Gli autori desiderano ringraziare Dale Hirschkorn da sistemi Sangue Research Institute per il suo aiuto con citofluorimetro impostazioni dello strumento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratti DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

NOTA: I seguenti protocolli sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i campioni soggetti umani sono stati testati in un comitato di revisione istituzionale (IRB) Protocollo -approvato e con il consenso informato dei soggetti. 1. METODO A: Individual Metodo di rilevazione 1.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Disegnare sangue dal donatore / paziente in due tubi di vetro da 10 ml contenente 1,5 ml di ACD-A o altra soluzione adatta anticoagulante e processo immediatamente (entro 30 min max) utilizzando il seguente protocollo centrifugazione differenziale 2-step. NOTA: Questo protocollo produrrà circa 10 ml di plasma povero di piastrine (PPP) dalle combinate ~ 17 ml di sangue disegnate. Se è necessaria più o meno PPP, il numero di tubi di sangue raccolto può essere regolata di conseguenza. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.500 xg per 10 min a RTper separare il plasma dal buffy coat e globuli rossi. Trasferire 1,2 ml aliquote del surnatante del plasma di 1,5 ml provette, facendo attenzione a non disturbare gli strati inferiori contenenti il ​​buffy coat e globuli rossi. </li><li> Spin a 13.000 xg per 10 min a RT per rimuovere le piastrine e frammenti di cellule di grandi dimensioni. Trasferire con cura il PPP, lasciando dietro di sé 200 microlitri per non disturbare il pellet e aggiungere il PPP ad un nuovo tubo. </li><li> A questo punto, utilizzare PPP immediatamente per l&#39;analisi o il trasferimento in 1,0 ml aliquote di nuovi 1,5 ml provette e conservare a -80 ° C per un massimo di due anni per una successiva analisi (fare riferimento alla figura 1A per una panoramica). </li><li> Se sono necessarie EV purificate per esperimenti funzionali, di trasferimento di 6 ml di PPP per un tubo ultracentrifuga e aggiungere 28 ml di 0,2 tampone fosfato micron filtrata (PBS). Spin per 60 min a 100.000 xg a temperatura ambiente usando una un&#39;ultracentrifuga dotato di un rotore oscillante secchio. Aspirare il surnatante e risospendere EV pellasciate in 1,5 ml media. NOTA: Per la massima riproducibilità, i campioni di sangue devono essere trattati nel modo più coerente possibile dal donatore al donatore. Ogni variazione nel metodo di isolamento EV potrebbe avere un impatto significativo il numero e il tipo di veicoli elettrici rilevati. </li></ol> 1.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi NOTA: Da questo punto in poi, i passaggi spiegare un protocollo ad alta produttività per analizzare 12 campioni per 14 marcatori in 3 pannelli. Tuttavia, altre combinazioni di anticorpi possono essere usati qui; il protocollo può essere adattato per studiare altre popolazioni EV sostituendo i marcatori suggeriti per quelli di interesse. <ol><li> Rimuovere 12 campioni dal congelatore (se conservato a -80 ° C) e scongelare a 37 ° C. </li><li> Contenuti pipetta su e giù più volte per mescolare. Togliere 320 ml da ogni campione e aggiungere alla riga superiore di una piastra ben 96. NOTA: Un multi-ben pipetta larghezza regolabile è estremamente utile per questo e molti altri passi in tutto il culoay, soprattutto quando si analizzano più campioni contemporaneamente. </li></ol> 1.3) colorazione EV Campioni <ol><li> Prima della colorazione, filtrare tutti gli anticorpi (Abs) per rimuovere gli aggregati, che può causare segnali positivi. <ol><li> Anticorpi combinano per essere utilizzati in ciascuno dei 3 pannelli in 0,22 micron tubi filtranti centrifughi separati e centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità (~ 750 xg) a temperatura ambiente per 2 minuti, o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. Conservare cocktail Ab in frigorifero per un massimo di due settimane, ma ri-filtro ogni volta prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere la quantità appropriata di miscela Ab filtrato ad ogni pozzetto nella fila 2 (ad esempio, i campioni in Pannello I sono colorate con 2 ml di ogni Ab, così si aggiunge un totale di 12 ml di cocktail Ab filtrato per bene remare 2). Fare riferimento alla Figura 1B per un contorno di mappa piatto suggerito. Ripetere questi aggiuntas per le righe sotto se più pannelli vengono eseguiti (qui, aggiungere 8 ml / pozzetto del cocktail Panel II alla riga 3 e 11 ml / pozzetto del cocktail Panel III a remare 4; fare riferimento a Materiali Lista per informazioni specifiche del pannello). </li><li> Utilizzando la pipetta multicanale, miscelare i campioni PPP in riga 1 su e giù e trasferire 100 ul dai pozzi in riga 1 per i pozzi in fila 2. Mescolare su e giù. Cambia suggerimenti e ripetere, trasferendo 100 ml dalla fila 1 alla fila 3 e 4. Incubare a 4 ° C per 30 minuti. </li></ol> 1.4) lavaggio MT Campioni <ol><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti da 4 ° C e trasferimento in cella di sicurezza biologica. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 220 ml di PBS / bene alle righe 6-8 (da utilizzare per il risciacquo / lavaggio dei pozzetti contenenti macchiato PPP). </li><li> Trasferire il contenuto di ogni ben di tubi filtranti centrifughe pre-etichettati con la pipetta multicanale larghezza regolabile (per 12 campioni, con 3 pannelli di anticorpi, 12 x 3 = 36 tubi filtroessere necessario). Utilizzando gli stessi suggerimenti, togliere 200 ml di PBS dai filari di lavaggio e aggiungere ai pozzetti da cui PPP è stato appena rimosso. </li><li> Mescolare su e giù per sciacquare i pozzi e trasferire la soluzione di risciacquo per gli stessi filtri a cui il PPP è stato precedentemente aggiunto. Chiudi cime di filtri centrifughi. Cambia suggerimenti. </li><li> Ripetere questa operazione con i restanti campioni macchiati fino a quando tutti i campioni di PPP colorati sono stati trasferiti con le loro soluzioni di risciacquo ai filtri centrifughi. </li><li> Trasferire i filtri centrifughi ad una centrifuga rotore fisso e centrifugare a 850 xg per 3 min a RT. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni PPP possono richiedere un tempo più lungo per centrifugazione spostare efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Rimuovere i tubi filtranti centrifughe e tornare alla cappa di sicurezza biologica.Utilizzando la pipetta multicanale, sospendere nuovamente le cime dei filtri in 300 ml di PBS. Trasferire il contenuto in sospensione al tubi pre-etichettati per l&#39;immediata analisi FCM. NOTA: E &#39;molto importante mantenere la forza e il numero di depressioni pipetta stantuffo coerenti tra campioni per evitare variazioni campione a campione. Questo dovrebbe idealmente essere fatto utilizzando una pipetta elettronico che è stato programmato per pipettare su e giù un volume specifico (ad esempio, 280 microlitri) un numero esatto di volte (ad esempio, 8 volte) per ogni campione. </li></ol> 1.5) Citometro Setup <ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione di preTubi -labeled (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. </li><li> Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il citofluorimetro software fornito con lo strumento, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, e regolare le tensioni di parametri fluorescenti di nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare &quot;Experiment&quot;, scheda e selezionare &quot;compensazione&quot;, quindi selezionare &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li&gt; Impostare la dispersione in avanti (FSC) e side scatter (SSC) parametri di tensione per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ciascuna. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di un tubo di 0,22 micron filtrata PBS, regolare le tensioni FSC e SSC per i valori più alti che escludono la maggior parte del rumore di fondo (cioè, appena sotto la soglia di tensione a cui tasso di eventi supera 5 eventi / sec). </li><li> Successivamente, eseguire una provetta contenente 0,2 micron - 1,0 micron perline, diluito in PBS, se necessario. In un FCS e SSC plot, disegnare un cancello intorno popolazione tallone per acquisire gli eventi tra 0,2 micron e 1,0 micron. In alternativa, in un istogramma SSC-H, disegnare un cancello per includere tutti gli eventi più piccoli rispetto ai 1,0 micron perline. </li><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min). Usando il tubo perline (o altro tubo contenente una concentrazione nota di perline) regolare il selettore portata sul citometro fino alla vigiliatasso nt raggiunge circa 200 eventi / sec. Leggi tutte le provette dei campioni alla stessa velocità di flusso e utilizzare la stessa concentrazione tallone in esperimenti futuri per garantire che i flussi restano coerenti tra le esecuzioni. </li><li> Eseguire un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno diluito in PBS. Acquisire 5.000 eventi. Registrare i valori di intensità media per FSC, SSC, e ciascun canale di colore. Utilizzare questi valori per regolare tensioni in esperimenti futuri per garantire che intensità di fluorescenza restano coerenti tra esperimenti. </li></ol> 1.6) lettura del campione <ol><li> Impostare la portata del citometro a &quot;Lo&quot; (circa 8-12 ml / min) ed eseguire ogni campione per esattamente 1 o 2 minuti. </li><li> Dopo la prima lettura, aggiungere 20 ml di 10% NP-40 per ciascun campione, pipetta su e giù, e rileggere per la stessa quantità di tempo (1 o 2 min) per consentire la sottrazione di eventi positivi rilevati in il campione lisato su un lasso di tempo uguali. NOTA: E &#39;estremamente important che i campioni essere miscelati utilizzando una pipetta piuttosto che un vortice. Nella nostra esperienza, vortex può provocare auto-aggregazione di alcuni anticorpi, portando a eventi positivi-EV imitando. </li><li> Una volta che tutti i campioni sono stati letti, esportare tutti i file .fcs in un file separato da utilizzare per ulteriori analisi utilizzando il software di analisi FCM. </li></ol> 1.7) Analisi dei dati <ol><li> Aprire il software di analisi FCM. Importare tutti i file .fcs in un nuovo file esperimento. </li><li> Aprire il perline solo tubo. Nel FSC-A vs SSC-A plot, disegnare un cancello intorno a tutte le perle di dimensioni tra 0,2 micron e 1,0 micron. Questa è la porta EV. Trascinate da aggiungere a tutti i campioni. </li><li> Utilizzando i campioni lisati come controlli negativi, elaborare porte sul bordo della fluorescenza di fondo in ciascun canale fluorescenza utilizzato. Trascinare cancelli fluorescenti nella gate EV di ogni campione non lisato corrispondente. NOTA: A questo punto è anche