Name: validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft nirf-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla scuola di specializzazione &#39;infiammazione e rigenerazione&#39; del Centro di Ricerca in collaborazione 841 della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), dal Centro di Ricerca in collaborazione 877 della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , dalla Fondazione Otto Werner (Peter Bannas), dalla Fondazione Wilhelm Sander (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin TREPEL, Friedrich Haag e Friedrich Koch-Nolte). Ringraziamo l&#39;Università Cancer Center Hamburg (UCCH) In Vivo Optical Imaging Nucleo Struttura e personale a UKE per la consultazione e il loro servizio di alta qualità. Il Fondo Nucleo è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Deutsche Krebshilfe (German Cancer Aid).

NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida internazionali per l&#39;uso etico degli animali e sono stati approvati dalla commissione benessere degli animali locale della University Medical Center, Amburgo. 1. Preparazione delle cellule tumorali, topi e anticorpi costrutti <ol><li> Preparazione di cellule di linfoma e la suddivisione in aliquote di Basement Matrix (Matrigel). <ol><li> Il giorno prima iniezione di cellule tumorali ha messo una scatola sterilizzato punta (1.000 suggerimenti microlitri) e la pipetta appropriata -20 ° C freezer. </li><li> Scongelare il flacone con la matrice interrato sul ghiaccio nel 4 ° C frigo O / N. </li><li> Il giorno di iniezione riempire un secchio di ghiaccio e posizionare la matrice seminterrato con pipetta, punte, e 1 ml siringhe con 30 aghi G su ghiaccio. </li><li> Cellule di linfoma Aliquota in un volume di 100 ml di RPMI medie provette da 1,5 ml microcentrifuga e mescolare accuratamente con 100 ml di matrice seminterrato. Elaborare in pre-raffreddamentosiringhe e mettere in ghiaccio fino iniezione. NOTA: Utilizzare buona tecnica sterile e per lavorare sul ghiaccio tutto il tempo per evitare l&#39;intasamento della matrice seminterrato. </li></ol></li><li> Mice Preparazione <ol><li> Utilizzare 8-10 settimana vecchio atimici topi nudi (NMRI- Foxn1 n u). </li><li> Per ridurre autofluorescenza dell&#39;intestino mantenere topi su una dieta priva di erba medica per 1 settimana prima di imaging in vivo. </li><li> Per l&#39;iniezione di linfoma cellule anestetizzare topi di effettuare con il 2% isoflurano in una camera di induzione. Mantenere 1-2% isoflurano per la durata della procedura usando un collettore di isofluorano. </li><li> Iniettare cellule di linfoma per via sottocutanea nei fianchi spalla. Per confronto diretto intraindividuale iniettare cellule antigene-positivi e antigene-negativi sul lato destro e sinistro, rispettivamente. <ol><li> Utilizzare il pollice e l&#39;indice per pizzicare la pelle del mouse e staccarlo dal corpo del mouse. Iniettare lentamente e in modo uniforme inil sacchetto creato dalle dita, creando un singolo gruppo di cellule sotto la pelle. La matrice seminterrato aiuta a mantenere le cellule iniettate in luogo. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di anticorpi costrutti <ol><li> Etichetta anticorpi monoclonali e nanobodies dominio singolo con un kit di etichettatura proteine ​​disponibili in commercio per il colorante fluorescente AlexaFluor-680 (AF680) (lunghezza d&#39;onda di eccitazione = 679 nm, emissione d&#39;onda = 702 nm), secondo le istruzioni del produttore. Calcolare il numero di coloranti per nanobody e anticorpi convenzionali che utilizzano coefficienti di estinzione molare di 15.720 mol -1 cm -1 e 203.000 mol -1 cm -1, rispettivamente. Valutare la purezza di costrutti anticorpali mediante SDS-PAGE dimensioni frazionamento e Coomassie brillante macchia blu. </li><li> Assicurare la specificità dei coniugati marcati conducendo una serie di esperimenti in vitro prima degli studi reali di imaging. Testare la specificità di un marcatotibody costruisce in vitro attraverso studi di blocco e isotipo aspecifica controlla 8,20. NOTA: In fase 1.2.4 il numero di cellule di cellule antigene-negativi e antigene-positivi (o di diverse linee di cellule) può essere adattato in base alle dinamiche di crescita. Per questi esperimenti, cellule positive 0,5x10 6 DC27.10 ARTC2 negativo e 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 sono stati utilizzati per ottenere i tumori di dimensioni simili. In fase 1.3.1 il processo di etichettatura e di etichettatura efficacia di sonde di anticorpi con fluorofori può differire dal kit etichettatura utilizzata. </li></ol></li></ol> 2. In Vivo Imaging <ol><li> Dopo 7-9 giorni, quando i tumori raggiungono ~ 8 mm di diametro, iniettare 50 mg di AlexaFluor680 etichettati costrutti anticorpali in un volume di 200 microlitri di soluzione salina per via endovenosa nella vena della coda del topo (mAb-AF680: 50 mg con 2 coloranti / molecola ≈ ~ 4 ^ 14 fluorocromi ≈ ~ 0,8 mcg fluorocromi; Nanobody-AF680: 50 μg con 0,3 coloranti / molecola ≈ ~ 5.6 ^ 14 fluorocromi ≈ ~ 1.1 mg