Name: development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. computazionale identificazione di potenziali piccola molecola Tappatrici gruppi Nota: In linea di principio, una varietà di attracco o farmacofori metodi di ricerca può essere utilizzato per prevedere i potenziali gruppi di tappatura. Lo scopo principale di studi computazionali in REPLACE è quello di identificare piccole molecole che mantengono le caratteristiche e le interazioni degli aminoacidi che vengono sostituiti. <ol><li> Validazione del protocollo LigandFit attracco 14 </li></ol> Nota: In studi precedenti, il metodo di aggancio (LigandFit 15, un modulo della suite programma di modellazione molecolare, Discovery Studio 3.0) è stato validato per garantire che questo algoritmo è sufficiente a riprodurre le modalità vincolanti conosciuti Ncaps e dimostrare che i risultati ottenuti per composti sconosciuti sono predittivi 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzando la procedura seguente (1,2 - 1,5), identificare i parametri ottimali per LigandFit come segue: PLP1 itGriglia ERGIA per la generazione di posa, la riduzione al minimo di pose generati e la funzione di scoring PLP1 per l&#39;analisi di pose. </li><li> Per limitare le conformazioni ottenuti e posizionare ligandi appropriato per la formazione del legame covalente del peptide capped, impostare l&#39;azoto e azoto ammidico indolo atomi di Trp217 e Gln254 rispettivamente come filtri di interazione per legami idrogeno. </li><li> Progettazione e ancorare una biblioteca di alternative frammento nel CDK2 / ciclina A recettore (2UUE). Dare priorità potenziali gruppi di tappatura per la sintesi e il sourcing commerciale basata su PLP1 punteggio, le interazioni con i filtri di interazione e complementarità con il CBG. Le varie fasi necessarie per LigandFit aggancio sono i seguenti. </li></ol><ol start="2"><li> Preparazione del recettore sito di legame 14 <ol><li> Importare il CDK2 / ciclina A struttura cristallina (PDB id: 2UUE) in una finestra di visualizzazione nel software. Questa struttura contiene il FLIP precedentemente identificato 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazolo-3-carbossammido (3,5-DCPT) RLIF vincolato alla scanalatura ciclina (Figura 3). </li><li> Eliminare o mantenere in essere i residui RLIF (C-terminale). Quando la sequenza peptidica viene mantenuta, utilizzare il gruppo amminico N-terminale del peptide come un filtro per l&#39;interazione ligando. Dalle &quot;recettore-ligando&quot; strumenti, creare una sfera intorno alla N-3,5-cap DCPT da Mostra / Nascondi sito sfera. La sfera viene creato per definire la regione attiva nel sito di legame che accettano le interazioni ligando-recettore a verificarsi durante il collegamento. </li><li> Definire il sito di legame più lontano dalla &quot;trovare posto come volume di legante selezionato&quot; ed eliminare il legante 3,5-DCPT dalla proteina. Eseguire questo passo per definire il volume di legare nell&#39;ambito creato. </li><li> Impostare i azoto e di azoto ammide indolo atomi dei residui Trp217 e Gln254 come filtri di interazione per legami idrogeno. Impostare i filtri di interazione in modo che solo le pose che inteRACT con gli atomi di residui set sarà filtrata durante la procedura di attracco quindi preservare interazioni importanti pose ormeggiate. </li></ol></li><li> Preparazione di ligandi 14 <ol><li> Progettare una biblioteca di 100 potenziali gruppi tappatura sulla base di criteri tra cui peso molecolare inferiore a 500, la presenza di un gruppo carbossilato per legatura con il peptide troncato e inserimento di opportuni gruppi idrofobici (gruppo fenile sostituito) per van der Waals nella tasca secondaria mostrato nella Tabella 1. </li><li> Selezionare anelli eterociclici per mimare interazioni di legame peptidico idrogeno con Trp217 e sostituenti inclusi per sostituire le interazioni ione-accoppiamento delle catene laterali di base del HAKRRLIF. Ancorare la ligandi come rispettive molecole aldeide in modo che l&#39;ossigeno carbonilico può interagire con l&#39;atomo di azoto ammidico di Gln254 simile a scheletro peptidico nel peptide genitore (Tabella 1). </li><li> Prima di docre, ridurre al minimo leganti progettate per una conformazione a bassa energia e di preparare in uno stato di ionizzazione appropriato utilizzando il protocollo &quot;Preparare ligandi&quot;. Disegnare ed esportare tali limiti potenziali N nel formato di file .sdf in ChemDraw per un foglio prima di essere importato nel software. Nota: Preparare protocollo ligandi viene utilizzato per ridurre al minimo tutti i ligandi per essere agganciato ai loro stati energetici più bassi e le cariche di ionizzazione sono stati applicati agli atomi applicabili. I parametri di default vengono utilizzati per questo passaggio. </li></ol></li><li> Docking dei leganti nella ciclina A Groove 14 <ol><li> Selezionare la routine LigandFit da recettore-ligando insieme protocollo interazioni del software. Utilizzare il recettore e leganti preparati come input per questo protocollo. </li><li> Per queste corse selezionare PLP1 come rete energetica, precisano che pone sia energia ridotto al minimo e che il numero di pose generati 10. Lasciare tutti gli altri parametri ai valori di default. Nota: è