Kupffer celle d&#39;isolamento medio. Mantenere cellule epatiche in ghiaccio oa 4 ° C per un periodo massimo di 3 ore per evitare di compromettere la vitalità delle cellule del fegato. </li><li> Ripetere la procedura di perfusione su diversi animali, se necessario, mantenendo il fegato perfuso su ghiaccio. Pool 1-3 fegati per la purificazione e procedere con la fase 3. </li></ol> 2. Preparazione del gradiente di densità per centrifugazione (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparazione del gradiente di densità Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. Il SIP è preparata mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestite con 1,7 ml di 10 x PBS. A 5 ml di SIP sono mescolati con 15 ml di PBS per rendere soluzione SIP 20 ml di 25%. 10 ml di SIP sono mescolati con 10 ml di PBS per ottenere soluzione SIP 20 ml di 50%. Un tubo da centrifuga contenente la soluzione al 50% SIP (20 ml) è inclinato e la soluzione SIP 25% (20 ml) viene aggiunta lentamente utilizzando un ml pipetta sierologica 25. <ol><li> Procedere con le seguenti operazioni (sezione 2., 3. e 5.) sotto condizioni sterili e mantenere le cellule in ghiaccio o a 4 ° C. Preparare la SIP (Soluzione di particelle di silice rivestite Isotonic) mescolando 15,3 ml di soluzione di particelle di silice rivestiti con 1,7 ml di 10 x PBS. </li&gt; <li> Per rendere 20 ml di soluzione SIP 25%, mescolare 5 ml di SIP con 15 ml di PBS. Per rendere 20 ml di soluzione SIP 50%, miscelare 10 ml di SIP con 10 ml di PBS. </li><li> Riempire una provetta da centrifuga con 20 ml della soluzione SIP 50%. Inclinare la provetta da centrifuga con un angolo vicino a 90 ° e aggiungere lentamente la soluzione SIP 25% (20 ml) sulla parete laterale del tubo con un 25 ml pipetta sierologica, senza toccare la superficie dello strato SIP 50%. Quando si aggiunge la soluzione SIP 25%, ridurre progressivamente l&#39;angolo del tubo. Mantenere il gradiente di densità su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Kupffer Purificazione cellulare (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. Purificazione di cellule di Kupffer dal gradiente di densità centrifugazione e l&#39;adesione cellulare Tutte le procedure sono eseguite in condizioni sterili. (A) Dopo la rottura della capsula di Glisson, cellule del fegato sono filtrate attraverso un 100 micron filtro. La sospensione è centrifugato a x 50 g di disfarsi epatociti (pellet) e raccogliere la frazione di cellule non parenchimali (surnatante). Questa fase viene ripetuta 3 volte. Le cellule non parenchimali vengono aggiunti in cima a un gradiente isotonica discontinuo e centrifugato a 800 xg per 15 min. Cellule di Kupffer raccolti dal cuscino SIP 25% sono purificati ulteriormente selezione adesione cellulare. (B) Le cellule vengono piastrate in piastra da 24 pozzetti e incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 30 min. Le cellule non aderenti vengono lavati una volta con 500 ml di HBSS. Cellule di Kupffer mostrano la loro aderenti morfologia 4 ore dopo la placcatura, quando -CNTs f possono essere aggiunti alle cellule. La barra della scala rappresenta il 25 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Mettere un fegato perfuso in una capsula di Petri con 15 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium. Rottura capsula di Glisson (membrana del fegato) con le forbici e rilasciare tutte le cellule del fegato nel mezzo di isolamento delle cellule Kupffer. Filtrare