fluorocromi). </li><li> Inizializzare il sistema di imaging e anestetizzare topi di effettuare con 3% isoflurano utilizzando un sistema di anestesia XGI-8 nella camera di induzione prima imaging. Mantenere 1-2% isoflurano per la durata della procedura di imaging utilizzando il collettore isoflurano alloggiata nella camera di imaging. <ol><li> Posizione topi sul palco di imaging riscaldata con tumori diretti verso la macchina fotografica. Monitorare la corretta anestesia pizzicando la punta o la coda dell&#39;animale; qualsiasi reazione dell&#39;animale indica che l&#39;anestesia è troppo leggero. </li><li> Monitorare il tasso di respirazione; l&#39;anestesia è troppo chiara, se il tasso di respirazione aumenta e troppo in profondità, se il tasso di respirazione è diminuita, profonda o irregolare. Proteggere cornee di animali con un unguento occhio per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li></ol></li><li> Scegli set di filtri fluorescenti di 615-665 nm per l&#39;eccitazione, 695-770 nm per emission, e 580-610 nm di eccitazione per sottrazione dello sfondo, con una dimensione di 51 2x 512 matrice di pixel. Impostare il tempo di esposizione per l&#39;auto, pixel binning medio e F / Stop per 2. NOTA: i tempi di esposizione più brevi consentono frame rate più veloci; tempi di esposizione più lunghi garantiscono una maggiore sensibilità. Binning controlla la dimensione dei pixel della fotocamera CCD. Aumentando il binning aumenta la dimensione dei pixel, la sensibilità, e frame rate, ma riduce la risoluzione spaziale. F / Stop imposta la dimensione dell&#39;apertura della lente della fotocamera. La dimensione di apertura controlla la quantità di luce rilevata e la profondità di field.Note che le impostazioni possono differire a seconda del dispositivo e sperimentale set up di imaging. Consultare il manuale del produttore per ottenere risultati ottimali. <ol><li> Nel software di imaging tempo di esposizione ottimizzare, F / arresto e pixel binning basano sul livello di espressione della linea cellulare. Modificare queste impostazioni in qualsiasi momento durante un esperimento senza impattare il risultato quantitativo. In alternativa, lasciare che il software di imaging Wizard determinare automaticamentei parametri. </li></ol></li><li> Topi immagine prima iniezione e 6 ore dopo l&#39;iniezione di costrutti anticorpali. NOTA: L&#39;efficacia etichettatura può influenzare la dose richiesta necessaria per ottenere risultati ottimali di imaging. Pertanto, la quantità di richieste anticorpi costrutto per ottenere risultati ottimali di imaging deve essere determinato empiricamente. Essa può variare a seconda efficacia etichettatura e dimensioni del costrutto nonché il modello di tumore e l&#39;espressione target-antigene. </li></ol> 3. Raccolta e preparazione dei Tumori <ol><li> Riempire un secchio di ghiaccio e mettere 4%, paraformaldeide (PFA) tampone fosfato salino (PBS) / inibitore della proteasi (AEBSF) e PBS / 0,2% di albumina sierica bovina (BSA) sul ghiaccio. </li><li> Una volta che la sessione di imaging è terminata, aumentare la concentrazione di isoflurano al 4%. Dopo animale cessa la respirazione, rimuoverlo dalla fase di imaging ed eseguire dislocazione cervicale. </li><li> Montare il mouse su un blocco di polistirolo e spruzzare con il 70% di etanolo. </li><li> Usa forbices e pinze per tagliare la pelle esterna e tirare di nuovo con attenzione per esporre i tumori. Rimuovere i tumori con bisturi per garantire tessuto tumorale rimane intatto. </li><li> Tumori tagliato a metà con un bisturi. Inserire una metà in un tubo di raccolta con PBS / AEBSF per FACS analisi e l&#39;altra metà in un tubo da 50 ml con 4% PFA per immunoistochimica. </li><li> Preparazione per immunoistochimica <ol><li> Mantenere tumori in 4% PFA in frigorifero a 4 ° C per 24 ore. Trasferire tumori ad un tubo con PBS / 30% di saccarosio e conservare in frigorifero a 4 ° C fino a quando i lavelli tumorali al fondo della provetta. </li><li> Tagliare i tumori in pezzi adeguati per le cryomolds. Mettete i tumori in cryomolds e riempire con il composto ottobre in modo che i tumori sono coperti. </li><li> Mettere gli stampi in ghiaccio secco e attendere fino a quando il composto è completamente ghiacciato. Trasferimento tumori congelati a -80 ° C freezer e conservare per immunoistochimica. </li><li> Cut tumori congelato in sezioni di 8 micron con un microtomo. Utilizzare standard di immunoistochimicaprotocollo chimica alla macchia con l&#39;anticorpo contro CD31-AF488 di visualizzare i vasi sanguigni e diamidino-fenilindolo (DAPI) per visualizzare nuclei. NOTA: le sezioni tumorali sono molto sensibili alla luce in quanto già contengono anticorpi fluorescente. Minimizzare l&#39;esposizione alla luce il più possibile. </li></ol></li><li> Preparazione per l&#39;analisi FACS <ol><li> Inserire capsula di Petri su ghiaccio e rimuovere lo stantuffo di una siringa da 2,0 ml. Mettere il tumore del filtro cellulare e tagliata delicatamente in 3-4 pezzi con un bisturi. Versare l&#39;iniziale PBS nella capsula