LigandFitun metodo di aggancio che può identificare e generare pose di alta complementarità e potenziale affinità con il sito attivo di una proteina mediante un filtro di confronto figura basata che si combina con un Monte Carlo algoritmo di ricerca conformazionale. La griglia di energia utilizzata dal programma di espansione è il campo di forza per generare interazioni ligando-recettore e potenziali pose. PLP1 è potenziale lineare a tratti che privilegia in particolare le interazioni di legame idrogeno e dove viene assegnato il tipo di atomo di PLP per ogni non-idrogeno ligando atomo o non idrogeno recettore atomo. </li></ol></li><li> Analisi dei risultati <ol><li> Nel primo caso, il display pone nel programma visualizzatore e poi ordinare per i valori della partitura PLP1 discendente. Utilizzare funzioni di punteggio come PLP1 stimare l&#39;affinità di legame di un ligando ancorata sulla base di un legante candidato posa geometria e interazione non covalente con la struttura del recettore bersaglio. Nota: Qui, la funzione PLP1 punteggio è risultato give i migliori risultati in quanto include una stima di legami idrogeno. </li><li> Analizzare visivamente il primo 25% delle pose segnati per 1) sovrapponibilità con il gruppo di tappatura noto (con uno scarto quadratico medio relativo RMSD () valore inferiore a 2 A), 2) soddisfatta filtri di interazione e 3) la complementarità visivo con la scanalatura ciclina . E &#39;accettato in quanto un corretto ormeggiata posa (a fronte di una struttura sperimentale) ha un valore RMSD di &lt;2 Å. </li><li> Esaminate pose per complementarietà visivo, che è definita come avente riempimento efficiente della tasca di legame in un modo che è coerente con note relazioni struttura-attività. Interazione filtri sono impostati per includere restrizioni atomo che richiedono contatti intermolecolari notoriamente critica per il legame e / o sono necessari per posizionare il gruppo di potenziale capping nella geometria corretta per la formazione del legame ammidico. Tre esempi di pose attraccate di potenziali gruppi N-capping facendo legami idrogeno con interaction filtri sono mostrati in Figura 4. </li></ol></li></ol> 2. Sintesi e caratterizzazione di potenziali N -capping Gruppi <ol start="1"><li> Sintesi dei gruppi N-capping. </li><li> Per sintesi, utilizzare tutte commerciali a partire materiali, solventi e reagenti come ottenuti. Synthesize potenziali gruppi N-tappatura convenzionale chimica organica sintetica (Figura 5 12,13 per un esempio). </li><li> Eseguire cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice per reazioni monitoraggio. <ol><li> Sciogliere il materiale di partenza e la miscela di reazione (1 mg) nella fase mobile e posto sulla piastra TLC utilizzando tubi capillari. </li><li> Posizionare la piastra TLC in alla camera contenente fase mobile (acetato di etile ed esano in rapporto 35:65). Una volta che la fase mobile raggiunge il 90% della piastra TLC, rimuovere e aria asciugare la piastra. </li><li> Utilizzare la luce UV per rilevare le miscele materiale di partenza e di reazione come macchie visibili. Calcolare il R f di tutti i punti (rapporto della distanza percorsa dal punto e la fase mobile). Nota: La reazione è completa quando non vi è alcun punto visto alla R f del materiale di partenza. </li></ol></li><li> Dopo il completamento della reazione lavorare la miscela di reazione introducendo in un imbuto separatore e lavaggio con acido acquoso o soluzione di base come appropriato. Raccogliere il solvente organico, evaporare in evaporatore rotante e seccare il prodotto grezzo ottenuto sotto vuoto. </li><li> Sciogliere 500 mg di prodotto grezzo in 3-5 ml di solvente adeguato e aggiungere ad un 1 g di silice o RP18 samplet e secca sotto aria. Posizionare il samplet contenente il prodotto grezzo in / RP SNAP cartucce Flash silice e purificare il materiale grezzo mediante cromatografia automatizzata flash ad alte prestazioni (secondo il protocollo del produttore) che impiega un g colonna SNAP 100 con una corsa di pendenza a partire dal 6% acetato di etile: 94 % esano al 50% di acetato di etile e 50% esani oltre15 volumi di colonna. </li><li> Essiccare il prodotto purificato raccolto in solvente dalla cromatografia flash utilizzando un evaporatore rotativo per evaporazione tutto il solvente a secchezza ed asciugare ulteriormente il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui. Eseguire caratterizzazione del prodotto purificato mediante NMR, MS e HPLC analitica. <ol><li> Per 1 H NMR e 13 C NMR, pesare circa 10 mg del campione purificato, scioglierlo in un appropriato solvente deuterato, e trasferire il contenuto di un tubo NMR secco per registrare gli spettri NMR 2,14. </li><li> Registrare il 1H NMR e 13 C NMR con un campo di alta NMR Spectrometer (minimo 300 MHz). Acquisire spettri di massa utilizzando un QTOF (Tandem quadrupla-1 tempo di spettrometro di massa di volo), ionizzazione electrospray (ESI) o di un VG 70S (doppio fuoco spettrometro di massa a settore magnetico, EI) 2,14. </li><li> Analizzare la purezza dei prodotti mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotateun C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna per l&#39;analisi. Utilizzare una corsa pendenza a partire dal 100% di acqua (0,1% di acido trifluoroacetico) al 60% di acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estrarre i cromatogrammi a 226 e 254 nm 2,14. Nota: purezze analitici di composti sono stati valutati&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. Sintesi in fase solida per la generazione di lanci 2 <ol start="1"><li> Sintesi di lanci N-capped <ol><li> Montare composti peptidici N-capped attraverso metodi di sintesi in fase solida standard usando la seguente procedura. <ol><li> Attivare 5 equivalenti di aminoacidi C-terminale (Fmoc-Phe) in 4,4 equivalenti di O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tetrametil-uronium-esafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) in 2 ml di DMF per 5 min. Caricare la miscela HBTU Fmoc-Phe sulla resina di pattinaggio con 6 equivalenti di diisopropylethyl ammina (DIPEA, 103.13mg) per 1 ora a RT. </li><li> Rimuovere il gruppo protettore Fmoc dal residuo C-terminale utilizzando 20% piperidina in 3 ml di DMF per 10 min. Coppia successive amminoacidi (ad esempio, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) passo passo. Ad ogni passo, coppia 5 equiv del successivo amminoacido usando 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) in 2 ml di DMF per 1 ora a RT. </li><li> Applicare cicli di lavaggio (5 x 10 ml di DMF + 5 x 10 ml di DCM) dopo accoppiamento amminoacidi Fmoc e deprotezione fasi sopra descritte. Dopo il montaggio peptide, gruppi che utilizzano 6 equivalenti di DIPEA (103.13 mg) e 4,4 equivalenti di HBTU (221,93 mg) Coppia N-tappatura in 2 ml di DMF per 1 ora a RT. </li><li> Al termine del montaggio peptide, trattare la miscela di reazione con 2 ml della miscela fenditura (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N per rimuovere catena laterale gruppi protettori, e cleave Capovolge dalla resina. Triturare il prodotto risultante con etere etilico freddo per precipitare e iof concentrato necessario in un evaporatore rotante. </li></ol></li></ol></li><li> Sintesi di lanci N-capped-C-capped <ol><li> Pesare e sciogliere il peptide Arg-Leu N-terminale livellata e protetta (16,1 mg, 0,02 mmol) in diclorometano e aggiungere [4- (3-clorofenossi) piridin-2-il] methanamine (C-cap) insieme a O - benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; esafluorofosfato -tetramethyluronium (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) e N, N -diisopropylethylamine (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Mescolare e controllare la reazione a temperatura ambiente fino TLC / HPLC indica il consumo totale di materiale di partenza. Dopo il completamento della reazione, concentrare la miscela di reazione grezza usando un evaporatore rotante e poi partizione tra acetato di etile ed acqua. </li><li> Separare il acquosa e strato organico; lavare la fase organica con 1 N NaOH, 1 N HCl, e salamoia. Essiccare lo strato organico con circa 1 g di solfato di sodio e concentrare il prodotto in evaporatore rotante. Finally trattare il prodotto O / N con la miscela di scissione (95: 2,5: 2,5 acido trifluoroacetico / H 2 O / TIPS) per deprotezione. </li><li> Triturare il prodotto risultante con fredda dietiletere ed eventualmente il concentrato in evaporatore rotante a completo essiccamento per eliminare tutto il solvente. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto per eliminare tutti i solventi residui. </li></ol></li><li> Purificazione e caratterizzazione di lanci <ol><li> Purificare ribalta greggio con semi metodi HPLC inversa in fase di preparazione. Lyophilize i lanci purificati e caratterizzare la loro massa molecolare mediante spettrometria di massa 2,14. </li><li> Determinare la purezza dei flips mediante HPLC con un rivelatore a serie di diodi e dotato di C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 micron colonna. Utilizzare un metodo del gradiente a partire dal 95% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 5% acetonitrile (0,1% di acido trifluoroacetico) al 35% H 2 O (0,1% di acido trifluoroacetico) / 65% acetonitrile (0,1% trifluoroaceL&#39;acido tic) su 30 minuti e tenere premuto il gradiente per 4 min. Estratto cromatogrammi a 226 e 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. fluorescenza polarizzata Binding Assay per la determinazione del legame competitivo 2,14 <ol start="1"><li> Eseguire il test in nero 384 pozzetti (138 ml) lastre con la seguente procedura. </li><li> Diluire i campioni, peptidi traccianti (4 Nm), e complessi chinasi (CDK2 / ciclina A - 18 mcg / ml, CDK4 / ciclina D - 37 mg / ml) alle concentrazioni necessarie a tampone (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitolo (DTT). </li><li> In ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti, aggiungere: 5 ml di CDK4D1 o CDK2CA (0,3 mcg / ben purificata complesso ricombinante umano chinasi), soluzione del composto 5 ml, 5 ml di 30 nm tracciante peptide (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly o fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracciante peptide). Utilizzare 5 ml di ogni DMSO (6%), buffer, tracciante e 5 microlitri DMSO (6%), complesso chinasi, come tracciante pozzetti di controllo </li><li> Dopo l&#39;aggiunta dei tutti i componenti, centrifugare la piastra a 500 rpm per 1 min (41.16 xg) a temperatura ambiente e poi incubare la piastra con agitazione per 45 minuti a temperatura ambiente. Utilizzo di un lettore di piastre multimodale e rilevatore dotato di 485 nm / 535 nm di eccitazione / filtri di emissione e uno specchio dicroico leggere l&#39;intensità fluoresceina di ogni pozzetto della piastra. </li><li> Calcolare la polarizzazione media relativa (mp) per tutti i campioni di prova con l&#39;equazione che mostra sotto. Determinare valori di IC 50 di regressione logaritmica, correlando relativi mps e testare le concentrazioni. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and fragment based design. Examples of proteomimetics include stapled peptides, porphyrin scaffolds and cyclic &#945;-helical mimetics although these are not without disadvantages21,22. Porphyrins (heterocyclic macrocycles comprised of pyrrole rings) are high molecular weight structures and are very hydrophobic23. Stapled peptides can be complex to synthesize and their mechanism of cell permeability is currently not fully known6. Conventional fragment based approaches require a highly sensitive detection method for testing weakly binding compounds and which also must be highly soluble. REPLACE is an iterative strategy comprised of computational prediction, synthetic organic chemistry and biological evaluation in order to convert peptidic inhibitors into FLIPs and ultimately non-peptidic drug-like compounds. Using REPLACE, fragment alternatives are designed and identified to mimic the interactions of binding determinants of a peptidic inhibitor. The combination of structural analysis along with synthetic methodologies and biological evaluation results in the efficient design of molecules that interact with hot spots (sites of critical interaction) and complement the large contact surface area of the PPI binding site1. REPLACE overcomes the disadvantages of conventional fragment based design since the peptide acts as an affinity and solubility scaffold. Also the iterative nature of REPLACE means that the inhibitor is gradually converted in several steps therefore minimizing the possibility of complete potency loss through conformation change. PLAs are optimized in the context of the peptide prior to further truncation. In the case study we describe, REPLACE has been exploited to generate more drug-like inhibitors that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes and possess significant anti-proliferative activity. Capped peptides have been identified as more drug-like mimics of the lead octapeptide. Key fragment alternatives discovered include N-caps based on (i) phenyl heterocyclic carboxylic acids2, (ii) furan and thiazole carboxylic acids substituted with alkylamino groups and (iii) pyridine carboxylic acids combined with alkoxy or basic groups14. 
In this case study, the first stage of the REPLACE strategy was identification of fragment alternatives for key peptide determinants using high-throughput docking. LigandFit, a shape based docking method was employed for evaluating binding of fragments in the cyclin groove. LigandFit15 generates poses that have high complementarity with a binding site through the use of Monte Carlo conformational search methods in conjunction with a shape based comparison filter. Use of a LigandFit protocol with the PLP1 energy grid and a minimization step to refine generated poses, was shown to reproduce known binding modes of previously determined N-capping groups. An accurate prediction of the binding affinity of the generated poses was provided by using the PLP1 scoring function which was shown to obtain the best results since it takes into account hydrogen bonding between the ligand and receptor. Specific H-bonds of CGI ligands with the cyclin groove have been shown to be important determinants of high affinity binding. Potential fragment alternatives for the N-terminus were synthesized or obtained from commercial sources and then used to generate FLIP molecules through coupling to an assembled peptide on a solid support. The ability of FLIPs to recapitulate the affinity of the native peptide is determined in a competitive binding assay using a known cyclin groove inhibitory peptide which is fluorescently labeled. After confirmation of the ability of FLIPs to bind with sufficient avidity to the CBG, the potency of the peptide-fragment hybrids can then be further refined through modifications to the Ncapping group. In addition, REPLACEments for C-terminus can explored for eventual combination with the optimized Ncaps. Further to this N terminal and C-terminal capping groups can be combined into a single more drug-like molecule2. Using this approach, compounds were obtained that have anti-proliferative activity in cancer cells lines that have deregulated CDK/cyclin/Rb/E2F1 pathways. Although REPLACE has been successfully applied, this strategy is not without limitations. These include the inaccuracy of any computational technique in predicting binding of docked molecules and synthetic issues in generating capping groups and FLIPs. Despite these, we have utilized REPLACE to generate more drug-like compounds that are cell permeable and have anti-proliferative activity. These compounds therefore have significant potential for further development as anti-tumor therapeutics.