la soluzione se un filtro cellulare 100 micron per essere raccolto in una provetta da centrifuga. Ripetere la procedura di perfusione su altri fegati irrorati e riunire le celle nella stessa provetta da centrifuga (15 ml di un mouse, fino a 45 ml da tre topi). </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Cellule parenchimali (epatociti) saranno in pellet e cellule non parenchimali (comprese le cellule di Kupffer) saranno nel surnatante. </li><li> Raccogliere il supernatante in una provetta da centrifuga pulita e centrifugare a 50 xg per 2 minuti ciascuno. Ripetere questa operazione per altre tre volte. </li><li> Centrifugare a 1.350 xg per 15 minuti per far sedimentare le cellule non parenchimali. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di Kupffer isolamento delle cellule Medium. </li><li> Aggiungere la soluzione di cellule non parenchimali sul gradiente discontinuo isotonica 25/50% come descritto al punto 2.3. Centesimorifuge a 850 xg per 15 minuti, senza accelerazione o interruzione. </li><li> Localizzare la frazione di cellule di Kupffer arricchita torbidi all&#39;interno della frazione SIP 25% vicino all&#39;interfaccia SIP 25/50% (Figura 3). Utilizzando un 10 ml pipetta sierologica, aspirare circa 12 ml di frazione di cellule Kupffer arricchito. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga contenente 35-40 ml di Kupffer isolamento delle cellule Media. Miscelare delicatamente e centrifugare a 1.350 xg per 15 min a 4 ° C per sedimentare le cellule. </li><li> Eliminare le cellule surnatante e risospendere in 5-10 ml di pre-riscaldato cellule Kupffer Cultura Media. Contare le celle (emocitometro) e misurare la sostenibilità utilizzando trypan colorazione blu. </li><li> Piastra le purificate cellule non parenchimali in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 5 x 10 5 cellule / pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 (Figura 3). Dopo 30 minuti, togliere delicatamente il medium, lavare con pre-riscaldato soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) una volta quindi sostituirecon 500 ml di fresco e pre-riscaldato Kupffer terreno di coltura cellulare (per bene). </li><li> Lasciare cellule di Kupffer per almeno 4 ore a 37 ° C e 5% CO 2 prima del trattamento con nanoparticelle, per consentire loro di acquisire loro morfologia aderente. </li></ol> 4. Caratterizzazione <ol><li> Kupffer Cells Purezza <ol><li> Preparare fresco soluzione PBS / BSA utilizzato per mantenere la vitalità delle cellule Kupffer. Lavare le cellule una volta con 500 ml di soluzione di PBS / BSA. Rimuovere la soluzione PBS / BSA e staccare cellule di Kupffer in 500 ml di soluzione fresca PBS / BSA con delicato raschiatura. Quando le cellule vengono piastrate in piastre da 24 pozzetti, abbreviare le estremità delle pale raschianti con forbici per rendere il distacco facile procedere. Trasferire le cellule in citometria a flusso tubi. </li><li> Contare le cellule di Kupffer utilizzando un emocitometro e centrifugare 1 x 10 5 cellule a 1.350 x g. Risospendere le cellule Kupffer in 30 ml di F4 / 80 anticorpi (pulito). Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Mantenere le cellule non colorate (non incubate con l&#39;anticorpo) su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione PBS / BSA in cellule colorate, centrifugare a 1.350 g per 5 minuti e scartare il surnatante risultante. Risospendere cellule colorate in 200 ml di PBS / BSA. </li><li> Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-1 canale. </li><li> Ripetere la procedura per le cellule di Kupffer colorate mantenendo le stesse impostazioni utilizzate per l&#39;analisi di citometria a flusso di cellule di Kupffer non colorati. Selezionare e quantificare la fluorescenza delle cellule colorate per valutare la purezza delle cellule Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer cellulare fagocitaria Attività <ol><li> Sostituire media con 0,5% (v / v) perline fluorescenti in Kupffer cellulare terreno di coltura e incubare per 4 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Al fine di rimuovere perline non interiorizzate, cellule di Kupffer centrifugare a 1.350 xg, discard le cellule surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS / BSA Solution. Ripetere questa operazione altre 2 volte. </li><li> Raschiare le cellule Kupffer in 500 ml di soluzione e di trasferimento cellule PBS / BSA in un tubo di citometria a flusso. </li><li> Cellule centrifuga Kupffer a 1.350 xg, scartare le cellule surnatante e risospendere in 200 ml di PBS / BSA Solution. </li><li> Per citometria a flusso, porta 10.000 non colorati cellule di Kupffer base alle loro dimensioni (forward scatter) e granularità (lato dispersione). Analizzare fluorescenza delle cellule gated in FL-2 canali. </li></ol></li></ol> 5. Incubazione di chimicamente nanotubi di carbonio funzionalizzati (f -CNTs) <ol><li> Preparare una dispersione di -CNTs f (1 mg / ml) in acqua mediante sonicazione per 15 minuti prima dell&#39;uso. -CNTs F sono preparati in casa 22. </li><li> Preparare 2x CNT f- concentrati dispersione in Kupffer terreno di coltura cellulare. CNT f- Sonicare dispersi in mezzo per2 min prima di procedere con passo 5.3). </li><li> Per ogni bene, sostituire 250 ml di vecchi media con 250 ml di 2x dispersione -CNTs f. Pozzetti non trattati (250 l di media condizionata + 250 ml di fresco Kupffer terreno di coltura cellulare) e pozzi trattati con 10% di DMSO sono utilizzati come controlli negativi e positivi, rispettivamente. </li><li> Incubare le cellule di Kupffer a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 o 72 ore. </li></ol> 6. Tossicità Valutazione della -CNTs f in cellule di Kupffer dal lattato deidrogenasi (LDH) Modificato <ol><li> Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 microlitri (per pozzetto della piastra da 24 pozzetti) di tampone di lisi e incubare a 37 ° C per 30 min-1 hr. </li><li> Dopo aver effettuato pipettaggio vigoroso, raccolgono lisate cellule di Kupffer in provette da microcentrifuga e centrifugare a 40.000 g per 10 minuti a pellet -CNTs f che sono state prese dalle cellule e detriti cellulari. </li><li> Raccogliere il surnatante (ƒ-CNT gratis) inprovette da microcentrifuga e conservare a -20 ° C o passare al punto 6.5). </li><li> Trasferire 50 ml in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere un volume uguale di soluzione di substrato mix (kit LDH) a ciascun pozzetto. Coprire la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 15 min prima di aggiungere 50 ml di soluzione di arresto (kit LDH). Aggiungere triplicato di pozzi vuoti contenenti 50 ml di tampone di lisi, 50 ml di soluzione di substrato mix e 50 ml di soluzione di stop. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 490 nm in un lettore per micropiastre e utilizzare la seguente formula per calcolare il (%) vitalità cellulare. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