di Petri e utilizzare l&#39;estremità piatta del pistone per schiacciare il tumore all&#39;interno del filtro delle cellule. </li><li> Lavare il filtro cella con l&#39;iniziale PBS a lavare tutte le cellule con una pipetta 10 ml. Trasferimento sospensione cellulare in una nuova provetta e centrifugare a 500 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS / 0,2% di BSA. Contare le celle. </li><li> Aliquota 1-5 x 10 6 cellule di linfoma in una provetta 5 ml FACS. Di nuovo le cellule Spin (500xg), scartare il surnatante e risospendere in 100 l PBS / 0,2% BSA. </li><li> Facoltativamente, blocco FcR usando un anti-CD16 / CD32-mAb (FcgR3 / 2) che si lega al FcγR in ghiaccio per 10 min. Lavare le cellule una volta con PBS / 0,2% BSA. </li><li> Aggiungi anti-CD45-mAb a discriminare i leucociti da altre cellule. Incubare per 20 min in ghiaccio al buio, seguito da due lavaggi con PBS / BSA 0,2%. </li><li> Poco prima macchia analisi FACS con ioduro di propidio per 15 min in ghiaccio per discernere le cellule morte, seguito da due lavaggi con PBS pianura. Risospendere in 150 ml per l&#39;analisi FACS. NOTA: In fase 3.7.4 e 3.7.5 passo altri anticorpi possono essere utilizzati a seconda dell&#39;entità del tumore. </li></ol></li></ol> 4. Analisi FACS <ol><li> Utilizzare una serie di strumenti di gating per porta la popolazione di interesse in forma di grande dispersione, la discriminazione doppietto, l&#39;esclusione di cellule morte, gating per le cellule CD45 positive, e gating per le cellule antigene positive. <ol><li> Dapprima, porta fuori celluledetriti in un forward scatter (FSC-A) rispetto side scatter (SSC-A) con una trama a due parametri. Doppiette cella successiva scartare. Infine, porta fuori non CD45-antigene-positivi (CD45) e morti / morire le cellule (LD - live / dead-macchia). </li></ol></li><li> Campioni registrare usando lo stesso modello per tutti gli esperimenti. NOTA: fare riferimento al protocollo del produttore per un parere tecnico per quanto riguarda l&#39;uso di hardware e software analitico. </li></ol> 5. Analisi microscopica <ol><li> Analizzare criosezioni tumorali colorate utilizzando un microscopio confocale con una lente immersione in olio (obiettivo 40X). Utilizzare un He-Neon 633 nm laser eccitazione AF680, un laser ad argon per AF488, e un 405-diodo per DAPI. </li><li> Elaborare i dati di immagine raw tramite un software compatibile con il microscopio. Eseguire background-correzione e filtrare, se necessario, il rumore. Eseguire regolazioni dell&#39;immagine aggiuntivi come sezionamento, ritaglio e di luminosità e contrasto adeguamenti. <ol><li> Infine generate un&#39;unica immagine composita sovrapposizione da tutti i canali di rilevamento. Regolare la luminosità e il contrasto dei singoli strati. Le immagini composite mostreranno localizzazione delle cellule (DAPI-macchia, blu), la distribuzione di costrutti anticorpo marcato (AF680-macchia, rosso) e vasi sanguigni (AF488-macchia, verde). </li></ol></li></ol> 6. In Analysis Vivo Imaging <ol><li> Aprire i file di immagine nel software di imaging e creano un&#39;immagine sovrapposizione combinando dati di immagine fotografia con dati di immagine di fluorescenza. Ottimizzare la visualizzazione delle immagini, eliminando segnale di fondo autofluorescenza tessuto dal segnale fluorescente specifico. Questo può essere fatto sottraendo l&#39;immagine acquisita con un filtro sfondo impostato dal immagine acquisita con il filtro specifico per impostare il tracciante. </li><li> Disegnare identici regioni misurazione circolari di interesse (ROI) attorno al tumore antigene positivo e il tumore antigene-negativi. Per determinare sfondo intensità del segnale, posizionare una ROI circolarein un&#39;area dell&#39;animale dove dovrebbe essere bassa segnale di fluorescenza (ad esempio, hind gamba). <ol><li> Utilizzare gli stessi ROI per tutti gli animali in tutti i tempi. Per il posizionamento, utilizzare le immagini in bianco e nero fotografico per identificare margini del tumore. </li></ol></li><li> Visualizzare dati ROI in una tabella di misura. Utilizzare i dati media efficienza radiante, che permette un confronto più quantitativa di segnali fluorescenti per ulteriori analisi statistiche. <ol><li> Display e confrontare i dati, come intensità di segnale assoluti o calcolare il rapporto segnale-background utilizzando i dati ROI misurati dal tessuto mirato e il tessuto di fondo. Calcolare il rapporto tumorale-a-background dividendo il valore di assorbimento del tumore dal valore di fondo determinata dal dell&#39;arto posteriore. </li><li> Come controllo, analizzare anche i tumori antigene-negativi e antigene-positivi negli stessi animali e gli animali iniettati con controlli isotipici etichettati per valutare la specificità dei segnali in vivo. </li></ol></li&gt; </ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice.">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li><li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography.">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li></ol>