In questo articolo, un caso di studio di applicare il REPLACE (sostituzione con alternative ligando parziali utilizzando computazionale arricchimento) strategia per convertire inibitori peptidici di interazioni proteina-proteina in più molecole farmacologicamente rilevanti è descritta 1-3. Mentre PPI rappresentano una ricca ma poco sfruttato fonte di potenziali bersagli farmacologici, metodologie esistenti sono largamente insufficienti a rendere questi ampiamente accessibile. Le attuali strategie, tra cui frammento basato design a 4, high-throughput di screening 5 e peptidi pinzati 6 sono previsti anticipi, ma questi sono in molti casi inefficace. Di conseguenza, sono necessari ulteriori progressi e approcci più efficienti. SOSTITUIRE è stato pienamente convalidato per lo sviluppo di inibitori della chinasi che hanno migliorato le proprietà farmaco-simili e hanno il potenziale per un ulteriore sviluppo come terapie antitumorali. Questa strategia è esemplificato nello sviluppo di inibitori non-ATP della cellaCDK ciclabili e coinvolge i seguenti: 1) ottenere informazioni strutturali 3D sulle interazioni di HAKRRLIF / RRLIF con la ciclina solco vincolante; 2) determinare i fattori determinanti vincolanti per l&#39;interazione peptide; 3) troncamento del peptide N-terminale contenente uno o più determinanti vincolanti; 4) identificazione di potenziali computazionale piccole molecole alternative (alternative ligando parziali, PLA) per la parte troncata del peptide e che mantengono interazioni chiave del peptide controllante; 5) sintesi o approvvigionamento commerciale di PLA previsto di impegnare avidamente con il sito sub precedentemente occupato da residuo peptide soppresso (s); 6) sintesi di sfoglia legatura dei migliori PLA al peptide troncato utilizzando sintesi in fase solida; 7) prove di lanci in un in vitro di legame o saggio funzionale (polarizzazione di fluorescenza nel contesto / ciclina CDK), seguita da un&#39;ulteriore caratterizzazione in un test di vitalità cellulare. Una rappresentazione schematica di REPLACE strategy è mostrato in Figura 1. In questo articolo, iterazioni della strategia REPLACE sono discussi e l&#39;applicazione di CDK2 / ciclina A descritto in dettaglio. CDK si crede di essere, direttamente o indirettamente deregolato nella maggior parte dei tumori e sono quindi considerati bersagli tumorali appropriata droga 7. CDK richiede associazione con cicline per la piena attivazione e successivamente fosforilare proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare 8. I due principali gruppi di CDK sono gli isotipi che controllano i punti di controllo del ciclo cellulare [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e le autorità di regolamentazione di RNA polimerasi, attraverso la fosforilazione (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un passaggio chiave nella progressione fase S si verifica quando il fattore di trascrizione E2F1 forma un complesso con la proteina DP, che poi si lega al DNA e inizia la trascrizione del gene. CDK2 / ciclina A è necessario per neutralizzare E2F1 trascrizionaleattività attraverso la fosforilazione determinando così liberare del complesso E2F1-DP e la sua successiva degradazione. Inibizione di CDK2 / ciclina A si ritiene di mantenere E2F1 nel suo stato legato DNA che porta all&#39;attivazione persistente. Del conseguente livello di E2F-1 supererà la soglia necessaria per indurre l&#39;apoptosi p53 indipendente suggerendo quindi una strategia terapeutica. A causa di p53 deregolamentato e percorsi pRb, alti livelli di E2F-1 spesso si verificano nelle cellule tumorali e l&#39;inibizione della CDK2 / ciclina A dovrebbe portare all&#39;apoptosi selettivi nei tumori e può essere considerato come un obiettivo cancro convalidato 7. Clinicamente inibitori CDK indagati bersaglio il sito altamente conservata ATP legame che porta ad attraversare reattività tra le proteine ​​chinasi maggiore di 500 nel kinome umano e potenzialmente dando luogo a effetti collaterali e la tossicità 9. Un approccio alternativo è non-ATP inibizione competitiva di mira substrato reclutamento attraverso il CBGpresente su ciclina subunità normativo positivo, e che è quindi distinto e distante dal sito ATP 10,11 vincolante. La CBG è principalmente un solco idrofobico presente in ciclina A, ciclina D e ciclina E e ha dimostrato di riconoscere una sequenza di consenso trovata in substrati e soppressori tumorali. Come un peptide isolato, il legame ciclina motivo (CBM) si lega al CBG e ha dimostrato di inibire l&#39;attività chinasica del CDK ciclo cellulare. Il CBM è stato ottimizzato per un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 0,07 ± 0,02 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 micron) e inoltre troncato a un pentapeptide che rappresenta un buon compromesso tra peso molecolare per droga somiglianza e potenza (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 1,01 ± 0,17 micron, CDK4 / ciclina D, IC50 25.12 ± 2.97 micron) 12,13. I CBGs costituiti da un grande primario e più piccola tasca idrofobica secondario che sono collegate da un ACIDIc regione (include Glu220, Glu224 e Asp283). Le