utile esaminare dual fluorescenti trame bi-parametri. Forme Rocket inil quadrante a doppio positivo (vedi figura 8), in particolare se i marcatori sono noti a risiedere in tipi di cellule indipendenti, possono essere indicativi di artefatto da aggregazione o altri eventi-vescicole imitando. </li><li> Per ciascun marcatore fluorescente, sottrarre il numero di eventi nel campione lisato dal numero di eventi nel campione non lisato. Facoltativamente, dividere questo numero per il numero totale di veicoli elettrici all&#39;interno del cancello non lisati EV per ottenere valori positivi%. </li></ol> 2. METODO B: Metodo Beads 2.1) Elaborazione di Campione di sangue / isolamento dei veicoli elettrici <ol><li> Fare riferimento al metodo di lavorazione del sangue descritto nel metodo A (sezione 1.1). </li></ol> 2.2) la preparazione dei campioni per l&#39;analisi <ol><li> Se lo si desidera, frazionare PPP o EV ultracentrifugato in esosomi e microvescicole. Aggiungere 250 ml di PPP o EV ultracentrifugato a 0.22 micron filtri centrifughi e trasferimento in una centrifuga del rotore fisso e far girare a 750 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Assicurarsi che rimanga liquido sulle cime del filtro. Dopo centrifugazione, il filtro deve apparire &quot;secco&quot; senza strato fluido rimanente visibile sulla parte superiore. Sebbene improbabile, alcuni campioni possono richiedere un tempo di centrifugazione leggermente più lungo per il fluido di muoversi efficacemente attraverso il filtro. </li><li> Lavare patinati 6 micron perle di polistirene (per esempio, perle negative ABC) 2x con i media RPMI e risospendere in 2 ml. Aggiungi 6.000 perline per ogni provetta FACS. Per la provetta di controllo negativo, aggiungere 400 ml di RPMI supporto solo ai talloni. Per tutti gli altri tubi, aggiungere 200 ml di PPP o di veicoli elettrici ultracentrifugato (o loro frazioni) e 200 ml di RPMI media. </li><li> Regolare il volume finale di tutte le provette a 400 microlitri con media e incubare una notte a 4 ° C su un agitatore. </li><li> La mattina dopo, lavare perline con 2 ml di media. Aspirare il surnatante. </li><li> Blocco con 5% di siero albumina bovina (BSA) in mezzi (400 ml) per 3 ore a 4 &amp;# 176; C su un agitatore. </li><li> Lavare perline con 2 ml di media. Aspirare e risospendere pellet in 100 ml di media. </li></ol> 2.3) I campioni di colorazione EV <ol><li> Filtrare tutti gli anticorpi. Utilizzare gli stessi pannelli di anticorpi utilizzati nel metodo A, o se desiderato, creare una diversa combinazione di anticorpi finché loro fluorocromi sono compatibili tra loro. </li><li> Combinare tutti gli anticorpi da utilizzare in un unico pannello in un tubo filtro centrifugo 0,22 micron. Centrifugare utilizzando un angolo fisso centrifuga singola velocità per 2 minuti o fino a quando tutta la miscela Ab è passato attraverso il filtro e nessun liquido anticorpi rimane sulla superficie del filtro. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di cocktail di anticorpi filtrato a tutte le provette e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare perline con 2 ml di mezzi, risospendere in 400 ml di mezzi ed eseguire immediatamente (o entro il giorno stesso) sul citofluorimetro. </li></ol> 2.4) Cytometer Setup e Sample Reading<ol><li> Aprire il software FCM. Prima di sperimentare l&#39;installazione, eseguire la calibrazione dello strumento quotidiano e configurazione utilizzando perline di impostazione strumento (seguendo le istruzioni del produttore). </li><li> Se i campioni EV sono state colorate con più di un anticorpo e molteplici fluorocromi sono da misurare contemporaneamente, calcolare valori di compensazione come segue: <ol><li> Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione per i tubi pre-etichettati (1 tubo per ogni anticorpi coniugati a fluorocromi) e aggiungere la quantità raccomandata di anticorpi. Aggiungere 2 gocce di sfere di compensazione negativi a un altro tubo da utilizzare come il controllo di compensazione senza macchia. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, lavare con PBS e risospendere in 400 ml di PBS. </li><li> Utilizzando il software FCM, eseguire ogni tubo di compensazione e regolare tensioni fluorescenti per posizionare ogni picco di circa 10 4 su una scala logaritmica 5-decade. Assicurarsi che il picco di fluorescenza è più elevata (più luminoso) in un proprio canale fluorescente rispetto a tutti gli altri canali, eregolare le tensioni di parametri fluorescenti nuovo se necessario. Eseguire ogni tubo bozzetto singolarmente macchiato e catturare almeno 5.000 eventi per il tubo. </li><li> Selezionare la scheda &quot;Experiment&quot;, quindi &quot;Compensation&quot;, poi &quot;Calcola compensazione&quot; per applicare valori di compensazione per tutti i campioni. </li></ol></li><li> Cambiare la FSC e parametri di tensione SSC per accedere scala e selezionare le soglie più basse consentite dal citometro (FSC = 200 e SSC = 200) per ogni. </li><li> Campioni Run, porta sulla popolazione perline singoletto e acquisire 2.000 eventi in questa porta. File di esportazione .fcs. </li><li> Utilizzare software di analisi FCM per analizzare .fcs file. Gate perline singoletto. Calcolare l&#39;intensità geometrica fluorescenza media (MFI) per ogni fluorocromo e confrontare con la MFI del controllo negativo. </li></ol>

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M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Sono stati presentati due diversi protocolli per l&#39;isolamento, il trattamento e l&#39;analisi dei veicoli elettrici, utilizzando un rilevamento individuo o approccio basato bead-. Selezione del metodo più appropriato utilizzare non è sempre agevole e richiede una comprensione del campione in prova nonché le singole sottopopolazioni di interesse. Inoltre, la sensibilità del citometro utilizzato per l&#39;acquisizione deve essere considerato nella scelta del metodo più appropriato. Spesso non c&#39;è miglior protocollo singolo usare, piuttosto, una combinazione di metodi fornisce ulteriori informazioni su un campione di qualsiasi metodo solo. Idealmente, diversi differenti tecniche di isolamento e di rilevamento devono essere valutati in primo luogo per sviluppare un protocollo su misura che tenga conto individuale citometro prestazioni rispetto alla popolazione EV specifica fase di studio. Tecniche di isolamento alternativi comprendono ultracentrifugazione, il saccarosio frazionamento densità, immunomagnetico bseparazione ead, cromatografia, e l&#39;affinità di purificazione 12, mentre i metodi di rilevamento alternativi comprendono microscopia elettronica a scansione, microscopia elettronica a trasmissione, microscopia a forza atomica, dispersione della luce dinamica, e assorbente occidentale 8. Combinando tecniche diverse, i metodi qui presentati possono essere adattati in modo da creare protocolli più idonei per studiare varie popolazioni EV di interesse. In generale, il rilevamento individuale dei veicoli elettrici che utilizzano FCM funziona bene per l&#39;analisi dei veicoli elettrici più grandi ma perde sensibilità EV diventano più piccoli. Mentre rilevamento individuo è più consistente nel rilevare i veicoli elettrici più grandi, il rilevamento basato bead-è meno sensibile nel rilevare i veicoli elettrici più grandi e più sensibile per esosomi. Veicoli elettrici più grandi possono essere lavati facilmente tramite filtraggio post-macchia e rilevati singolarmente via FCM. EVs piccole e esosomi, d&#39;altra parte, non vengono rilevati ben singolarmente utilizzando FCM e sono molto più difficili da lavare post-colorazione. The-capture talloneprotocollo risolve entrambi questi problemi, consentendo veicoli elettrici di essere facilmente lavati e multipli EV da misurare insieme per creare segnali positivi più grandi rilevabili da FCM. Tuttavia, ci sono svantaggi associati all&#39;uso di questo metodo, come indicato nella Tabella 1. Quando si lavora con un citometro meno sensibile, la capacità di rilevamento individuo è limitata. Prima dell&#39;analisi EV, la sensibilità del citometro deve essere determinato utilizzando una miscela di formati branello vanno 0,1-1,0 micron. La mancanza di un citometro a rilevare la maggioranza di particelle inferiori a 1,0 micron comporta un impiego del protocollo basato tallone-. Marcatori altamente espresse sono facilmente rilevati utilizzando il protocollo. Popolazioni più rare sono volte più facile rilevare utilizzando il protocollo singolo rivelazione di particelle piuttosto che il protocollo di acquisizione tallone, tuttavia, questo può variare a seconda delle variabili quali: la luminosità del fluorocromo, del campione EV: branello razio, e la dimensione del EV recante il raro marcatore di superficie cellulare. Riconoscimento di più marcatori su una singola particella richiede l&#39;uso del metodo di rilevazione individuale. Il metodo basato tallone, non è in grado di rilevamento individuale EV. Pertanto, il protocollo basato bead-produrrà i dati che sono più di natura qualitativa, mentre il metodo di rilevazione individuo darà dati più quantitativi. Ulteriori tecniche di isolamento devono essere utilizzati quando sono necessarie veicoli elettrici per le applicazioni a valle. Veicoli elettrici utilizzati in saggi funzionali devono essere ultracentrifugati utilizzando il protocollo centrifugazione differenziale 3-step, dal momento che le proteine ​​del siero solubili nel plasma possono influenzare i risultati sperimentali funzionali. Per la caratterizzazione dei veicoli elettrici, tuttavia, ultracentrifugazione è raccomandato, poiché questo passo aggiunto può influire sulla qualità e quantità EV a causa delle elevate forze impartite sulle particelle 12. Il protocollo di rilevamento individuale contiene spassaggi chiave everal ottimizzate per il test ad alta velocità, tra cui: 1) la realizzazione di filtri centrifughi per la rimozione rapida ed efficace di eventi positivi causati da aggregati Ab, 2) l&#39;uso di filtri come alternativa più pratico per ultracentrifugazione o saccarosio gradiente frazionamento per il lavaggio non legato Ab da campioni EV post-colorazione, e 3) utilizzo di detersivo lisi come controllo negativo, che rivela non solo eventi positivi causati da non-veicoli elettrici, ma fornisce una buona approssimazione di fluorescenza di fondo per distinguere positivo dalle popolazioni negative per il disegno cancelli. Il protocollo di rilevamento individuo è consigliata quando un gran numero di campioni deve test in quanto può essere eseguita in un solo giorno, mentre il metodo basato tallone-richiede una notte di incubazione. I controlli negativi in ​​ogni protocollo hanno diversi vantaggi e svantaggi a seconda di quale metodo di rilevamento viene utilizzato. Uno dei vantaggi di usare la base di un tallone-ssay è che gli stessi anticorpi monoclonali possono essere utilizzati per tubi negativi e positivi e lo stesso controllo negativo possono essere utilizzati per tutti i campioni. Il metodo di rilevazione individuale, d&#39;altra parte, richiede controlli separati da leggere per ciascun campione analizzato. Il controllo negativo utilizzato dal protocollo di rilevamento individuo utilizza campioni lisate, che non richiedono l&#39;uso / consumo di ulteriori anticorpi ma richiedono che ogni tubo leggere una seconda volta dopo l&#39;aggiunta dell&#39;agente di lisi. I controlli lisati hanno il vantaggio di essere in grado di identificare la proporzione di segnale positivo che può essere attribuita ad eventi non-vescicole correlati quali immunocomplessi 21. Il saggio basato bead-non ha questa capacità todistinguish tra i segnali positivi derivanti da veri veicoli elettrici e quelli derivanti dalla non-vescicole. Limitazioni della tecnica Mentre non vi è alcun metodo standardizzato per l&#39;isolamento dei veicoli elettrici, differenzialecentrifugazione è una tecnica ampiamente utilizzata tra i ricercatori EV. Il metodo centrifugazione differenziale qui descritto è basato su protocolli comuni per isolare PPP, che tipicamente richiedono un centrifugazione iniziale tra 1.200-1.500 xg per 10-20 minuti per rimuovere le cellule, seguita da una seconda centrifugazione tra 10,000-13,000 xg per 10-30 min per rimuovere le piastrine 35. Il protocollo qui descritto utilizza una centrifugazione a 1.500 xg per 10 min seguita da una centrifugazione a 13.000 xg per 10 min. Mentre le forze superiori di 25,000-100,000 xg sono in genere tenuti a pellet PA, alcuni dei veicoli elettrici più grandi possono essere rimossi con il protocollo di centrifugazione differenziale abbiamo presentato. Fino al 90% di EVs rilevati da FCM si perdono da un&#39;ora di ultracentrifugazione a 100.000 xg (dati non mostrati). Tempi di centrifugazione più lunghi devono essere considerati, sia pure con cautela, in quanto ciò potrebbe avere un impatto negativo la composizione del campione. Se l&#39;elaborazione supplementare è necessaria fo studi di caratterizzazione, di filtrazione possono essere eseguite dopo la centrifugazione 2-step (prima colorazione) di frazionare ulteriormente i campioni in base alle dimensioni delle particelle. Simili ultra-centrifugazione, filtrazione può risultare in una perdita di fino al 50% degli eventi marker positivi e fino al 90% delle particelle totali rilevate da FCM (dati non mostrati). Mentre l&#39;aumento del rapporto segnale-rumore è di evidente vantaggio, la perdita di EVs minori rappresenta una limitazione significativa quando si considera qualsiasi metodo di lavaggio o di isolamento. Infine, l&#39;anticoagulante utilizzato (ad esempio, eparina, ACD, acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), ecc) durante la raccolta di sangue può influenzare la qualità e quantità dei contenuti EV. Mentre ACD ha dimostrato di essere un anticoagulante buona affidabile per i nostri studi, testare molteplici soluzioni si raccomanda di garantire che venga scelta l&#39;anticoagulante più adatto per l&#39;applicazione. Questo è particolarmente importante quando EVs verranno utilizzati in saggi a valledove l&#39;anticoagulante utilizzato può influenzare l&#39;esito. Per esempio, alcuni anticoagulanti (ad esempio, EDTA e eparina) sono noti per interferire con reazioni PCR, mentre altri (per esempio, teofillina, adenosina e dipiridamolo) hanno dimostrato di inibire il rilascio EV dalle piastrine 12. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. In definitiva, i migliori metodi di analisi EVs dipenderà ricerche condotte e gli strumenti a disposizione del ricercatore.