I seguenti punti sono fondamentali per conseguire un livello elevato rendimento e l&#39;alta vitalità delle cellule di Kupffer. Condizioni asettiche dovrebbero essere utilizzati per limitare il rischio di contaminazione batterica e fungina. Tutti gli strumenti devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso. I reagenti devono essere preparate al momento, prima di effettuare la procedura di isolamento. La scelta di collagenasi IV, con bassa attività trittico, è di fondamentale importanza. Diversi lotti dallo stesso fornitore hanno attività enzimatica diverso e possono avere bisogno di essere paragonato inizialmente per selezionare il gruppo più adatto per l&#39;isolamento delle cellule Kupffer. Questo può essere giudicato da valutare la resa delle cellule e la vitalità cellulare. Si consiglia inoltre di contattare il fornitore per fornire lotti che sono stati utilizzati per le applicazioni simili. Una volta deciso il lotto da utilizzare, riservare per un uso futuro. La procedura di incannulamento richiede una formazione. Pianificare l&#39;uso di diversi animali per prendere confidenza con la vena portaProcedura incannulamento. Con la pratica, cannulazione successo è facile da realizzare e la procedura può essere gestito da una sola persona. Si noti che l&#39;utilizzo di animali pesanti aumenta il diametro della vena porta e quindi facilita la procedura. Quando la parete posteriore della vena porta è perforato, è tecnicamente difficile accedere nuovamente alla vena, soprattutto se sei nuovo con questo procedimento e, pertanto, è preferibile iniziare con un nuovo animale. Le soluzioni HBSS e Collagenasi dovrebbero avere il loro pH regolato a 7,4 e essere pre-riscaldata a 40 ° C per ottenere una temperatura di uscita dalla pompa peristaltica di 37 ° C. La perfusione con EGTA / HBSS Solution (Ca 2+ e Mg 2+ gratuito) è necessario che contiene EGTA per l&#39;interruzione di Ca 2+ molecole di adesione -dipendenti, chiamato desmosoma, indebolendo l&#39;interazione cellula-cellula. Collagenasi di tipo IV è usato per staccare cellule epatiche dalla matrice extracellulare e quindi portare a fegatola dissociazione delle cellule. Il tempo di perfusione per le due soluzioni non deve superare 15 min per topi CD1 ma altri ceppi, quali C57BL / 6, richiedono fegato leggermente più lungo tempo di digestione. Per ottenere un isolamento efficace, è necessario ottenere elevata resa e la vitalità cellulare. Se lo sperimentatore non ha alcuna esperienza in isolamento delle cellule del fegato, si consiglia di combinare pellet epatociti dai primi 3 centrifugazioni a 50 xg e contare le cellule da trypan blu test esclusione. Il rendimento epatociti deve essere&gt; 20 x 10 6 cellule e la vitalità degli epatociti&gt; 50%. I rendimenti bassi derivano essenzialmente da una cattiva dissociazione cellulare che porta indirettamente ad abbassare il rendimento delle cellule Kupffer. Dovrebbe essere confermato che il fegato è digerito al termine della fase di perfusione. Quando adatto resa epatociti è realizzata in combinazione con bassa viabilità epatociti, questo può derivare da una digestione collagenasi eccessivo ma è più probabilmente spiegato da un fegato appropriatoProcedura perfusione o l&#39;uso di un reagente / materiale contaminato. Dopo la placcatura, cellule di Kupffer sono sensibili e devono essere lavati delicatamente. Almeno 4 ore sono necessarie per le cellule di Kupffer di acquisire la loro morfologia aderente. Il trattamento viene effettuato generalmente 4-24 ore dopo la placcatura, come cellule di Kupffer mostrano la loro massima dell&#39;attività fagocitaria nel 1 giorno dopo la placcatura. Nel nostro protocollo, si descrive la dissociazione di CD1 cellule di fegato di topo, seguita dalla purificazione di cellule di Kupffer mediante gradiente di densità centrifugazione e selezione per adesione. La caratterizzazione delle cellule di Kupffer, citometria a flusso, dimostra che elevata resa e la purezza delle cellule di Kupffer possono essere realizzati con questo metodo. Questo metodo di isolamento delle cellule Kupffer rappresenta un compromesso valido tra complessità e la resa delle cellule. Tuttavia, si segnala che alcuni metodi di cellule di Kupffer possono essere più facili da condurre, come il protocollo descritto daWu et al., In cui il fegato è digerito ex vivo 23. Tuttavia, il metodo descritto da Wu et al. porta ad un numero limitato di cellule e purezza cella inferiore. Resa e purezza possono essere ottenuti ma richiedono attrezzature costose e / o sofisticati e può richiedere molto tempo. Il protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. 16 utilizzato un protocollo paragonabile base di 2-step metodo perfusione (HBSS + collagenasi digestione) seguita da centrifugazione su gradiente di Percoll e selezione del cuscino Percoll inferiore per ulteriore purificazione per adesione superficiale. Modificando la procedura di centrifugazione e raccogliendo il cuscino Percoll superiore, abbiamo aumentato la frazione arricchita di cellule Kupffer da 5,25 x 10 6-8,2 x 10 6 cellule per grammo di fegato. Tale miglioramento potrebbe essere attribuito all&#39;uso di EGTA durante la fase perfusione presto al fine di facilitare la dissociazione delle cellule epatiche. Mnoltre, l&#39;uso di citometria a flusso analisi ha permesso la caratterizzazione quantitativa affidabile di purezza delle cellule Kupffer e attività fagocitaria. Con una resa massima di 14 x 10 6 cellule purificate non parenchimali al fegato di topo. Il presente metodo di isolamento ottenere una maggiore quantità di cellule di Kupffer per topo fegato a quanto riportato in letteratura 24. Questo miglioramento può essere spiegata con l&#39;uso di più pesante mouse (35-45 g) rispetto ad altri metodi 24. Accanto a questo aumento di quantità di cellule, l&#39;uso di animali più grandi facilita notevolmente la procedura di cannulazione vena porta. High-throughput test in vitro può essere effettuata con questo modello fagocitica primario, quindi simulando l&#39;impatto tossicologico delle nanoparticelle in vivo. La comprensione globale di nanotossicologia potrebbe beneficiare di tali modelli, rendendo la selezione di nanoparticelle per la traduzione clinica più efficiente. Inoltre, è in linea conattuazione del concetto di 3 R (riduzione, perfezionamento e sostituzione) nella ricerca biomedica animali.