principali determinanti vincolanti HAKRRLIF includono l&#39;interazione dei Ala2 con la tasca idrofoba secondaria, accoppiamento ionico e legami di idrogeno Lys3, Arg 4 e Arg5 con la regione acida e un alto grado di complementarità di Leu6 e Phe8 con il sito primario lipofilo. Inoltre, numerosi legami idrogeno sono fornite dal scheletro peptidico mentre Ile7 agisce come residuo spaziatore consente un contatto ottimale con la tasca principale. La modalità di rilegatura e le interazioni di HAKRRLIF con CBG è mostrato nella Figura 2. Targeting l&#39;interazione proteina-proteina CBM / CBG inibisce l&#39;attività chinasi CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e questo dovrebbe far scattare E2F1 apoptosi mediata delle cellule tumorali mentre non interessano le cellule normali 7. Anche se CBM derivati ​​peptidi sono efficaci inibitori di CDK ciclo cellulare, è improbabile che essi saranno utili come farmaci a causa del loro metabolismoinstabilità e mancanza generale di permeabilità cellulare. A tal fine, abbiamo applicato la strategia REPLACE al fine di convertire questi inibitori peptidici potenti in più composti farmaco-simili per l&#39;ulteriore sviluppo di terapie antitumorali sfruttando E2F1 liberalizzato attraverso CDK2 / ciclina A inibizione. Il protocollo seguente riassume lavoro che è stato completato l&#39;applicazione della REPLACE alla scanalatura ciclina. Nel primo caso, sono state identificate sostituzioni gruppo capping-farmaci per il tetrapeptide N-terminale di HAKRRLIF. Inoltre, i miglioramenti in questi gruppi sono stati esaminati in un ulteriore studio di validazione per REPLACE. Risultati rappresentativi di questi studi sono anche presentati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Computational Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex Workstations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Synthetic Organic Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6&amp;nbsp;mm, 5&amp;nbsp;&amp;mu;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H NMR and &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flourescence Polarization Assay&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>384 micro well plates, Micro pipets</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td><td>BPS Bio Sciences</td><td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1&amp;nbsp;mM dithiothretiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td>375368</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 485&amp;nbsp;nm/535&amp;nbsp;nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent</td><td>Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo electron corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator 4-8 &amp;#176;C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 595&amp;nbsp;nm filter</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE è una strategia unica sviluppata per indirizzare più efficacemente le interazioni proteina-proteina (PPI). Ha lo scopo di ampliare lo spazio disponibile altro obiettivo fornendo una migliore metodologia per l&#39;identificazione di inibitori di tali siti di legame e che rappresentano la maggior parte dei potenziali bersagli farmacologici. L&#39;obiettivo principale di questo lavoro è quello di fornire una visione metodologica di utilizzo e applicazione della strategia REPLACE che prevede approcci di chimica computazionale e sintetiche. Replace è esemplificata attraverso la sua applicazione allo sviluppo di non-ATP chinasi ciclina dipendenti competitivo (CDK) inibitori come terapie antitumorali. CDK sono spesso deregolamentati nel cancro e, quindi, sono considerati come obiettivi importanti per lo sviluppo di farmaci. Inibizione di CDK2 / ciclina A in fase S è stato segnalato a promuovere l&#39;apoptosi selettiva delle cellule tumorali in modo indipendente p53 attraverso la via E2F1. Targeting l&#39;interazione proteina-proteina in bindin ciclinag scanalatura (CBG) è un approccio che permetterà l&#39;inibizione specifica del ciclo cellulare nel corso CDK trascrizionali. La CBG è riconosciuto da una sequenza consenso derivato da substrati CDK e proteine ​​oncosoppressori definito il legame motivo (CBM) ciclina. Il CBM è stato precedentemente ottimizzato per un octapeptide da p21Waf (HAKRRIF) e poi ulteriormente troncato ad un pentapeptide ritegno sufficiente attività (RRLIF). Peptidi, in generale, non sono delle cellule permeabili, sono metabolicamente instabile e quindi il REPLACE (sostituzione con Parziale Ligand Alternative attraverso computazionale arricchimento) strategia è stata applicata al fine di generare inibitori più farmaco-simili. La strategia inizia con la progettazione di Frammento legatura peptidi inibitori (flip), che inibiscono selettivamente ciclo cellulare complessi CDK / ciclina. Capovolge sono stati generati da iterativamente sostituendo residui di HAKRRLIF / RRLIF con frammento come piccole molecole (gruppi capping), a partire dalla N-terminale (Ncaps), seguita da sostituzione inil C-terminale. Questi composti sono punti di partenza per la generazione di non-ATP inibitori CDK competitivi come terapie anti-tumorali.