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes. EV, noto anche come microparticelle, sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici 1. Attraverso l&#39;espressione di diversi marcatori di superficie e / o il trasferimento diretto di materiale biologico, i veicoli elettrici sono in grado di alterare la funzione delle cellule riceventi di giocare sia attivare o sopprimere ruoli nella comunicazione intercellulare 2-4. Clinicamente, veicoli elettrici di derivazione piastrinica sono noti per avere una forte attività anticoagulante 5, mentre altri hanno dimostrato di contribuire a una vasta gamma di condizioni, dalla promozione del tumore metastasis 6 per la protezione contro le malattie 7. Veicoli elettrici possono essere classificati in categorie più piccole di vescicole cellulari di derivazione, come esosomi e microvescicole (MV), a seconda delle loro dimensioni e il meccanismo di generazione 8. La nomenclatura di sottopopolazioni vescicole cellule derivate continua ad essere un argomento di dibattito in corso 8,9, tuttavia, esosomi sono generalmente descritti come piccoli, 40 a 100 particelle nm derivati ​​da fusione endosomal con la membrana plasmatica, mentre MV sono più grandi da 100 a 1.000 particelle nm formate versando della membrana plasmatica 10. Qui, il termine generico &quot;EV&quot; verrà utilizzato per riferirsi a tutti i tipi di vescicole biologici extracellulari rilasciate dalle cellule. Isolamento dei veicoli elettrici da sangue intero è una procedura a più fasi e molte variabili di elaborazione diversi hanno dimostrato di influenzare il contenuto EV, tra cui temperatura di conservazione e la durata 11,12, anticoagulante / conservante usato 13 eMetodo di centrifugazione utilizzato 14. La necessità di standardizzazione di queste variabili ha portato a raccomandazioni della Società Internazionale sulla Trombosi e lavorazione del sangue e isolamento EV comitato di normalizzazione (ISTH SSC) per la corretta Emostasi scientifici e le procedure di 15,16, ma non esiste alcun consenso tra i ricercatori sul protocollo ottimale utilizzare 12. La maggior parte d&#39;accordo, tuttavia, che le variabili pre-analitiche strettamente controllate sono cruciali per dati accurati e riproducibili. Per analizzare i veicoli elettrici, i ricercatori hanno utilizzato vari metodi, tra cui microscopia elettronica a trasmissione 17, microscopia elettronica a scansione 18,19, microscopia a forza atomica, luce dinamica spargendo 20,21 e occidentale blotting 22,23. Mentre FCM è il metodo di scelta per molti ricercatori 9,24 - 26 grazie alle sue elevate capacità di throughput, l&#39;analisi dei veicoli elettrici che utilizzano FCM è statonotoriamente difficile a causa delle loro dimensioni e la mancanza di discrete popolazioni positive 27-32. Rispetto alle analisi di cellule, la piccola dimensione delle EVs risultati in 1) meno fluorescenza emessa a causa del minor numero di antigeni per particella e 2) la fattibilità limitato di post-macchia di lavaggio, che è necessaria per ridurre fluorescenza di fondo. Sfide comuni tra i ricercatori sono i segnali derivanti da aggregati di immunoglobuline 27,28 e di auto-aggregazione di anticorpi 29. Inoltre, i lunghi tempi di lavorazione e lunghe procedure di lavaggio / isolamento utilizzati da molti dei protocolli attuali 33,34 richiedono impegni di tempo più giorni per analizzare un piccolo numero di campioni, rendendoli meno che ideale per applicazioni ad alta produttività. Alcuni ricercatori rinunciano una fase di lavaggio del tutto, rendendo utilizzati tradizionalmente controlli negativi FCM, come una fluorescenza meno (FMO) e isotipi anticorpali inutile per valutare con precisione bacfluorescenza kground 30. I nostri protocolli affrontano tre problemi comuni che possono impedire la corretta analisi FCM dei veicoli elettrici: segnali derivanti da aggregati di anticorpi e altri non-vescicole, difficoltà nel rimuovere l&#39;anticorpo non legato, e la mancanza di popolazioni positive distinguibili. Le tecniche qui descritte assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e impostando cancelli in modo razionale che minimizza rilevamento di fluorescenza di fondo. Due diversi metodi di rilevamento sono presentati qui: il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato perline per catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<table><tbody><tr><td>LSR II benchtop flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)</td></tr><tr><td>FACS Diva software&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC version 6.0</td></tr><tr><td>FlowJo software&amp;nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow fluorescent particles</td><td>BD Biosciences</td><td>556298</td><td>used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Rainbow fluorescent particles&amp;nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td></tr><tr><td>Megmix-Plus SSC beads</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>used to adjust FSC and SSC&amp;nbsp; voltages to maintain&amp;nbsp; consistency&amp;nbsp; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td></tr><tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>used for compensation controls &amp;amp; negative AbC beads used for beads-based method</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>sc-281108</td><td>used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td></tr><tr><td>BD TruCOUNT Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td>used whenver absolute EV concentrations are needed</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0.22 &amp;micro;m Centrifugal Filter Units</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td></tr><tr><td>Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Facs tubes 12x75 polystrene</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reservoirs individually wrapped&amp;nbsp;</td><td>Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak pipet tips - 10 &amp;micro;l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak pipet tips -200 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Green -Pak pipet tips - 1,000 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stable Stack L300 tips presterilized</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&amp;nbsp;XLS 8 Channel LTS&amp;nbsp;Adjustable&amp;nbsp;Spacer&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96 well tissue culture plates</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (without Hepes)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAE001</td><td>media used for bead-based detection method</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 &amp;micro;m filtered</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PANEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD108 PE&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PANEL III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD66b PE&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &amp;kappa;</td><td>Biolegend</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Extracellulare vescicole (EV) sono piccoli, vescicole membrana derivata presenti nei fluidi corporei che sono altamente coinvolti nella comunicazione cellula-cellula e aiutano a regolare una vasta gamma di processi biologici. Analisi dei veicoli elettrici che utilizzano citometria a flusso (FCM) è notoriamente difficile a causa delle loro piccole dimensioni e la mancanza di popolazioni distinte positive per i marcatori di interesse. Metodi di analisi EV, mentre notevolmente migliorato nel corso dell&#39;ultimo decennio, sono ancora un work in progress. Purtroppo, non vi è alcun one-size-fits-all protocollo, e molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Presentato qui sono diverse tecniche per i veicoli elettrici di trasformazione e di due protocolli per l&#39;analisi i veicoli elettrici utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. I metodi descritti qui assisterà con eliminando gli aggregati anticorpali trovano comunemente in preparazioni commerciali, aumentando il rapporto segnale-rumore, e cancelli impostazione in un f razionaleashion che riduce al minimo il rilevamento della fluorescenza di fondo. Il primo protocollo utilizza un metodo di rilevamento individuo che è particolarmente adatto per l&#39;analisi di un elevato volume di campioni clinici, mentre il secondo protocollo utilizza un approccio basato tallone a catturare e rilevare EVs piccole e exosomes.

<html> Figura 1 illustra lo schema di elaborazione globale per l&#39;isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. Rilevazione individuale dei veicoli elettrici che utilizzano FCM funziona bene per l&#39;analisi dei veicoli elettrici più grandi, ma la maggior parte dei citometri non sono in grado di rilevare singolarmente particelle piccolo come esosomi. Un approccio basato branello-permette piccoli EVs da rilevare, però, ci sono svantaggi associati all&#39;uso di questo metodo, come indicato nella Tabella 1. Generalmente, l&#39;isolamento di EVs utilizzando ultracentrifugazione (con o senza l&#39;aggiunta di una procedura di frazionamento gradiente di saccarosio) è consigliato quando EV sono necessari per test funzionali. Ultracentrifugazione rimuove le impurità, tra cui proteine ​​del siero e di altri contaminanti solubili del plasma, che può influenzare i risultati sperimentali funzionali. Tuttavia, ultracentrifugazione richiede tempo e può alterare la quantità e la qualità 12 EV. &quot;&gt; Risultati attesi per i due test di rilevamento sono rappresentati nelle figure 2-3. Per il test di rilevamento individuale, il controllo lisato (fila in basso, figura 2) viene utilizzato per impostare cancelli per il corrispondente campione non lisato (riga in alto, figura 2). La maggior parte degli eventi dovrebbe rientrare nel cancello EV. cancelli Quadrant non devono rivelare eventi doppi positivi quando i due marcatori di confronto non si trovano normalmente nella stessa cella. Le trame biparameter destra della Figura 2 mostrano i marcatori CD108a e CD235a , che sono due marcatori globuli rossi notoriamente coesistere sulle cellule. Qui, PA, più della metà degli eventi positivi sono positivi per entrambi i marcatori, come previsto. Allo stesso modo, marcatori di superficie cellulare notoriamente risiedono sulla stessa cella dovrebbe mostrano modelli simili di doppia positività su veicoli elettrici. I grafici mostrano centro biparameter espressione EV di due marcatori che sono noti non coesistere sulle cellule. In questa analisi di CD235a (un Bloo rossoindicatore di cella d) e CD41a (un marcatore di piastrine), i veicoli elettrici mostrano distinti, popolazioni positivi distinti, che si prevede in quanto provengono da diversi tipi di cellule. Quando lisato, eventi positivi dovrebbero scomparire. In generale, tutti gli eventi positivi rimanenti dopo lisi indicano la presenza del segnale proveniente da particelle non vescicole, aggregati e / o detergenti EVs resistente. La Figura 3 mostra i risultati attesi con il metodo di rilevamento basato bead-. A differenza del metodo di rilevazione individuale, questi dati non possono / non devono essere visualizzati in bi-parametri grafici. Nelle dot plots superiori, separazione tra le popolazioni positive e negative esiste, e gli eventi appaiono in doppia quadranti positivi anche se non si trovano normalmente sugli stessi tipi di cellule a causa del fatto che entrambi i tipi di veicoli elettrici si legano ad un singola goccia. Per il metodo di rilevamento basato bead-dati sono meglio analizzati utilizzando sovrapposizioni istogramma con il controllo negativo (raffigurato sotto le trame dot). Positività is misurata con MFI di un marker (intensità media di fluorescenza) e confrontati direttamente con quella del controllo negativo. Se il campione è positivo per il marcatore in questione, la sua MFI sarà superiore al controllo negativo. Il controllo negativo per il metodo tallone è semplicemente perline bloccati con BSA (senza EV aggiunto), che sono stati colorati con gli stessi anticorpi e lavati insieme le perle EV rivestite. Un confronto dei risultati previsti utilizzando i due metodi può essere visto in Figura 4. La capacità del test di rilevamento individuo a valutare correttamente fenotipi EV si basa molto sulla corretta gating per separare gli eventi Ab-positivi fluorescenza di fondo. Pertanto, è importante scegliere un controllo negativo che più appropriatamente imita / predice fluorescenza di fondo per un dato campione. Quando EVs colorate non vengono lavati prima di leggere, comunemente usato controlli negativi (ad esempio, isotipi) non riescono a prevedere con precisione sfondo fluorescence per tutti gli indicatori (Figura 5A). In questi casi, se il lavaggio non è un&#39;opzione, campioni lisati tendono a lavorare meglio per prevedere fluorescenza di fondo. Tuttavia, quando EVs macchiati vengono lavati prima lettura (utilizzando filtrazione centrifuga, in questo caso), entrambi i controlli negativi (isotipi e campioni lisati) funzionano bene per prevedere fluorescenza di fondo di un campione (Figura 5A). Va notato, tuttavia, che mentre tutti i controlli negativi &quot;lavoro&quot; controlli lisati sono preferiti perché forniscono informazioni aggiuntive su un campione (ad esempio, la presenza di anomalie e / o aggregati detergenti-resistenti, non legati vescicole) che può portare a segnali positivi non EV e impropriamente gonfiare conta Ab. Inoltre, controlli isotipici possono talvolta essere inaffidabile, anche in campioni lavati, come mostrato in Figura 5B, in cui il campione colorato ha meno eventi positivi rispetto allo stesso campione colorato con anticorpi isotipo di controllo corrispondenti. </p&gt; Senza la rimozione completa di anticorpo non legato, trame FCM dot di alcuni marcatori EV sono quasi impossibili da interpretare, che appaiono come nuvole di particelle debolmente fluorescenti indistinguibili dallo sfondo altamente fluorescente (Figura 6, trama top). Lavaggio campioni macchiati utilizzando filtri centrifughi migliora la separazione tra sfondo e segnali marcatori positivi (Figura 6, la trama di fondo); Tuttavia, piccoli veicoli elettrici e exosomes possono essere persi attraverso i pori del filtro. L&#39;uso di un passo detersivo lisi rivela,-vescicole mimando eventi positivi complessi immuni e proteine ​​aggrega 21. Quando PPP viene analizzato utilizzando il rilevamento individuale, incontrando gli eventi positivi che non scompaiono con lisi è un evento abbastanza spesso. Questi eventi detergenti resistenti appaiono spesso segnali diagonali come sospette, altamente fluorescenti in entrambi i singoli parametri e biparameter trame (Figura7). Clinicamente, questi complessi proteici e / o immunocomplessi insolubili sono più prevalenti nei pazienti affetti da varie malattie 21, come l&#39;artrite reumatoide 28, sindrome nefrosica 19, e il lupus eritematoso sistemico 29. Pertanto, a seconda dell&#39;obiettivo della ricerca, si può desiderare di includere o rimuoverli dalla via analysis.Another segnali diagonali possono formare è vortexando campioni, in particolare dopo l&#39;aggiunta del reagente di lisi (Figura 8). I campioni devono sempre essere miscelati su e giù dalla pipetta per evitare la formazione di aggregati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig1highres.jpg" /> Figura 1: schema di elaborazione complesso, per l&#39;isolamento e la rilevazione dei veicoli elettrici utilizzando sia il metodo basato bead-o metodo di rilevamento individuale. (A) di sangue intero viene prima trasformato in PPP. Dalre, PPP può o essere ulteriormente trattato con ultracentrifugazione a cedere veicoli elettrici isolati o utilizzati così come sono nella rilevazione individuo o saggi basati tallone-. (B) Schema di suggerito map piastra per l&#39;analisi dei campioni alto rendimento con il metodo di rilevazione individuale. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52484/52484fig1large.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Risultati attesi per rilevamento individuale citometria a flusso dot plot mostrano colorazione rappresentativo di campioni EV lisati e non lisati. I valori mostrano percentuali di eventi positivi. La maggioranza degli eventi rientrano nel cancello EV. Eventi mostrati nelle trame biparameter destra sono entro i FSC / SSC cancelli EV sulla sinistra. Il campione lisato (fila in basso) viene utilizzato per impostare porte fluorescenti-based per EAch corrispondente (non lisato) del campione. Porte Quad non dovrebbero rivelare eventi doppi positivi quando i due marcatori di confronto non si trovano normalmente nella stessa cella. Qui, il CD235a biparameter e CD41a grafico mostra una netta separazione tra i veicoli elettrici che esprimono i marcatori dei globuli rossi e quelli che esprimono marcatori cellulari piastrinica. Allo stesso modo, marcatori di superficie cellulare note di risiedere nella stessa cella dovrebbero mostrare modelli simili di doppia positività su veicoli elettrici. La trama biparameter destra mostra che più della metà dei veicoli elettrici CD235a-positivi sono anche positivi per la globuli rossi (RBC) marcatore secondario, CD108a. Quando lisato, eventi positivi dovrebbero scomparire. Eventi positivi rimanenti dopo lisi indicano la presenza del segnale proveniente dalle particelle e / o aggregati non resistenti vescicole o detergenti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig3highres.jpg" /> Figura 3: Risultati attesi utilizzando il rilevamento basato bead-metodo. Citometria a flusso dot plot mostrano colorazione rappresentante dei veicoli elettrici accoppiati a perline, rispetto a perle bloccati con BSA, che serve come controllo negativo. I valori mostrano percentuali di eventi positivi. Eventi mostrati nelle trame biparameter destra sono entro i FSC / SSC perline porte a sinistra. Per il metodo di rilevamento basato su perline, i dati sono meglio analizzati utilizzando sovrapposizioni istogramma con il controllo negativo (raffigurato sotto le trame dot). Positività è misurata con MFI di un marker (intensità media di fluorescenza) e direttamente confrontata con quella del controllo negativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig4highres.jpg" /> Figura 4:. Confronto dei risultati attesi con perle contro rilevamento individuale Citometria a flusso punteggiano grafici mostrano colorazione rappresentante dei veicoli elettrici accoppiati a perline (riga in alto), rispetto ai veicoli elettrici che analizzano con rilevamento individuale (fila in basso). Eventimostrato nella giusta biparameter trame sono nei FSC / SSC perline porte a sinistra. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig5highres.jpg" /> Figura 5:. Confronto tra diversi controlli negativi in analisi di rilevamento individuale Valori mostrano percentuali di eventi positivi. Eventi indicati sono all&#39;interno del cancello FSC / SSC EV. (A) Confronto di controlli negativi in contro non lavato lavato campioni. Isotype o controlli lisati sono stati valutati per la loro capacità di fornire adeguate indicazioni di fluorescenza di fondo tra due marcatori differenti in un campione completamente macchiato (fila in basso). Gates per ogni marcatore sono state effettuate utilizzando il campione lisato (riga in alto) e poi copiato le righe sottostanti. Lavato campioni sono stati lavati con filtrazione post-macchia. (B) Esempio di un campione colorato con il controllo isotipico avere eventi più allettanti rispetto al campione colorato with anticorpi reale. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Effetto del post-macchia lavaggio in rilevazione individuale Valori mostrano le percentuali e il numero di eventi positivi. Eventi indicati sono all&#39;interno del cancello FSC / SSC EV. Gates per ogni campione sono state effettuate utilizzando controparte di ogni campione lisato (non mostrato, fare riferimento alla figura precedente per cancello-impostazione in non lavato vs campioni lavati). Alta fluorescenza di fondo fa distinguere positivo da eventi negativi difficile (trama top). Quando lavato, tuttavia, la popolazione positiva si rivela come anticorpi fluorescenti non legati sono rimossi e la fluorescenza è diminuito (terreno basso). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig7highres.jpg" /> Figura 7: lisi detersivo conferma la presenza di non-EV signals. Eventi indicati sono all&#39;interno del cancello FSC / SCC EV. I valori mostrano percentuali di eventi positivi. Campioni EV Stained sono state lette prima (colonna di sinistra) e dopo l&#39;aggiunta di detersivo (colonna di destra) per identificare segnali positivi causati da immunocomplessi e altri eventi non-EV-correlati. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52484/52484fig8highres.jpg" /> Figura 8: vortex provoca la comparsa di segnali non EV eventi indicati sono all&#39;interno del cancello FSC / SCC EV.. I valori mostrano percentuali di eventi positivi. EV campioni macchiati sono stati letti prima (colonna di sinistra) e dopo l&#39;aggiunta di detergente (colonna di destra). Utilizzo di un vortice di mescolare campioni può provocare a EV, mimando le popolazioni diagonali per formare (riga in alto). Quando miscelato dolcemente su e giù con una pipetta, però, la formazione di queste popolazioni può essere evitato (fila in basso). Vortex non è raccomandato per la miscelazione, in quanto può causare aggregazione in alcuni campioni, leaDing a Diagonal-apparire, popolazioni positive. In generale, il numero di eventi all&#39;interno di un cancello positivo non dovrebbe aumentare dopo lisi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Rilevamento Bead-Based </td><td> Rilevazione individuale </td></tr><tr><td> EV Taglie </td><td> consigliato per &lt;100 nm solo </td><td> consigliato per&gt; 100 nm solo </td></tr><tr><td> Tempo </td><td> richiede incubazione notturna </td><td> in grado di completare in &lt;1 giorno </td></tr><tr><td> Sensibilità </td><td> individuazione di cluster </td><td> rilevamento singola particella </td></tr><tr><td> Risultati </td><td> qualitativo </td><td> quantitativo </td></tr><tr><td> Lavaggio </td><td> semplice, centrifugazione normale </td><td> richiede filtri centrifughi </td></tr><tr><td> Controllo negativo</td><td> Perline BSA rivestite </td><td> campioni lisati </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Pro e contro di entrambi i metodi di rilevamento.

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

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23.1K Views.  Blood Systems Research Institute.  Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-. 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Ricerca

Biochimica

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Immunologia e infezioni

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Biologia

Size Determination and Phenotypic Analysis of Urinary Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles, EVs, are a heterogeneous complex of lipidic membranes, secreted by any cell type, in any fluid such as urine. EVs can be of different sizes ranging from 40-100 nm in diameter such as in exosomes to 100-1000 nm in microvesicles. They can also contain different molecules that can be used as biomarkers for the prognosis and diagnosis of many diseases. Many techniques have been developed to characterize these vesicles. One of these is flow cytometry. However, there are no existing reports to show how to quantify the concentration of EVs and differentiate them by size, along with biomarker detection. This work aims to describe a procedure for the isolation, quantification, and phenotypification of urinary extracellular vesicles, uEVs, using a conventional cytometer for the analysis without any modification to its configuration. The method&#39;s limitations include staining a maximum of four different biomarkers per sample. The method is also limited by the amount of EVs available in the sample. Despite these limitations, with this protocol and its subsequent analysis, we can obtain more information on the enrichment of EVs markers and the abundance of these vesicles present in urine samples, in diseases involving kidney and brain damage.

This protocol describes a method for the isolation of urinary extracellular vesicles, uEVs, from healthy human donors and their phenotypic characterization by the size and surface marker expression using flow cytometry.

Extracellular vesicles, EVs, are a heterogeneous complex of lipidic membranes, secreted by any cell type, in any fluid such as urine. EVs can be of ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Un protocollo di citometria a flusso per comprendere i meccanismi di esportazione

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle bioactive molecules, including proteins, lipids, and nucleic acids (DNA, mRNAs, microRNAs, and other noncoding RNAs), from one cell to another, leading to phenotypic consequences in the recipient cells. Of all the various EV cargo, microRNAs (miRNAs) have garnered a great deal of attention for their role in shaping the microenvironment and in educating recipient cells because of their clear dysregulation and abundance in EVs. Additional data indicates that many miRNAs are actively loaded into EVs. Despite this clear evidence, research on the dynamics of export and mechanisms of miRNA sorting is limited. Here, we provide a protocol using flow cytometry analysis of EV-miRNA that can be used to understand the dynamics of EV-miRNA loading and identify the machinery involved in miRNA export. In this protocol, miRNAs predetermined to be enriched in EVs and depleted from donor cells are conjugated to a fluorophore and transfected into the donor cells. The fluorescently tagged miRNAs are then verified for loading into EVs and depletion from cells using qRT-PCR. As both a transfection control and a tool for gating the transfected population of cells, a fluorescently labeled cellular RNA (cell-retained and EV-depleted) is included. Cells transfected with both the EV-miRNA and cell-retained-miRNA are evaluated for fluorescent signals over the course of 72 h. The fluorescence signal intensity specific for the EV-miRNAs diminishes rapidly compared to the cell-retained miRNA. Using this straightforward protocol, one could now assess the dynamics of miRNA loading and identify various factors responsible for loading miRNAs into EVs.

Autore in primo piano: Esplorazione dei meccanismi di caricamento dei microRNA nelle vescicole extracellulari nella progressione del cancro 

Here, we describe a straightforward protocol that enables in vitro assessment of the abundance of fluorescently labeled microRNAs to study the dynamics of microRNA packaging and export into extracellular vesicles (EVs).

Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

Tecniche per l'Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

Riepilogo

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Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

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Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso

Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso

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