Il campo di ricerca nanotossicologia mira a caratterizzare l&#39;effetto biologico delle nanoparticelle. Studi tossicologici basati su indagini in vivo restano i metodi più accurati. Tuttavia, il loro impiego è limitato dalla loro costo, lavoro e tempo requisiti 1. Come saggi alternative, in vitro sono stati utilizzati per la loro semplicità e la possibilità di sviluppare ad alta produttività in piattaforme di test in vitro 2 - così estendendo il numero di condizioni testate. La maggior parte degli studi nanotoxicological sono eseguiti utilizzando in vitro con linee cellulari immortalizzate. Tuttavia, ci sono preoccupazioni per quanto riguarda l&#39;estrapolazione di questi risultati sperimentali di effetti tossicologici in vivo 3. Infatti, le proprietà di linee cellulari immortalizzate possono essere significativamente diverso dai tessuti sono stati derivati ​​da, per esempio la trasformazione genetica 4, il deterioramento delle caratteristiche morfologiche chiave5, perdita della polarità cellulare 6 e alterazioni funzionali come la regolamentazione dei mediatori infiammatori 7. Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e sono direttamente in contatto con il sangue allineando la parete di sinusoidi epatici. Come parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), questi macrofagi sono responsabili per la cattura di circolazione nanoparticelle e pertanto costituiscono un modello particolarmente adatto per studiare la tossicità delle nanoparticelle. In vivo 8 e in vitro 9 studi di risposte infiammatorie associate con le cellule di Kupffer esposte a nanoparticelle sono stati pubblicati altrove. Cellule di Kupffer sono state coinvolte nella patogenesi delle malattie del fegato, come la malattia epatica alcolica 10, fibrosi epatica 11 o epatite virale 12. E &#39;stato riferito che le cellule di Kupffer isolate forniscono informazioni utili per descrivere i meccanismi cellulari involved in rottura di fegato 13,14. Diversi metodi sono stati segnalati per isolare e purificare le cellule di Kupffer. Isolamento cellulare può derivare da meccanico o enzimatica dissociazione 15. Digestione Collagenase mostra il vantaggio di conservare l&#39;integrità funzionale delle cellule di Kupffer, mentre portando a rendimento cellula di alta Kupffer 16. Molti approcci sperimentali, che variano in complessità e costi, sono stati utilizzati per separare le cellule di Kupffer da altre popolazioni cellulari del fegato. Ad esempio, la purezza delle cellule Kupffer può essere ottenuto mediante immunoaffinità 17, elettroforesi flusso 18, adesione selettiva 16 o mediante tecniche centrifughe 16, che selezionano celle in base alla loro dimensione e la densità. Una combinazione di questi metodi può essere scelto per aumentare la purezza della popolazione 16. Non c&#39;è consenso sul metodo ideale per l&#39;isolamento delle cellule Kupffer, in quanto dipende in gran parte l&#39;applicazione e disponibili equipment. Tuttavia, nel caso di test di tossicità delle nanoparticelle, la semplicità e l&#39;alta resa della tecnica associata con la conservazione funzionale delle cellule di Kupffer sembrava essere più adatto per questa applicazione. Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo è stato modificato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. 16 progettato per l&#39;isolamento delle cellule di fegato di ratto. La maggior parte degli studi hanno riportato e descritto l&#39;isolamento delle cellule Kupffer da fegati di ratto. Qui, si descrive un metodo per isolare le cellule di Kupffer da fegato di topo, ad un alto rendimento e purezza. L&#39;utilizzo di topi riduce il costo dell&#39;esperimento e permette la lavorazione di diversi fegati di ottenere grandi quantità di cellule di Kupffer per test di tossicità nanoparticelle. Nella seguente protocollo, cellule di Kupffer sono state incubate con nanotubi di carbonio funzionalizzati (f </em&gt; -CNTs). Le proprietà uniche chimico-fisiche del CNT - cioè alto rapporto lunghezza su diametro e grande superficie, hanno fatto CNT candidati interessanti come vettori per scopi terapeutici e di diagnosi. Tuttavia, sono state espresse in merito alla tossicità del CNT 19, e lo sviluppo di nuovi test in vitro è inteso a migliorare la comprensione di CNT effetto biologico. Tossicità in cellule di Kupffer è associato ad una mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare. Questo viene misurato dalla perdita di enzima LDH citoplasmatica dalla cellula nel supernatante. Il principio di questo metodo, quindi, è quello di rimuovere qualsiasi LDH rilasciata e misurare ciò che resta nelle celle 20. Questo viene fatto in preferenza alla misura della LDH rilasciata nel supernatante perché la presenza di CNT nel surnatante interferisce con il test 21. Proponiamo l&#39;uso di questo efficace metho isolamento delle cellule Kupffer semplice ed economicod isolare elevato numero di cellule di Kupffer funzionali. Questo permette la proiezione di tossicità di una gamma di nanoparticelle, in un modello rilevante macrofagi primari.

