Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.

1. Preparazione di Durotaxis Chambers <ol><li> Per preparare un 6-pozzetti di coltura tissutale, tarare la bilancia con un tubo da 50 ml. Pesare circa 10 g della soluzione di base PDMS nel tubo da 50 ml (la soluzione è abbastanza viscoso). </li><li> Per 90: 1 substrato (Compliance di ~ 1 kPa), dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS nel tubo 90 per determinare la corretta quantità di soluzione reticolante necessaria. Aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante PDMS al tubo stesso. Esempio: 10 g / 90 = 0,11 g. Aggiungere 0,11 g della soluzione reticolante PDMS alla soluzione di base PDMS. NOTA: La base e reticolante soluzioni sono entrambi forniti nel kit PDMS. </li><li> Mescolare energicamente la miscela base / reticolante PDMS per 5 minuti a temperatura ambiente usando una piccola spatola. A questo punto la miscela contiene un gran numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Centrifugare il substrato PDMS in una centrifuga da banco per 5 min a 50 xg a temperatura ambiente per rimuovere l&#39;bubbles. Se ci sono ancora bolle dopo 5 min, centrifuga di nuovo. </li><li> Pipettare 1 ml di 90: 1 PDMS substrato in ciascun pozzetto della coltura di tessuti trattati 6 pozzetti. Eventuali bolle d&#39;aria residue presenti nei PDMS possono essere eliminate in questa fase estraendo usando un ago 21 G. Lasciare le PDMS a diffondere per 30 minuti nel pozzo. </li><li> Bollire 12 millimetri di vetro # 1 coprioggetto in acqua distillata per 5 min. Ripetere due volte e memorizzare i coprioggetti in acqua distillata. </li><li> Mettere uno, coprioggetto secco in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale toccando delicatamente un lato del vetrino nella soluzione PDMS poi cadere il vetrino sui PDMS. Come il coprioggetto deposita, PDMS cominceranno ad invadere sui bordi del vetrino, ma non copre completamente. Questo genera un&#39;interfaccia tra le PDMS e vetro dopo la polimerizzazione (vedere Figura 1A, B). </li><li> Incubare la piastra a 70 ° C in un forno per 16 ore per curare (indurimento) PDMS. Posizionare il plate in una cappa di coltura cellulare e UV sterilizzare per 10 min. NOTA: E &#39;meglio per rendere le piastre entro un paio di giorni di utilizzo. Tuttavia, le piastre possono essere avvolte in Parafilm senza tampone e conservati a 4 ° C fino a 2 settimane senza alcuna diminuzione nella qualità. </li></ol> 2. Cella placcatura NOTA: Se studiare l&#39;effetto di knockdown siRNA-mediata, eseguire il colpo con le istruzioni del produttore o il protocollo ottimizzato per il tipo cellulare di scelta. <ol><li> Coat ogni durotaxis camera con 1 ml di 10 mg / ml in PBS fibronectina senza calcio e magnesio per 1 ora a 37 ° C. In alternativa, la fibronectina può essere applicato il giorno prima dell&#39;analisi incubando le PDMS con 10 ug / ml in PBS fibronectina per 16 ore a 4 ° C. Assicurarsi che l&#39;intera superficie è immersa nel fibronectina in soluzione PBS. </li><li> Preparare calore denaturato 1% di BSA. Pesare 0,5 g BSA e scioglierlo in 50 ml di PBS.Filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e riscaldare a 80 ° C per 12 min. Nota: Preparare questa soluzione il giorno prima cella di placcatura e conservare a 4 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione fibronectina e lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 1 ml di calore denaturato BSA in PBS ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Trypsinize e contare le cellule di scelta, mentre le camere durotaxis stanno bloccando con il calore denaturato BSA. </li><li> Piastra 1 x 10 5 cellule in un volume di 2 ml in ciascun pozzetto della camera durotaxis, utilizzando il supporto desiderato per il particolare tipo di cellula di scelta. Permettono alle cellule di aderire e diffondere sul substrato per 4 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: cellule U2OS sono normalmente mantenute in DMEM con 10% FBS, supplementato con 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato, e 10 UI / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina. NOTA: il numero di cellule usato in questo esempio è ottimizzato perCellule U2OS. Ottimizzazione per altri tipi di cellule può essere richiesto. Questa densità dà le cellule sufficiente per migrare senza interazioni significative con altre cellule. </li></ol> Imaging 3. Live-cell <ol><li> Eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo su un microscopio invertito, con contrasto di fase con un obiettivo 10X. Il microscopio deve essere dotato di un ambiente, camera umidificata chiusa, permettendo il controllo di temperatura a 37 ° C e 5% CO 2 durante l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> Dopo che le cellule si sono diffuse per circa 3,5 ore, montare la placca nella camera microscopio. Lasciare il campione (s) per equilibrare nella camera per 30 min. </li><li> Impostare automatizzato, multi-punto in visita sul microscopio, se disponibile. Focus su l&#39;interfaccia tra le 90: 1 PDMS e il vetrino di vetro e scegliere i punti per l&#39;immagine in tutto l&#39;interfaccia con una media di 40 punti per durotaxis camera. Immagine le cellule ogni 10 min per un massimo di 16 ore. NOTA: Il regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all&#39;interfaccia effettiva tra le PDMS e il vetrino. Vedere la Figura 1B. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Generare un foglio di calcolo come nella tabella 1. </li><li> Contare il numero di eventi di attraversamento dalle PDMS alla superficie di vetro e viceversa da ogni film generato. Registrare il numero di eventi di attraversamento nell&#39;apposita colonna nel foglio di calcolo Excel. NOTA: Un evento di crossing è definito come il nucleo cellulare passando sopra il confine tra le PDMS e vetro in entrambe le direzioni. </li><li> Per quantificare attraversare più, contare il numero di volte che la cella è transitato dall&#39;interfaccia. Tale numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui la cella era situato alla fine del film. Ripetere l&#39;analisi per ogni cellula che attraversa l&#39;interfaccia in tfilm che. Escludere le cellule che migrano fuori dal campo visivo durante l&#39;imaging. NOTA: È anche importante verificare, da cellule contando all&#39;inizio dell&#39;esperimento, che le cellule sono in grado di aderire ugualmente ai PDMS fibronectina rivestite coprioggetto e superfici di vetro. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule che migrato da PDMS alla superficie del vetro (cioè, durotaxis subito). Aggiungere il numero di attraversare gli eventi da morbido a duro e gli eventi di attraversamento più che si sono concluse sul disco e dividere per il numero totale di eventi di attraversamento. </li><li> Calcolare la percentuale di attraversare più dividendo il numero di attraversare più volte per il numero totale di incroci. </li></ol>