Friedrich Koch-Nolte and Friedrich Haag receive a share of antibody and protein sales via MediGate GmbH, a wholly owned subsidiary of the University Medical Center Hamburg-Eppendorf.

Abbiamo usato vicino infrarosso fluoroforo nanobodies etichettati e anticorpi monoclonali convenzionali diretti contro lo stesso bersaglio in cellule di linfoma per un confronto multimodale di in vivo e ex vivo analisi. Abbiamo dimostrato che nanobodies sono adatti come strumenti diagnostici per un rapido e specifico il rilevamento in vivo di linfomi. In vivo, s + 16a 680 ammessi un rilevamento veloce e più preciso di xenotrapianti ARTC2-positivo. Oltre alle diverse cinetiche per un&#39;ottima visualizzazione del tumore in vivo, il grave inconveniente di Nika102 680 è stato il segnale alto aspecifico da tumori ARTC2-negativi e segnali di fondo non specifici. Ex vivo citometria a flusso analisi di cellule disperse da tumori sezionati non hanno mostrato il legame non specifico di cellule del linfoma ARTC2 negativi di iniettate AF680-coniugati. Ex vivo fluorescenza rivelato forte e quasi homogencolorazione UO di cellule nelle sezioni tumorali ART2C-positivo in caso di nanobody s + 16a, confermando che il nanobody era in grado di raggiungere le zone ancora isolate all&#39;interno del tumore dopo 6 h. Al contrario, l&#39;anticorpo monoclonale mostrava colorazione debole e disomogenea delle cellule nei tumori ARTC2-positive dopo 6 ore. Risultati di imaging migliori con l&#39;anticorpo convenzionale può essere raggiunto dopo 24 ore o 48 ore (dati non riportati). Per eseguire un confronto approfondito di due costrutti di dimensioni diverse, imaging a tempi diversi (seriale-Imaging) deve essere eseguita per identificare il punto di tempo di imaging ottimale per ciascun costrutto. Come altri studi precedenti, i risultati qui riportati sottolineano che in vivo imaging molecolare con nanobodies etichettati consente un rapido e specifico in giornata immagine del tumore con rapporti 12-15,17-19 alta tumore-to-sfondo. Al contrario, gli anticorpi convenzionali producono bassi rapporti tumore-to-sfondo e segnali non specifici di lottatumori gen-negativi precoce dopo l&#39;iniezione a causa della loro liquidazione lenta dal corpo. Per ottenere risultati di imaging ottimali con anticorpi convenzionali, tempo di imaging fa 24 ore o anche 48 ore dopo l&#39;iniezione sono comunemente necessari. Questi risultati sono in accordo con precedenti studi che hanno suggerito che gli anticorpi convenzionali con comprovata beneficio terapeutico hanno un&#39;utilità limitata in imaging molecolare 17,19,26. Pertanto anticorpi convenzionali potrebbero essere piuttosto adatto per scopi terapeutici a causa della loro lunga emivita plasmatica mentre nanobodies sono piuttosto adatti per scopi di imaging a causa della loro rapida eliminazione dalla circolazione. Tali differenze sono dovute al fatto che una eventuale eccedenza dei nanobodies piccoli (15-17 kDa) viene eliminato rapidamente tramite eliminazione renale, mentre l&#39;eccesso di anticorpi convenzionali grandi (150 kDa) viene mantenuta in circolazione. Così il grande vantaggio di nanobodies per l&#39;imaging molecolare è il segnale di fondo basso alle brevi intervalli di tempo di imaging regardless della dose iniettata. Questo permette di imaging stesso giorno e potrebbe essere traslabile alla clinica impostazione. Al contrario, gli anticorpi convenzionali devono essere titolato esattamente per minimizzare segnali di fondo non specifici, pur mantenendo abbastanza segnale specifico dal tessuto bersaglio (dati non pubblicati). Uno dei limiti della tecnica NIRF imaging in vivo è la profondità di penetrazione bassa che consente generalmente soltanto imaging sottocutanea, ma non di modelli tumorali ortotopiche. Tuttavia, questa limitazione potrebbe essere superata in un ambiente sperimentale dalle tecniche foto-acustica tomografiche sviluppati di recente che permettono al corpo intero per immagini di topi 27 vivente. Un&#39;altra limitazione della tecnica NIRF imaging è la valutazione della dose tessuti rispetto all&#39;imaging radionuclide mediata. Tuttavia, le nanobodies possono essere radiomarcato per la tomografia ad emissione di positroni (PET) di modelli di xenotrapianto e la valutazione quantitativa precisa ditracciante biodistribuzione. Infatti, i nostri risultati NIRF imaging sono secondo un recente studio che ha confrontato nanobodies e anticorpi convenzionali per l&#39;imaging PET. Gli autori hanno anche giunti alla conclusione che nanobodies permettono di imaging in giornata con rapporti di 15 high tumore-to-sfondo. Tuttavia, solo l&#39;etichettatura dei costrutti anticorpali con il colorante fluorescente vicino infrarosso AF680 ci ha permesso il completo in vitro, in vivo e ex vivo il confronto del vicino infrarosso imaging di fluorescenza mediante citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, e NIRF-imaging. Per questo motivo, e perché è nonradioactive, altamente sensibile, poco costoso, e utilizza relativamente facile da produrre sonde mirate, sosteniamo l&#39;uso della tecnica NIRF imaging per la valutazione di nuovi costrutti anticorpali in imaging molecolare preclinico.