<table><tbody><tr><td>Euthatal (pentobarbital sodium)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 mice</td><td>Charles River&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS (Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;and Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free, with bicarbonate)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS must be&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>E8145&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;selectively.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15630-056&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase type IV&amp;nbsp;</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>CSL-4&amp;nbsp;</td><td>It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Low glucose DMEM&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5523&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12633-012&amp;nbsp;</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>First-Link&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>60-00-850&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blue solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td>100 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coated silica particle solution (Percoll)</td><td>GE Healtcare&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>17-0891-02&amp;nbsp;</td><td>Percoll&amp;reg; is very stable and can be kept for several years&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>D/4120/PB08&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LDH kit (CytoTox 96)&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>G1781&amp;nbsp;</td><td>Keep protected from light&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM phenol red free</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>31053-028&amp;nbsp;</td><td>500 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80 antibody (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Do not dilute, used neat for flow cytometry</td></tr><tr><td>Fluorescent beads</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml</td></tr><tr><td>Name of the Material</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Butterfly blood collection set (23 G/305 mm long tubing)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>367288</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.22 &amp;mu;m Blue Rim)&amp;nbsp;</td><td>Minisart&amp;nbsp;</td><td>16534-K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>35 2070&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (90 x 15 mm)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BSN 101VR20&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow&amp;nbsp;</td><td>SciQ 300&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine forceps</td><td>Hammacher GmbH&amp;nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23 G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>BD Biosciences, Falcon&amp;nbsp;</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&amp;nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.</td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company&amp;nbsp;</td><td>Catalog number&amp;nbsp;</td><td>Comments/Description&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank&#039;s Balanced Salt Solution) Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase Solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Isolation Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer Cell Culture Medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax&amp;reg; (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solution of isotonic coated silica particles)</td><td></td><td></td><td>Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp; with 15.3 ml of Percoll&amp;reg; to obtain 17mL of SIP.</td></tr><tr><td>25% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50% SIP solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>DMEM media with 0.9% Triton X-100</td></tr><tr><td>PBS/BSA Solution</td><td></td><td></td><td>Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer cell isolation for nanoparticle toxicity testing