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The authors have no conflicts to disclose.

Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradiente rigidità che viene fornito da sistemi più sofisticati 4. È importante sottolineare che, a differenza di substrati poliacrilammide, i componenti ECM non devono essere chimicamente reticolato a PDMS. Infatti, il rivestimento fibronectina è approssimativamente equivalente su entrambi i PDMS e le superfici di vetro, come determinato mediante colorazione con un anticorpo specifico per la fibronectina 11. Da studi precedenti hanno dimostrato che le cellule si comportano allo stesso su entrambi PDMS o substrati poliacrilammide, l&#39;uso of PDMS substrati fornisce un modello molto più facile con cui studiare meccanotrasduzione nelle cellule 10,12. Il passo più importante nella preparazione dei substrati PDMS è quello di garantire che il reticolante soluzioni base e vengono accuratamente miscelati. Se non sono mescolati abbastanza bene, poi i substrati non saranno completamente curare in seguito al trattamento termico. Ciò comporterà il vetrino affondare troppo nei PDMS o il vetrino alla deriva nei PDMS durante l&#39;imaging. Se la forza centrifuga è troppo alta, le soluzioni basiche e reticolante possono separare nel tubo. Questo può essere risolto riducendo la velocità di centrifugazione o mediante degasaggio della miscela per 30 minuti usando una camera a vuoto. Infine, la densità delle cellule è un fattore critico, come troppe cellule influenzano la loro capacità di diffondersi pienamente e per durotax indisturbato dal contatto con le cellule vicine. La densità qui riportate è stato ottimizzato per le cellule U2OS. Tuttavia, se si utilizzano altri tipi di cellule, cel ottimalenumeri l dovranno essere determinati empiricamente. Abbiamo recentemente usato questo test per studiare come l&#39;adesione focale segnalazione proteina cdGAP regola mechanosensing e durotaxis 11. Chiaramente, ci sono numerosi componenti cellulari in aggiunta alle adesioni focali, come elementi del citoscheletro, componenti di traffico di proteine ​​e canali ionici che sono coinvolti nella segnalazione meccanica e quindi può anche contribuire alla regolazione di durotaxis 13-15. Ciascuno di questi componenti potrebbero essere prontamente valutata nel nostro sistema utilizzando approcci simili RNAi. Inoltre, questo test è molto suscettibile all&#39;introduzione di vari attivatori o inibitori farmacologici. Il test può essere adattato anche per consentire forme più sofisticate di analisi, come l&#39;incorporazione di proteine ​​fluorescenti-taggato, in combinazione con approcci FRET o FRAP, per studiare la dinamica delle proteine ​​e l&#39;attivazione spazio-temporale.