Nella presente relazione, si descrive l&#39;implementazione del vicino infrarosso fluoroforo sonde marcate per la convalida di vivo esperimenti di imaging xenotrapianto in utilizzando ex vivo citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza dei tumori xenotrapianto sezionati. Confrontiamo un singolo nanobody domini (s + 16a, 17 kDa) 1 ed un anticorpo monoclonale (Nika102, 150 kDa) 2,3 indirizzate allo stesso antigene bersaglio per specifici in vivo vicino infrarosso fluorescenza in un modello linfoma xenotrapianto. L&#39;antigene bersaglio ADP-ribosyltransferase ARTC2.2 è espresso come GPI-ancorata superficie cellulare ecto-enzima dalle cellule del linfoma 4-9. Nanobodies derivati ​​da camelid heavy-catena-only anticorpi sono le più piccole antigene vincolante frammenti disponibili 10,11. Con soli ~ 15 kDa, questi piccoli frammenti di anticorpi sono solubili, molto stabile e sono per via renale cancellati dalla circolazione 8,10. Tueste proprietà li rendono particolarmente adatti per specifica e efficacemente mirati antigeni tumorali in vivo 12-20. Obiettivi comuni di antigene nanobodies disponibili sono il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR1 o HER-1), fattore di crescita epidermico umano di tipo 2 (HER-2 o CD340), l&#39;antigene carcinoembrionario (CEA) e l&#39;adesione delle cellule vascolari molecola-1 (VCAM-1 ) 21. Coniugati nanobody sono strumenti promettenti per l&#39;immunoterapia del cancro e il trattamento delle malattie infiammatorie 22. Recenti studi hanno dimostrato che nanobodies consentono maggiore tumorale-a-background (T / B) -ratios di anticorpi convenzionali nelle applicazioni di imaging molecolare in vivo 8,17,19. Questo si spiega principalmente con la penetrazione relativamente povero e lento del tessuto di anticorpi convenzionali, lenta clearance dalla circolazione, e la conservazione a lungo nei tessuti non mirati 23. Inoltre, l&#39;eccesso di anticorpi convenzionali porta a non specifico i accumulon bersaglio tumori antigene-negativi causati dalla permeabilità potenziata e ritenzione (EPR) Effetto 24,25. Ciò significa che dosi elevate di anticorpi convenzionali possono aumentare non solo segnali specifici, ma anche segnali aspecifici, riducendo così il rapporto massimo ottenibile tumorale-a-background. Al contrario, aumentando la dose di nanobodies aumenta i segnali di tumori antigene-positiva, ma non di tessuto normale o tumori antigene-negativi (dati non pubblicati). Oltre il confronto delle nanobodies e anticorpi convenzionali, descriviamo una valutazione intraindividuale di xenotrapianti antigene-positivi che quelli negativi nella stessa topi per confronto diretto dei segnali specifici e non specifici per effetto EPR. Le sonde coniugati fluoroforo vicino infrarosso ci hanno permesso di sfruttare una singola sonda in vivo e ex vivo con vicino infrarosso imaging di fluorescenza, citometria a flusso, e microscopia a fluorescenza. Applicando i nostri protocolli permette di nonottimizzazione radioattive, altamente sensibile, e poco costoso di vivo esperimenti di imaging molecolare in come la valutazione di nuovi costrutti anticorpali per tumore specifico di targeting. Lo scopo di questo studio esercitazione è quello di evidenziare l&#39;uso di NIRF imaging per la valutazione di nuovi costrutti anticorpali in imaging molecolare preclinico. In questo protocollo, tutti gli esperimenti sono stati effettuati con un sistema NIRF-Imaging piccoli animali, una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) citofluorimetro, e un microscopio confocale.