Le interazioni di HAKRRLIF con scanalatura ciclina sono mostrati in Figura 2. I residui peptidici che rappresentano le principali determinanti di legame includono Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 con altri residui fornendo contributi piccole 12,13,18. In questo caso di studio la strategia REPLACE è stato utilizzato al fine di trovare alternative frammento di residui nel tetrapeptide N-terminale HAKRRLIF, imitando soprattutto le interazioni di Ala2 e Arg4. Una libreria di potenziali frammenti NCAP (Tabella 1) è stato costruito sulla base dei criteri. Ogni molecola è stata ormeggiata nel sito di legame lasciato libero creato da troncamento del gruppo N-capping dalla sua struttura di cristallo con la ciclina A (PDB ID: 2UUE). Alternative ligando potenziali sono stati selezionati sulla base di analisi posa e PLP1 punteggio come una previsione di affinità (esempi di pose attraccate sono mostrati in Figura 4). La sintesi di un NCAP confermata (1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico) è mostrato in Figura 5, dove questa molecola è stata generata in tre fasi e purificato mediante cromatografia flash automatico (figura complementare 1). Il 1 H NMR, 13 CNMR, MS e HPLC dati di caratterizzazione di un composto rappresentativo 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico sono mostrati in Figure 1-5 complementare rispettivamente. La sintesi di lanci N-capped e la ribalta N-capped-C-capped sono rappresentati nelle figure 7 e 8 ed i dati di caratterizzazione sono riportati nella tabella 2. L&#39;affinità di legame per entrambi CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D è stato determinato utilizzando il test descritto FP ed i risultati sono riportati nella tabella 3. Tra i composti testati, ribalta contenente triazolo N-caps basato sono stati determinati ad avere la più grande affinità per CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D e composto rappresentativos sono stati testati in saggi cellulari. Nel complesso, le molecole FLIP identificati sono stati trovati per essere più farmaco come e mantenere molte delle interazioni del octapeptide HAKRRLIF. Tetrapeptidi Capped possedevano minore potenza rispetto a HAKRRLIF tuttavia erano di attività paragonabile al pentapeptide RRLIF (tabelle 3 e 4). Questi risultati mostrano che i composti ottenuti erano migliorate somiglianza farmaco, ma questo è stato ottenuto a costo di un po &#39;compromessa affinità di legame. L&#39;attività anti-proliferativa questi ligandi CGI stata valutata e cellulari IC 50 &#39;s sotto 30 mM sono stati osservati in linee cellulari tumorali U2OS e DU145. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della strategia REPLACE. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a><html> ick qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. rilegatura e interazioni di HAKRRLIF in CBG pannello sinistro:. Struttura Modellato di HAKRRLIF legato al CBG. La scanalatura ciclina consiste di due tasche idrofobiche - una tasca principale più grande (destra, occupate da Leu6 e Phe8) e una tasca più piccola secondaria (sinistra, occupata da Ala2) e che sono collegate da residui acidi raffigurati in rosso. A destra: Altre interazioni importanti sono idrogeno legame contatti della spina dorsale peptide (con Trp217, Gln254, Ile281), e le interazioni di ioni-pairing dei tre residui di base del peptide (con Glu220, Glu224, Asp283). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 441 / 52441fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Modalità vincolante di 3,5-DCPTRLIF in CBG. Il legame di 3,5-DCPT-RLIF è mostrato con interazioni di legame idrogeno (rappresentato da linee verdi tratteggiate) con gli atomi di sidechain Trp217 e Gln254. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig4.jpg" /> Sono mostrati Figura 4. di docking risultati selezionati. Ancorata pose di 3 rappresentativi gruppi N-capping. Ciascuno di questi composti rendono H legami con gli atomi del filtro di interazione Trp217 e Gln254 e come rappresentato da linee verdi tratteggiate. Il sostituente fenil rende interazioni di van der Waals con la tasca idrofobica secondario. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig5highres.jpg" width="700" /> Figura 5. Sintesi di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig6highres.jpg" width="700" /> Figura 6. Sintesi di lanci N-capped di sintesi in fase solida. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52441/52441fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7. Sintesi di N-caCapovolge pped-C-capped. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441table1ahighres.jpg" width="700" /><img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441table1bhighres.jpg" width="700" /> Tabella 1. Biblioteca di piccole molecole attraccate e le previsioni risultanti di energia di legame utilizzando la funzione di PLP1 punteggio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Peptide </td><td> Purezza </td><td> Colonna Dimensioni </td><td> Metodo </td><td> Portata </td><td> HPLC Tempo di conservazione </td><td> MW teorica </td><td> Osservato MW </td></tr><tr><td> 5843 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 23.9 </td><td> 732 </td><td> 732,6 </td></tr><tr><td> 5773 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 22.4 </td><td> 801,77 </td><td> 800,55 </td></tr><tr><td> 5774 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 24.2 </td><td> 767,33 </td><td> 766,5 </td></tr><tr><td> 5762 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 9.0 </td><td> 731,91 </td><td> 731,65 </td></tr><tr><td> 5763 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 11.2 </td><td> 800,8 </td><td> 799,5 </td></tr><tr><td> 5764 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 10.1 </td><td> 766,34 </td><td> 765,55 </td></tr><tr><td> 5771 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 9.4 </td><td> 749,9 </td><td> 749,6 </td></tr><tr><td> 5765 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 10.1 </td><td> 766,35 </td><td> 755,65 </td></tr><tr><td> 5766 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 9.4 </td><td> 761,9 </td><td> 761,55 </td></tr><tr><td> 5767 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 20.4 </td><td> 761,9 </td><td> 761,55 </td></tr><tr><td> 5776 </td><td> &gt; 75% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 23.3 </td><td> 785.7 </td><td> 784,55 </td></tr><tr><td> 5775 </td><td> &gt; 90% </td><td> 4.6 × 250 millimetri </td><td> 5-65% acetonitrile / acqua / TFA 0,1% </td><td> 1 ml / min </td><td> 9.9 </td><td> 751,34 </td><td> 750,45 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Dati analitici per CGI Peptidi di rilegatura e la ribalta. <img alt="Tabella 3" src="/files/ftp_upload/52441/52441table3.jpg" /> Tabella 3. In vitro il legame di selezionati lanci N-capped a CDK2CA e CDK4CD. <img alt="Tabella 4" src="/files/ftp_upload/52441/52441table4.jpg" /> Tabella 4. Nel legame di N &amp; C selezionato vitro ricoperto ribalta a CDK2CA e CDK4CD. Supplementare Figura 1-5. Purificazione e caratterizzazione di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. <img alt="Sup Figura 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441supfig1.jpg" /> Figura supplementari 1. Flash cromatogramma di prodotto ottenuto dalla fase 1. Ci sono quattro picchi eluiscono, il picco principale eluizione a 55% acetato di etile / 45% esani è risultato essere il prodotto desiderato. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.</a> <img alt="Sup Figura 2" src="/files/ftp_upload/52441/52441supfig2.jpg" /> Figura 2. complementare 1 HNMR di 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-car<html> L&#39;acido carbossilico. Lo spettro NMR mostra 3 protoni metilici alifatici e 3 protoni aromatici. L&#39;integrazione di tutte le tre cime Di seguito si riporta lo spettro NMR. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Sup Figura 3" src="/files/ftp_upload/52441/52441supfig3.jpg" /> Figura 3. complementare 13 CNMR 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. Ci sono dieci atomi di carbonio nella struttura, 13 CNMR con 10 segnali per ogni carbonio atomo. L&#39;integrazione per ogni picco è mostrato sotto lo spettro NMR. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441supfig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> ig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. complementare MS di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. Il peso molecolare del composto viene mostrata come picco parent a 237. L&#39;attuale molecolare peso del composto è 237,64. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441supfig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Sup Figura 5" src="/files/ftp_upload/52441/52441supfig5.jpg" /> Figura 5. complementare HPLC di 1- (3-clorofenil) Acido -5-metil-1H-1,2,4-triazolo-3-carbossilico. La purezza del prodotto è determinata come 100%, come mostrato nel cromatogramma HPLC. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52441/52441supfig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Video: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Ricerca

Biochimica

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

Profilazione cellulare ad alto rendimento di composti di degradazione proteica mirati utilizzando linee cellulari HiBiT CRISPR

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Ricerca sul cancro

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Immunologia e infezioni

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Progettazione di biomolecole

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Biologia

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated arginine and were produced using Fmoc solid-phase peptide synthesis. Overexpression of the Src tyrosine kinase enzyme has been implicated in the development of different cancers. Dipeptides containing unnatural amino acids such as methylated arginine (RCH3), dimethylated arginine (R(CH3)2), and/or methylated tryptophan (WCH3) residues have earlier been shown to inhibit Src kinase. In this study, three such dipeptides, W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2, were tested using acellular assays and were found to have IC50 values (the concentration at which 50% inhibition occurs) of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively. These values were comparable to those obtained for cyclic penta- to nano-W-R peptides ([W-R]5-[W-R]9) synthesized in previous studies. However, the unmethylated versions of the dipeptides did not show any inhibitory activity against Src kinase. All of these dipeptides (50 &#181;M) did not show any cytotoxicity after incubation up to 72 h with three different cancer cell lines, including leukemia (CCRF-CEM), breast adenocarcinoma (MDA-MB-231), and ovarian adenocarcinoma (SK-OV-3) cell lines, indicating the limited permeability of the peptides through the cell membrane. Therefore, further study is needed to improve the permeability of these peptides for anticancer applications, such as by using a peptide carrier or additional peptide functionalization. In summary, this study provides a protocol to synthesize and test peptides that inhibit Src kinase activity, and thus possess promising anticancer ability, as demonstrated using acellular and cellular assays.

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Presented here is a protocol for designing and testing dipeptides that can inhibit Src kinase enzyme activity using acellular and cellular assays for anti-cancer applications. The peptides formulated here (W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2)&#160;inhibited Src kinase with IC50 values of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively.

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated ...

Sviluppo di inibitori di interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo non ATP inibitori CDK competitivo

Riepilogo

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Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

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Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Proteine saggezza: un banco di lavoro per

Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Inibizione dell'attività CDK

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