La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine ​​strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l&#39;ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi neurogene mentre rigidi (~ 25 kPa) substrati di promuovere la differenziazione osteogenica 1. Analogamente, un aumento della rigidità matrice stromale ha dimostrato di promuovere la tumorigenesi mammaria cellule epiteliali ed invasione nel 2,3 tessuto circostante. Un aspetto particolarmente interessante di questo mechanosignrisultati dell&#39;attività aling in un processo noto come durotaxis, in cui le cellule migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido 4,5. Le cellule rilevano costantemente le caratteristiche fisiche del loro ambiente extracellulare attraverso recettore integrina legame alla ECM. Questo, a sua volta, promuove l&#39;accumulo di numerose proteine ​​strutturali e segnalazione ai loro domini citoplasmatici per guidare la formazione di strutture adesive note come adesioni focali o contatti focali 6,7. Dal momento che le integrine non hanno attività enzimatica intrinseca, i segnali vengono inoltrati dal ECM attraverso queste proteine ​​accessorie per coordinare la risposta delle cellule al loro ambiente mutevole 8. Di conseguenza, l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione mechanosignaling e durotaxis è un&#39;importante area di ricerca. Vari sistemi modello sono stati sviluppati per studiare durotaxis in vitro, ma la maggior parte hannoutilizzati collagene rivestite poliacrilammide substrati 4. Tuttavia, la preparazione dei substrati di poliacrilammide può essere tecnicamente impegnativo e il collagene utilizzato in questi saggi deve essere chimicamente reticolato al substrato 9. Polidimetilsilossano (PDMS) substrati hanno dimostrato di presentare proprietà meccaniche paragonabili ai substrati di poliacrilammide 10. Tuttavia, substrati PDMS vengono preparate semplicemente miscelando un rapporto della base di reticolante e questi substrati possono essere rivestiti con proteine ​​ECM senza la necessità di reticolazione chimica, rendendo così più facile PDMS uno strumento per studiare gli effetti di rigidità sul comportamento cellulare. Qui, si descrive come preparare una semplice camera di durotaxis in cui un substrato morbido PDMS è integrato con un coprioggetto vetro rigido. Il saggio, come indicato di seguito, fornisce un metodo rapido e semplice per lo studio durotaxis. Per questo studio abbiamo utilizzato cellule di osteosarcoma U2OS umane combinate con siRNA-mediataatterramento di cdGAP per studiare il ruolo di questa proteina di adesione focale durotaxis 11. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adattato alle esigenze individuali. Altri tipi cellulari possono essere sostituiti per le cellule U2OS e qualsiasi proteina possono essere abbassati o overexpressed per determinare gli effetti sul comportamento cellulare durante durotaxis. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per incorporare le proteine ​​fluorescenti tag per analizzare le loro dinamiche e comportamento utilizzando FRAP o preoccuparsi approcci.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Cover glass 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l&#39;invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un&#39;interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell&#39;esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine ​​di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.

Uno schema della camera durotaxis è mostrato nella Figura 1A. Substrato PDMS molle (90: 1 miscela di base di PDMS a reticolante soluzioni) si sviluppa in un piatto 6 pozzo e un vetrino di vetro è posto sulla parte superiore delle PDMS, che poi ricopre parzialmente la superficie superiore del vetrino, creando un&#39;interfaccia tra i due substrati di conformità diverso. La rigidità del substrato PDMS morbido è ~ 1 kPa, che è paragonabile alla conformità tipica del tessuto cerebrale, mentre la rigidità del vetro è di circa 1-2 GPa 1. Un contrasto di fase dell&#39;interfaccia tra le PDMS e vetro è indicata dalle frecce bianche in Figura 1B. Gli asterischi indicano due celle controllo RNAi migrazione verso il substrato più duro. Il bordo frastagliato che può essere visto (freccia nera) corrisponde al bordo del vetrino. Per quantificare i dati, un foglio elettronico Microsoft Excel dovrebbe essere generato come in Tabella 1 &lt;/ strong&gt;. Il numero di eventi di attraversamento deve essere contato e organizzata nella colonna corrispondente. Alcuni dei film generati non possono essere utilizzati per la quantificazione. Un film può essere omesso dalla quantificazione se c&#39;è una bolla nelle PDMS che interferisce con un progresso cellule o se le cellule sono troppo densamente imballati, causando collisioni che possono influenzare drasticamente direzionalità cellule. La divisione cellulare dovrebbe essere monitorata, in quanto questo può anche influenzare apertamente il movimento delle cellule. In genere, tipi di cellule più aderenti saranno preferenzialmente migrare verso un substrato rigido 2,4,12. Per cominciare a capire il meccanismo molecolare con cui le cellule rispondono agli stimoli meccanici nel loro ambiente, proteine ​​specifiche possono essere abbattuti con siRNA. Nel nostro esempio, circa il 70% delle cellule trattate con siRNA controllo esposto durotaxis 2A Figura. In stridente contrasto, quando cdGAP è stato abbattuto con RNAi, le cellule avevano preferenzasul fatto che la migrazione sul duro o morbido substrato figura 2A. Inoltre, le cellule knockdown cdGAP attraversato le più volte di confine, mentre le cellule trattate controllo siRNA in genere solo attraversato il confine una volta, la figura 2B. Brani rappresentativi di cellule siRNA di controllo mostrano che le cellule in generale migrano attraverso il confine una volta e preferenzialmente rimasti sulla superficie più rigida rispetto alle cellule cdGAP siRNA-trattati che non hanno dimostrato una preferenza per uno dei due rigidità e hanno attraversato il confine più volte la figura 2C. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della camera Durotaxis impostato. (A) morbido PDMS si sviluppa in ciascun pozzetto di un piatto 6 pozzetti e vetrino coprioggetti è posto sulla parte superiore delle PDMS. I PDMS si invadere sopra i lati della parte superiore del vetrino, befdi minerale che indurisce per formare un&#39;interfaccia tra i due substrati. Durotaxis è determinata notando la direzionalità delle cellule che attraversano l&#39;interfaccia PDMS / vetro. (B) contrasto di fase immagine rappresentante che mostra l&#39;interfaccia tra i PDMS molli e substrato di vetro rigida. Gli asterischi indicano controllo RNAi trattato con cellule U2OS sottoposti durotaxis. Le frecce bianche indicano l&#39;interfaccia tra i PDMS e coprioggetto di vetro e la freccia indica il bordo del vetrino di vetro sotto il PDMS. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52949/52949fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949table1.jpg" /> Tabella 1. Schema di Microsoft Excel foglio di calcolo istituito. Le colonne sono stabiliti per includere il numero di film, siRNA usato, il numero di cellule che la migrazione dalle PDMS morbideal supporto rigido vetro o viceversa, così come il numero totale di cellule analizzate. Le colonne sono anche istituito per le cellule che attraversano l&#39;interfaccia più volte e finiscono su entrambi i PDMS molli o il substrato di vetro. Se una cella migra attraverso le più volte al contorno, il numero di eventi multipli attraversamento di queste cellule viene registrato nella colonna del substrato su cui la cella era situato alla fine del film. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig2.jpg" /> Figura 2. Knockdown di cdGAP in cellule U2OS causa una perdita di durotaxis. (A), le cellule di controllo siRNA trattate migrano preferenzialmente sul substrato di vetro rigida, mentre le cellule trattate cdGAP siRNA non mostrano alcuna preferenza. Cellule trattate (B) Controllo siRNA attraversato il confine tra i PDMS e vetro una volta. Tuttavia, le cellule cdGAP RNAi trattate migrati avanti e indietro attraverso la boundary più volte. (C) Le tracce di cellule rappresentative trattati con il controllo, o cdGAP siRNA sono stati generati utilizzando il plugin di monitoraggio Manuale in ImageJ. I valori di p sono stati determinati utilizzando test t di uno studente e errori barre rappresentano l&#39;intervallo di confidenza del 95%. Riprodotto con il permesso da Wormer et al. 2014 11. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52949/52949fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.2K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Comportamento

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Biologia

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Neuroscienze

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Bioingegneria

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such as aspiration or coverslip compression have been used to mechanically stimulate whole embryos. These approaches limit experimental design as they are imprecise, require manual handling, and can process only a couple of embryos simultaneously. Microfluidic systems have great potential for automating such experimental tasks while increasing throughput and precision. This article describes a microfluidic system developed to precisely compress whole Drosophila melanogaster (fruit fly) embryos. This system features microchannels with pneumatically actuated deformable sidewalls and enables embryo alignment, immobilization, compression, and post-stimulation collection. By parallelizing these microchannels into seven lanes, steady or dynamic compression patterns can be applied to hundreds of Drosophila embryos simultaneously. Fabricating this system on a glass coverslip facilitates the simultaneous mechanical stimulation and imaging of samples with high-resolution microscopes. Moreover, the utilization of biocompatible materials, like PDMS, and the ability to flow fluid through the system make this device capable of long-term experiments with media-dependent samples. This approach also eliminates the requirement for manual mounting which mechanically stresses samples. Furthermore, the ability to quickly collect samples from the microchannels enables post-stimulation analyses, including -omics assays which require large sample numbers unattainable using traditional mechanical stimulation approaches. The geometry of this system is readily scalable to different biological systems, enabling numerous fields to benefit from the functional features described herein including high sample throughput, mechanical stimulation or immobilization, and automated alignment.

The present protocol describes the design, fabrication, and characterization of a microfluidic system capable of aligning, immobilizing, and precisely compressing hundreds of Drosophila melanogaster embryos with minimal user intervention. This system enables high-resolution imaging and recovery of samples for post-stimulation analysis and can be scaled to accommodate other multicellular biological systems.

Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis

Riepilogo

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