La grande maggioranza degli studi in vitro nanotoxicological hanno utilizzato linee di cellule immortali per la loro praticità. Tuttavia, i risultati di test di tossicità delle nanoparticelle in linee cellulari immortali o cellule primarie hanno mostrato discrepanze, evidenziando la necessità di estendere l&#39;uso di pile per saggi in vitro. Questo protocollo descrive l&#39;isolamento di macrofagi fegato di topo, cellule di Kupffer denominate e il loro uso per studiare la tossicità delle nanoparticelle. Cellule di Kupffer sono la popolazione più abbondanti macrofagi nel corpo e costituiscono parte del sistema reticolo-endoteliale (RES), responsabile per la cattura di nanoparticelle circolanti. Il metodo di isolamento delle cellule Kupffer qui riportata si basa su un metodo di perfusione 2-step seguita da purificazione su gradiente di densità. Il metodo, basato sulla digestione collagenasi e centrifugazione densità, è adattato dal protocollo originale sviluppato da Smedsrød et al. Ideato per ratto isolatio cellule del fegaton e fornisce ad alto rendimento (fino a 14 x 10 6 cellule per topo) e purezza elevata (&gt; 95%) di cellule di Kupffer. Questo metodo di isolamento non richiede attrezzature sofisticate o costose e rappresenta quindi un compromesso ideale tra complessità e la resa delle cellule. L&#39;uso di topi più pesanti (35-45 g) migliora la resa del metodo di isolamento, ma anche facilita notevolmente la procedura di cannulazione vena porta. La tossicità dei nanotubi di carbonio funzionalizzati f -CNTs stata misurata in questo modello con il saggio LDH modificato. Questo metodo valuta vitalità cellulare misurando la mancanza di integrità strutturale della membrana cellulare Kupffer, dopo incubazione con -CNTs f. La tossicità indotta da -CNTs f può essere misurato in modo coerente da questo test, evidenziando che le cellule di Kupffer isolate sono utili per i test di tossicità delle nanoparticelle. La comprensione globale di nanotossicologia potrebbe beneficiare di tali modelli, rendendo la selezione nanoparticelle per traduzione clinica più efficiente.