<table><tbody><tr><td>AF680 protein labelling kit</td><td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/CD32-antibody</td><td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td>labeled with secondary antibody with AF488</td></tr><tr><td>Anti-CD45-antibody V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision LE software</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Alternative product can be used</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Alternative product can be used</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Leica SP5 with the following lasers: He-Neon for AF680, Argon Laser for AF488, and a 405-Diode for DAPI</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molcular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10 cells&amp;nbsp;</td><td>laboratory specific</td><td></td><td>Other cells with different surface targets can be used</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>Flourescence mircoscope</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200 with Filter Set #32 for AF680: 000000-1031-354</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Alternative in vivo imaging system can be used</td></tr><tr><td>Leica LAS software</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Software specific to microscope used</td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Software specific to imaging system used</td></tr><tr><td>Needles 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Alternative product can be used</td></tr><tr><td>Nika102-antibody AF680</td><td>laboratory specific</td><td></td><td>Other antibodies against different surface targets can be used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Potential hazards: carcinogenic, can irritate the eyes and skin, contact may cause drying of the skin and/or allergic dermatitis</td></tr><tr><td>s+16a-nanobody AF680</td><td>laboratory specific</td><td></td><td>Other antibodies against different surface targets can be used</td></tr><tr><td>Syringes 1 ml</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>Alternative product can be used</td></tr></tbody></table>

validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft nirf-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Sonde fluorescente consentono la combinazione di diverse tecniche NIRF-imaging (Figura 1A). Abbiamo puntato a fare in vivo NIRF imaging, citometria a flusso, e microscopia a fluorescenza in sequenza in modo da confrontare nanobodies fluorescente e anticorpi monoclonali per specifici imaging in vivo (Figura 1B). I topi sono stati iniettati con 50 mg di nanobody e anticorpo monoclonale per valutare la specificità dei costrutti fluorescente per l&#39;imaging in vivo. I risultati hanno mostrato etichettatura specifica dei tumori antigene-positivi sia con nanobody e anticorpo monoclonale a 6 ore dopo l&#39;iniezione (Figura 2). ROI analisi dei tumori antigene-positiva ha mostrato una molto più alto rapporto T / B di ~ 12 per l&#39;nanobody rispetto a ~ 6 per l&#39;anticorpo monoclonale. Inoltre, il nanobody mostrato alcun segnale aspecifico nei tumori antigene-negativi, mentre laanticorpo monoclonale ha mostrato segnali confondenti non specifici nei tumori antigene-negativi. Oltre al segnale aspecifico dei tumori negativi, l&#39;anticorpo monoclonale indotto anche segnali di fondo non specifici nell&#39;intera animali. Ciò è probabilmente dovuto ad eccessivi anticorpi liberi circolanti, che sono troppo grandi per essere escreto per via renale. Al contrario, gli animali iniettati con nanobodies hanno mostrato segnali non specifici solo nei reni a causa della eliminazione renale dei piccoli nanobodies. Citometria a flusso analisi di sospensioni cellulari tumorali ha mostrato etichettatura specifica delle cellule tumorali antigene-positivi sia con AF680-coniugati 6 ore dopo l&#39;iniezione. Il segnale di fluorescenza più forte delle cellule nanobody marcato rispetto alle cellule anticorpo marcato monoclonali riflette i risultati NIRF imaging in vivo. È importante sottolineare che le analisi di citometria a flusso rivelano che non c&#39;è etichettatura non specifica delle cellule antigene-negativa con uno dei duecostrutti (Figura 3). Microscopia a fluorescenza di criosezioni tumorali ha mostrato una etichettatura forte e quasi omogeneo di cellule antigene-positivi con il nanobody 6 ore dopo l&#39;iniezione. Al contrario, l&#39;anticorpo monoclonale ha mostrato una colorazione molto più debole e piuttosto disomogeneo (Figura 4A). Tumori antigene-negativi non mostrano colorazione 6 ore dopo l&#39;iniezione del nanobody, mentre i tumori antigene-negativi iniettato convenzionale anticorpo mostra aspecifica dispersi nello spazio interstiziale (Figura 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Figura 1: immagini Flourescence e costrutti anticorpali. (A) installazione Imaging per la valutazione di AF680-coniugati: In vivo NIRF imaging seguita mediante citometria di flusso e microscopia a fluorescenza. (B </strong&gt;) Schema di AlexaFluor680 etichettato nanobody s + 16 bis (rosso) e anticorpo monoclonale Nika102 (blu). Arancione stelle indicano i fluorocromi AlexaFluor680. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Figura 2: In vivo NIRF imaging Immagini del segnale di fluorescenza di antigene-positiva (+) e l&#39;antigene-negativa (-) tumori nei topi che sono stati iniettati con nanobody s + 16a (A) e l&#39;anticorpo monoclonale Nika102 (B). . Imaging in vivo è stata eseguita prima (0 h) e 6 ore dopo l&#39;iniezione. Intensità di segnale sono visualizzati come efficienza radiante (p / sec / cm 2 / sr) / (W / cm 2). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Figura 3:Ex vivo FACS analisi di cellula legata costrutti anticorpali da sospensioni di cellule tumorali. (A) strategia di gating per FACS analisi delle cellule tumorali. (B) istogrammi mostrano la quantità della nanobody AF680 coniugato iniettata per via endovenosa s + 16a e anticorpo Nika102 specificamente legata alle cellule tumorali in vivo. Tumori antigene-negativi vengono visualizzati come istogrammi vacanti e tumori antigene-positivi sono visualizzati come istogrammi pieni. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Figura 4:. Ex vivo microscopia a fluorescenza (A) Panoramica microscopia a fluorescenza di intere criosezioni tumore antigene-positivi 6 ore dopo l&#39;iniezione di s + 16a 680 o Nika102 680. Intensità di segnale del in vivo per via endovenosa inproiettata AF680-coniugati senza agenti secondario etichettatura sono visualizzate in rosso. Ex vivo nuclei controcolorate vengono visualizzati in blu e vasi in verde. Le linee tratteggiate indicano margini esterni di tutto il tumore. (B) Primo piano microscopia a fluorescenza di tumori antigene-positivi e antigene-negativi.