Il numero di cellule parenchimali non purificati era coerente e variava tra 8 e 14 x 10 6 cellule per topo (sono stati eseguiti 17 isolamenti). Ogni isolamento topo era sufficiente alla piastra 16-28 pozzi. La vitalità cellulare da trypan colorazione blu ha dimostrato la vitalità delle cellule ~ 95%. Cellule di Kupffer mostrato una forma rotonda in 30 min di incubazione a 37 ° C, in relazione alla loro morfologia incomplete aderente (Figura 4A). A 4 ore di incubazione e successivamente, le cellule sono state diffuse e gruppi di cellule hanno cominciato a formarsi. Cellule di Kupffer sono stati poi caratterizzati per confermare la loro purezza e attività fagocitaria. Le cellule sono state colorate con F4 / 80 anticorpo per dimostrare la purezza delle cellule Kupffer. Citometria a flusso analisi ha mostrato la purezza delle cellule Kupffer superiore al 95% (Figura 4B). Le cellule sono state incubate con 1 micron perline fluorescenti, 12 ore dopo la placcatura, per confermare la loro capacità di raccogliere le particelle più grandi. Citometria a flusso analisi ha dimostrato that oltre l&#39;85% delle cellule di Kupffer sono fagociti, vale a dire in grado di prendere le 1 micron perline (Figura 4C). Dopo 72 ore di cultura, il 40% delle cellule Kupffer erano fagociti, indicando che le cellule di Kupffer parzialmente perso la loro attività fagocitaria. Microscopia imaging cellule di Kupffer incubate con -CNTs F per il 24 e 72 ore ha rivelato simile morfologia cellulare rispetto alle cellule naïve (Figura 5A). Cellule di Kupffer incubate con il 10% DMSO (controllo positivo) visualizzati morfologia necrotico (Figura 5A). Dopo l&#39;analisi del test LDH modificato, cellule di Kupffer trattati con 10% DMSO (controllo positivo) per 24 ore e 72 hanno mostrato un&#39;elevata tossicità (Figura 5B). In confronto, -CNTs f indotte lieve ma significativa riduzione della vitalità cellulare solo quando le cellule sono state esposte a 50 ug / ml per 72 ore (Figura 5B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig4.jpg" /> Figura 4: Purezza e l&#39;assorbimento abilità delle cellule di Kupffer (A) le immagini al microscopio di cellule Kupffer placcato dopo 30 minuti o 24 ore a 37 ° C, con una atmosfera di 5% di CO 2.. La barra della scala presenta 50 micron. (B) citometria a flusso analisi delle cellule di Kupffer è stata effettuata a seguito FSC / SSC gating cellulare. Purezza delle cellule Kupffer è stato determinato utilizzando F4 / 80 colorazione anticorpale e ha mostrato di essere superiore al 95%. Cellule (C) Kupffer sono state incubate per 4 ore in presenza di 1 micron perline fluorescenti per valutare la loro attività fagocitaria. Le proprietà funzionali di Kupffer sono stati mantenuti meglio in cellule appena isolate (12 ore dopo la placcatura) rispetto alle cellule testate dopo 3 giorni. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig5.jpg" /> Figura 5: Assorbimento e tossicità di &lt;em&gt; CNT f- nelle cellule di Kupffer. (A) immagini al microscopio delle cellule di Kupffer. Immagini mostrano cellule di Kupffer trattati con 10% DMSO e 50 ug / ml di -CNTs f a 37 ° C per 24 e 72 ore. La barra della scala presenta 50 micron. (B) Modificato test LDH. La vitalità delle cellule Basso è stato visto in DMSO cellule trattate il 10% (controlli positivi) mentre -CNTs f colpiti in modo significativo la vitalità cellulare solo dopo l&#39;esposizione a 50 mg / ml per 72 ore. * P &lt;0.05 rispetto alla condizione naïve (escluso il 10% condizione DMSO) utilizzando l&#39;analisi della varianza (ANOVA) con l&#39;analisi post hoc dal test Tukey. La barra di scala corrisponde al 50 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52989/52989fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Kupffer isolamento delle cellule di nanoparticelle test di tossicità

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.6K Views.  King's College London. Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells. 

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Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Rimozione di Oligoelementi per Cupric nanoparticelle di ossido di uranio da<em&gt; In Situ</em&gt; Recupero Bleed Acqua e il suo effetto sulla vitalità cellulare

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Ricerca

Ambiente

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Immunologia e infezioni

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioingegneria

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Isolamento di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di cancro al seno per lo studio di nanoparticelle mirate

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Ricerca sul cancro

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Neuroscienze

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Biologia

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Isolamento e coltura di cellule di Kupffer di topo

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...

Kupffer isolamento delle cellule di nanoparticelle test di tossicità

Riepilogo

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Rimozione di Oligoelementi per Cupric nanoparticelle di ossido di uranio da