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Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validazione di Nanobody e anticorpi Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Esperimenti tumore xenotrapianto NIRF imaging nei topi mediante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria di flusso e microscopia

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

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Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

11.6K Views.  University Medical Center, Hamburg. This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past decade. However, only a small number of nanomedicines have been approved for clinical use, whereas the majority of nanomedicines under clinical development have produced disappointing results. One major obstacle to the successful clinical translation of new cancer nanomedicines is the lack of an accurate understanding of their in vivo performance. This article features a rigorous procedure to characterize the in vivo behavior of nanomedicines in tumor-bearing mice at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels via the integration of positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), radioactivity quantification methods, flow cytometry, and fluorescence microscopy. Using this approach, researchers can accurately evaluate novel nanoscale formulations in relevant mouse models of cancer. These protocols may have the ability to identify the most promising cancer nanomedicines with high translational potential or to aid in the optimization of cancer nanomedicines for future translation.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

Una procedura completa per valutare il<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestazioni del Cancro nanomedicina

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

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Ricerca sul cancro

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis remains incomplete. In vivo models are paramount for metastasis research, but require refinement. Tracking spontaneous metastasis by non-invasive in vivo imaging is now possible, but remains challenging as it requires long-time observation and high sensitivity. We describe a longitudinal combined radionuclide and fluorescence whole-body in vivo imaging approach for tracking tumor progression and spontaneous metastasis. This reporter gene methodology employs the sodium iodide symporter (NIS) fused to a fluorescent protein (FP). Cancer cells are engineered to stably express NIS-FP followed by selection based on fluorescence-activated cell sorting. Corresponding tumor models are established in mice. NIS-FP expressing cancer cells are tracked non-invasively in vivo at the whole-body level by positron emission tomography (PET) using the NIS radiotracer [18F]BF4-. PET is currently the most sensitive in vivo imaging technology available at this scale and enables reliable and absolute quantification. Current methods either rely on large cohorts of animals that are euthanized for metastasis assessment at varying time points, or rely on barely quantifiable 2D imaging. The advantages of the described method are: (i) highly sensitive non-invasive in vivo 3D PET imaging and quantification, (ii) automated PET tracer production, (iii) a significant reduction in required animal numbers due to repeat imaging options, (iv) the acquisition of paired data from subsequent imaging sessions providing better statistical data, and (v) the intrinsic option for ex vivo confirmation of cancer cells in tissues by fluorescence microscopy or cytometry. In this protocol, we describe all steps required for routine NIS-FP-afforded non-invasive in vivo cancer cell tracking using PET/CT and ex vivo confirmation of in vivo results. This protocol has applications beyond cancer research whenever in vivo localization, expansion and long-time monitoring of a cell population is of interest.

We describe a protocol for preclinical in vivo tracking of cancer metastasis. It is based on a radionuclide-fluorescence reporter combining the sodium iodide symporter, detected by non-invasive [18F]tetrafluoroborate-PET, and a fluorescent protein for streamlined ex vivo confirmation. The method is applicable for preclinical in vivo cell tracking beyond tumor biology.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Nanoparticelle virali per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Tumore

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Bioingegneria

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanofarmaco mirato al miRNA-10b oncogenico per il trattamento del carcinoma mammario metastatico

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanoparticelle di ossido di ferro per la somministrazione di terapia guidata da immagini nel glioblastoma murino

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Terapie innovative contro il cancro con nanoparticelle di ossido di ferro per il trattamento del glioblastoma

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

Validazione di Nanobody e anticorpi Based

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Una procedura completa per valutare il

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Nanoparticelle virali per

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Monitoraggio dell'accumulo di nanofarmaci nelle metastasi del carcinoma mammario murino

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma