Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della Fondazione Tedesca per la Ricerca (SFB / TRR57, Q3 e Q2). Gli autori ringraziano Mareike Schulz, Pascal Paschenda, e Klaudia Warzecha per il loro aiuto nella preparazione fotografie.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali dello Stato e uso comitato ufficiale (LANUV, Recklinghausen, Germania). I topi sono alloggiati in condizioni specifiche del-libera patogeni secondo le linee guida della Federazione per il laboratorio scientifico Associazioni animali (FELASA). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e &#39;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&#39; (National Institutes of Health pubblicazione 8 ° edizione, 2011). 1. prechirurgica Preparazione NOTA: Eseguire tutte le operazioni in condizioni di pulizia, ma non sterili. Tutti gli strumenti e altre attrezzature riutilizzabili, come pinze chirurgiche, forbici, e Colibri divaricatore che vengono utilizzati per eseguire un intervento chirurgico devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso secondo protocolli che sono in stretta conformità con le linee guida istituzionali per l&#39;esecuzione di interventi chirurgici negli animali., Per un elenco dettagliato dei necessari reagenti, materiali e attrezzature, si prega di consultare l&#39;elenco dei materiali specifici / attrezzature. <ol><li> Durante la sperimentazione completa, mantenere l&#39;animale su una piastra di riscaldamento ad una temperatura di 37 ° C, permanentemente collegata ad un sistema di anestesia, e la copertura della zona operativa complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Correttamente organizzare tutti strumentazioni e le soluzioni che vengono utilizzati durante la sperimentazione prima della chirurgia (Figura 1). </li><li> Anestetizzare il mouse con inalazione di 4 vol% isoflurano in ossigeno al 100% con una portata di 4 l / min per l&#39;induzione di anestesia. La profondità di anestesia è sufficiente al raggiungimento dei seguenti criteri fondamentali: la respirazione regolare spontanea, senza il riflesso dopo aver impostato di stimoli del dolore tra le dita dei piedi, e nessuna risposta al dolore. </li><li> Accorciare il pelo addominale del mouse con un rasoio elettrico pelliccia e proteggere gli occhi dalla disidratazione da uso dell&#39;occhio e nose pomata. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra calda riscaldata 37 ° C, inserire il muso mouse nella maschera Fluovac del sistema di anestesia Fluovac, e fissare le gambe dell&#39;animale con strisce di nastro seta. </li><li> Mantenere anestesia del mouse per inalazione di 1,5-3% vol isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di flusso di 1 l / min e induct analgesia perioperatoria tramite iniezione intraperitoneale di soluzione di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo sciolto in 0,9% soluzione di NaCl) . </li><li> Sterilizzare la pelle addominale rasata con un tampone di garza che viene inumidito con uno standard antisettico, pronta all&#39;uso soluzione alcolica per il trattamento pre-operatorio della pelle. Nota: Nei nostri protocolli usiamo una pelle antisepticum poli-alcool. Questo è in pieno accordo con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e delle linee guida della Federazione per laboratorio scientifico Associazioni animali. Questo antisettica contiene il 70% (v / v) 2-propanolo, butan-1,3.diol e tracce di chinolina giallo, e perfume. </li></ol> 2. Procedure chirurgiche <ol><li> Aprire l&#39;addome con una laparotomia mediana di una lunghezza di circa 2 cm tagliando la cute più fascia allo stesso tempo con una forbice chirurgica 11,5 centimetri. </li><li> Sezionare il tessuto connettivo sopra del peritoneo utilizzando il forbice come spreader. </li><li> Tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale. </li><li> Ingrandire la cavità inserendo una sutura partecipazione in sterno, sollevando il filamento della sutura, e fissandolo in cima alla maschera Fluovac. </li><li> Distribuire la zona di operazione inserendo un riavvolgitore Colibri nella cavità peritoneale (Figura 2). </li><li> Sollevare il fegato con una idratata (0,9% NaCl soluzione) il tampone in modo che il lato ventrale si attacca alla membrana e l&#39;ilo è chiaramente visibile. </li><li> Esporre il dotto biliare dal movimento caudale dell&#39;intestino (Figura 3). </li><li> Separare con attenzione il dotto biliare dalaccompagnamento vena porta e dell&#39;arteria epatica utilizzando un micro-dentellature pinza (Figura 4A). </li><li> Posizionare il 5-0 sutura intorno al dotto biliare e fissarlo con due nodi chirurgici. Nel legare i nodi aumentano la forza di trazione continuamente per garantire ostruzione efficace senza recidere il dotto biliare (Figura 4B). </li><li> Aggiungere una seconda legatura cranica nello stesso modo, ma non sezionare il dotto biliare tra (Figura 4C). In caso contrario, vi è un notevole rischio che le perdite biliari se un nodo non è sicuro, e agli animali nessun colestasi ma sviluppano peritonite gravi. </li><li> Tagliare le estremità delle suture (Figura 4D), abbassare lo sterno, e rimuovere il riavvolgitore. </li><li> Risciacquare la cavità peritoneale con 0,9% di soluzione di NaCl e sostituire gli organi addominali alle posizioni fisiologiche. </li><li> Chiudere entrambi addominali strati (peritoneo e cute più plancia) con punti di sutura in esecuzione separati con 6-0 Mersilk. </li><li> Tagliare la postands delle suture e sterilizzare l&#39;area operazione con un tampone di garza inumidito con soluzione antisettica. NOTA: Quando si esegue l&#39;intervento chirurgico per la prima volta, eseguire tutte le procedure sotto un microscopio operatorio con un ingrandimento di 16X-20X. Questo permette un migliore riconoscimento del dotto biliare e chiaramente distingue dalla vena porta e l&#39;arteria epatica (figure 5 e 6). Alcuni laboratori raccomandano la dissezione del dotto biliare tra le due legature. Lasciare il dotto biliare intatto perché potenziali perdite in uno dei nodi si tradurrà in una grave peritonite acuta, ascite, e endotossemia sistemica quando il dotto biliare è sezionato. </li></ol> 3. postoperatoria trattamento e il follow-up <ol><li> Lasciare che il mouse per recuperare in una gabbia riscaldato da una lampada a infrarossi fino a quando il mouse è completamente sveglio e attivo. </li><li> Successivamente, spostare il mouse in una gabbia normale e fornire ad libitum accesso ad acqua e cibo. </li><li> Laopo l&#39;intervento chirurgico, controllare gli animali ad intervalli regolari ed effettuare il follow-up il trattamento post-operatorio con analgesia adeguata (ad esempio, la soluzione buprenorfina) in seguito alla raccomandazione locale della cura degli animali e l&#39;uso interno comitati. NOTA: Eseguire la terapia analgesica per 3 giorni. Qualsiasi comportamento anomalo può indicare complicanze rare come peritonite, sepsi o emorragie interne e deve essere trattato come endpoint umana di interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Gli animali vengono tenuti con libero accesso a cibo e acqua ad libitum fino alla fine dell&#39;esperimento. Non vi è alcuna necessità di prelievo di sangue dal fibrogenesi corso è indicato da ittero. </li><li> Quando gli animali vengono sacrificati, il sangue viene raccolto per la misura dei parametri clinici chimica (AST, ALT, bilirubina, ecc) e il fegato viene recuperato per l&#39;analisi istochimica e biochimica. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Danno epatico colestatica è uno dei principali fattori causali per lo sviluppo di fibrosi epatica e cirrosi nei pazienti con malattia epatica cronica. Sulla base del fatto che queste malattie producono costi sanitari imponderabili, è comprensibile che molti ricercatori stanno cercando di capire i meccanismi patogenetici della fibrosi epatica in corso. Pertanto, modelli sperimentali sono stati generati che imitano i vari aspetti dei complessi meccanismi che portano alla infiammazione epatica, fibrosi e cirrosi 1. Chirurgico BDL è uno dei più diffusi modelli sperimentali che viene utilizzato per indurre lesioni colestatico ostruttiva in topi e ratti 4,23,24. Nella maggior parte dei protocolli, gli animali sono anestetizzati e viene eseguita una laparotomia tronco. Successivamente, il dotto biliare è scoperto dalla cavità addominale e ligato due volte con spago chirurgica. Di conseguenza, i topi e ratti che hanno ricevuto questa chirurgia dEvelop una forte reazione fibrotica che in un primo momento provengono dai campi periportali 25. Nel corso degli anni sono state descritte diverse tecniche chirurgiche e modifiche diverse. Procedure speciali anche permettere riconnessione o reanastomosis dopo BDL 23. Altre tecniche sono basate sulla parziale BDL conseguente significativamente minore formazione di necrosi e conseguentemente epatociti proliferazione 24. Parziale BDL in combinazione con successiva rimozione della colecisti (colecistectomia), che impedisce la formazione di colecistite rappresenta anche un ottimo modello sperimentale per colestasi acuta. È stato proposto di essere un modello che è più vicino alla situazione umana 24. E infatti, durante la creazione di questo modello, si è già dimostrato che provoca riproducibile colestasi con solo il minimo danno tissutale istologico e di non luogo a colestasi cronica 25. Pertanto, è stato suggerito che questo modello è ideale per studiare late gli effetti di colestasi invertito 24. Anche metodi più sofisticati sono basati su microchirurgia e permettono un modo veloce e riproducibile per infliggere danno epatico colestatico solo in parti selezionate del fegato 26. Anche se queste modifiche sofisticati dal protocollo originale BDL sono stati dimostrati molto utili nelle indagini domande di ricerca specifiche, molti laboratori in tutto il mondo fondamentalmente lo scopo di impiegare il modello BDL come modello altamente riproducibile e affidabile per la fibrosi epatica colestatica. Tuttavia, molte complicazioni possono verificarsi che possa alterare sostanzialmente la riproducibilità e affidabilità dei risultati ottenuti da questo modello, se imprecisioni tecniche non sono evitati. Ad esempio, complicanze emorragiche legate a lesioni dei vasi sanguigni che accompagnano il dotto biliare (vedi figure 3 - 4) possono verificarsi durante o dopo l&#39;intervento chirurgico rapidamente. Sovradosaggio di anestesia con conseguente cardiodepression o rfallimento espiratory sono anche complicazioni evitabili della procedura. Infezioni gravi, che vanno da peritonite a sepsi, possono verificarsi durante l&#39;intero periodo dell&#39;esperimento, se le suture non vengono eseguite accuratamente e perdite biliari nella cavità peritoneale. Lesioni accidentali a livello intestinale durante l&#39;intervento chirurgico potrebbe anche portare alla peritonite. Pertanto, è evidente che sono fortemente necessari protocolli standardizzati che sono in conformità con le linee guida movimentazione rigorose. Questa clausola è stata anche recentemente chiesto nei paesi dell&#39;Unione europea, che ha recepito le nuove norme sul benessere degli animali nel 2013 1. I rispettivi requisiti che sono associati con questo regolamento non sono nuove e sono state già proposte nel 1959, quando Russell e Burch suggerito etico quadro per condurre esperimenti scientifici con animali che si basa principalmente su una sostituzione, miglioramento e riduzione (3R) Principio 27. Quando dopo la outlinprotocollo ed ci sono solo alcune complicazioni che potrebbero derivare da imprecisioni tecniche. Tre questioni specifiche potrebbero verificarsi in piuttosto bassa frequenza. Come per tutte le procedure chirurgiche, l&#39;overdose di anestetico è una potenziale fonte di pericolo per gli animali specialmente in combinazione con ipotermia. Se durante l&#39;intervento verificano complicanze cardiovascolari, la fornitura di anestetici deve essere immediatamente interrotto e l&#39;operatore deve cercare di fornire il più possibile di ossigeno al mouse. Questo può essere fatto per mezzo di una piccola siringa plastica che è riempito di aria e pompato nella bocca dell&#39;animale alterata. In alternativa, l&#39;uso di una piccola Peleusball per la ventilazione dell&#39;animale colpito è spesso utile per il processo di rivitalizzazione. Problemi di guarigione delle ferite Dopo l&#39;intervento chirurgico BDL, i topi possono mordere le loro giunture doloranti o quelli di altri animali. In questo caso, rispettivi topi dovrebbero essere distintamentegabbia. Gli animali con ferite aperte devono essere anestetizzati, la regione intorno alla ferita delicatamente sterilizzato con un antisettico standard e la ferita deve essere ricucita di nuovo. Durante i prossimi 3 giorni, la ferita di questi animali dovrebbero essere regolarmente ispezionati (due o tre volte al giorno). Distensioni dell&#39;addome o formazione di ascite sono indicativi per le infezioni batteriche. Questi potrebbero verificarsi a causa di lavoro non sterile durante l&#39;intervento chirurgico. Tutti i tipi di infezioni deve essere maneggiato senza eccezioni come endpoint umano e gli animali colpiti deve essere sacrificato. Abbiamo fornito un facile seguire protocollo che permette l&#39;esecuzione di BDL nei topi che è semplice da implementare e evoca la mortalità degli animali solo bassa combinata con una elevata riproducibilità. Tutti i protocolli chirurgici possono essere rapidamente fermati da scienziati qualificati. Durante la sperimentazione completa, gli animali sono mantenuti su una piastra riscaldante a 37 ° C e collegati permanentementea un sistema di anestesia minimizzare il dolore e angoscia. Per la chirurgia, l&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana e il dotto biliare doppia legatura senza analizzarlo. I risultati rappresentativi che sono state discusse qui dimostrano che le alterazioni fenotipiche in materia di morfologia del fegato (infiammazione, la fibrosi, cirrosi) sono altamente riproducibili e permettono di studiare diversi aspetti della fibrogenesi (ad es., L&#39;iniziazione, l&#39;infiammazione, la progressione, stadio terminale della malattia) in punti temporali definiti. Ci auguriamo che la sintesi del nostro protocollo contribuirà a ridurre la curva di apprendimento che è necessario stabilire con successo questo modello di fibrosi in altri laboratori e garantire risultati affidabili e riproducibili in luoghi diversi. In tal modo riteniamo che il protocollo presentato sostiene il principio 3R che avrebbe dovuto da Russell e Burch nel 1959 e rappresenta la base di nuove norme sul benessere degli animali che sono attualmente implementate in molti paesi wisottile il quadro europeo.

Fibrosi epatica è definita come la eccessiva produzione e l&#39;accumulo di matrice extracellulare (ECM) che proviene da una rete complessa di interazioni di cellule stellate epatiche matrice produttrici e una grande varietà di cellule del sangue fegato residente e cellule infiltranti 1,2. Anche se la fibrosi epatica può essere causata da una moltitudine di stimoli diversi meccanismi molecolari alla base della fibrosi sono generalmente molto simili. A seguito di danno epatico, viene avviato un programma altamente orchestrata di cambiamenti molecolari e cellulari. In questo programma di una stretta interazione tra segnali infiammatori, monociti / macrofagi e cellule stellate epatiche si verifica che i risultati finali di attivazione delle cellule stellate e transdifferenziamento di miofibroblasti, ECM deposizione e consecutivi alterazioni anatomiche e funzionali di integrità tessuto epatico 3. L&#39;attivazione delle cellule stellate epatiche è particolarmente guidato da segnali infiammatori e interazioni con il fegatomacrofagi residenziali (cioè le cellule di Kupffer). Modelli molecolari associati patogeni sono riconosciuti dai recettori di pattern recognition specializzati come i recettori Toll-like che quando il segnale attivato attraverso una complessa rete di percorsi diversi che attivano l&#39;espressione e la secrezione di una moltitudine di citochine infiammatorie e chemochine che guidano il processo infiammatorio 3. La risposta infiammatoria e l&#39;insulto epatica formato è solo temporaneo quando il fattore-malattia che producono viene rimosso. Al contrario, se la lesione persiste, infiammazione cronica evolve nel fegato e l&#39;espressione e l&#39;accumulo di folle ECM in primo piano con conseguente progressiva sostituzione del parenchima epatico normale dalla formazione di tessuto cicatriziale. Dal fibrogenesi epatica nell&#39;uomo è un problema clinico in tutto il mondo, diversi modelli di roditori sperimentali di insufficienza epatica acuta e cronica sono stati stabiliti nel corso degli ultimi decenni. Nelle muSistema rine per esempio, modelli comuni sono la somministrazione di una varietà di diversi epatotossine, la legatura del dotto biliare comune, induzione di danno epatico immuno-mediata, e l&#39;introduzione mirata di difetti genetici o viceversa la sovraespressione di transgeni che colpiscono critico vie di segnalazione coinvolte nella patogenesi della fibrosi epatica 4. Legatura del dotto biliare comune nei roditori è stata effettuata come procedura sperimentale ricerca per molti anni 5-8. Un primo protocollo altamente riproducibile per la legatura del dotto biliare prolungata (BDL) nei roditori è stato già presentato ormai più di tre decenni fa 9. In questo protocollo sia incannulamento / ostruzione e legatura indotto un alto rendimento di cirrosi nei ratti con cambiamenti morfologici che erano paragonabili a quelli osservati nella cirrosi biliare umano 9. Il rispettivo protocollo è semplice, la procedura chirurgica è relativamente rapidamente applicabile, E il tasso di sopravvivenza degli animali sono elevati con oltre il 95%. Nel protocollo di ratto incannulamento / ostruzione classica, una breve incisione di 2 cm è fatto sotto il processo xifoideo. Successivamente, una cannula viene inserito nella porzione prossimale del dotto biliare e fissato in posizione con suture di seta. In una fase successiva, la porzione distale della cannula è ostruita con 3 nodi, messo attraverso l&#39;estremità inferiore della incisione mediana e sepolto sottocutanea nel quadrante destro inferiore 9. Alla fine, l&#39;addome è chiusa e gli animali sono autorizzati a recuperare. Nel protocollo legatura, i ratti sono sottoposti a doppia legatura del dotto biliare comune con o senza dissezione del dotto biliare tra le legature 9. Questo modello sperimentale è ben accettata e utilizzata in tutto il mondo in centinaia di laboratori per indurre colestasi epatica e fibrosi. Induce intraepatica biliare proliferazione delle cellule epiteliali, differentiatio miofibroblasticon di fibroblasti portale attorno proliferanti cellule epiteliali biliari, con conseguente altamente riproducibile, espressione massiccia e deposizione di ECM 10,11. Pertanto, l&#39;applicazione di questo modello in ratti e topi è essere popolare tra gli scienziati che mirano a comprendere la patogenesi dell&#39;infiammazione epatica e fibrosi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ampiamente utilizzato questo protocollo in passato nei ratti in diversi studi sperimentali volti ad indagare gli aspetti particolari molecolari e cellulari della fibrogenesi epatica e per testare nuovi concetti antifibrotici e farmaci 12-15. Recentemente, abbiamo adattato questa metodologia al sistema murino e ha scoperto che la chirurgia legatura del dotto biliare è anche un mezzo interessante per stabilire la fibrosi dipendenti dal tempo con una bassa variazione e mortalità nei topi 16-18. A causa delle dimensioni più piccole degli animali, tuttavia, alcune importanti modifiche per quanto riguarda l&#39;anestesia, interv chirurgicaenzione e di osservazione post-trattamento sono necessari per ottenere risultati affidabili e riproducibili in questo modello. L&#39;adattamento completo è riassunto nella seguente protocollo e nella documentazione video allegato.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Shaver Favorita II</td><td>Aeskulap</td><td>GT104</td><td></td></tr><tr><td>Cutter head</td><td>Aeskulap</td><td>GT730</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen eye and nose ointment</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Warming plate and controller</td><td>Labotect</td><td>HP 062</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac anesthesia system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>commercially available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue paper</td><td>commercially available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore silk tape</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Gauze swabs</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Alcohol Haut&amp;hellip;farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Raucodrape OR adhesive drapes</td><td>Lohmann &amp;amp; Rauscher GmbH</td><td>33013</td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps straight</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Mersilk suture</td><td>Ethicon</td><td>K889H</td><td>Silk, non-absorbable/Abdominal closure</td></tr><tr><td>Needle holder Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Colibri retractor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>Noba Verbandmittel</td><td>974202</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1032238</td><td></td></tr><tr><td>25mL beaker</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Isotonic (0.9%) NaCl solution</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Micro-serrations forceps Moria MC31</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11370-31</td><td>Bile duct separation</td></tr><tr><td>5-0 Mersilene suture</td><td>Ethicon</td><td>EH6731H</td><td>Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation</td></tr><tr><td>5mL syringe</td><td>BD Discardit II</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>1mL syringe</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Sterican needle 26 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>Infrared lamp</td><td>Petra Electric</td><td>IR 11</td><td></td></tr></tbody></table>

bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis

Nella maggior parte dei vertebrati, il fegato produce bile che è necessario per emulsionare i grassi assorbiti e consentire la digestione dei lipidi nell&#39;intestino tenue e di espellere bilirubina e altri prodotti metabolici. Nel fegato, l&#39;ostruzione sperimentale del sistema biliare extraepatica innesca una complessa cascata di eventi patologici che porta a colestasi e infiammazione conseguente forte reazione fibrotica proveniente dai campi periportali. Pertanto, legatura chirurgica del dotto biliare comune è diventato il modello più comunemente usato per indurre lesioni colestatica ostruttiva nei roditori e di studiare gli eventi molecolari e cellulari che sono alla base di questi meccanismi fisiopatologici indotti da inadeguato flusso biliare. Negli ultimi anni, sono state descritte diverse tecniche chirurgiche che o permettono riconnessione o reanastomosis dopo legatura del dotto biliare (BDL), ad esempio, parziali BDL, o altri metodi di microchirurgia per domande di ricerca specifiche. Tuttavia, il modello utilizzato più frequentemente è la completa ostruzione del dotto biliare comune che induce una forte risposta fibrotica dopo 21 a 28 giorni. Il tasso di mortalità può essere elevato a causa di complicanze infettive o imprecisioni tecniche. Qui forniamo una procedura chirurgica dettagliato per il modello BDL nei topi che inducono una risposta fibrotica altamente riproducibile in base alla regola 3R per il benessere degli animali postulata da Russel e Burch nel 1959.

In una sperimentazione tipica BDL è stata eseguita in 40 maschi C57BL / 6 topi wild-type pesando circa 18-20 grammi. Questo esperimento è stato fatto per indagare fibrogenesi epatica nella fase di apertura (3 e 7 giorni), durante la progressione (10, 14, e 20 giorni), e durante lungo termine (30 e 60 giorni) 16. In questo modello, la fibrosi persinusoidal ha già sviluppato il giorno 10 dopo l&#39;intervento chirurgico, mentre fibrosi periportale che l&#39;aumento permanente fino alla fine dell&#39;esperimento era pienamente sviluppata dopo 20 giorni. Nell&#39;esperimento menzionato, tutti gli animali che hanno ricevuto una semplice farsa-operazione sono sopravvissuti, e solo due dei 40 topi (5%) che hanno ricevuto BDL sviluppato scadenti condizioni generali e sono stati quindi prematuramente sacrificati prima del punto finale programmata dell&#39;esperimento. L&#39;attività di animali sham era senza eccezioni già normale un giorno dopo laparotomia, mentre la maggior parte degli animali sottoposti a BDL hanno mostrato una ridotta attività durante i primi tre giorni. Jpelle aundiced era già evidente in tutti gli animali BDL uno o due giorni dopo l&#39;impostazione del BDL 16. I valori di entrambi alanina aminotransferasi (ALT) e di aspartato transaminasi (AST) che rappresentano markers sierici consolidate di danno epatico aumentano rapidamente e ha raggiunto il picco durante il giorno 7 e il giorno 20 dopo BDL (Tabella 1). Successivamente, ALT e AST sono costantemente diminuiti fino al giorno 30 e sono rimasti stabili fino a 60 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. In linea con l&#39;infortunio colestatica, le concentrazioni sieriche di bilirubina totale sono stati costantemente elevato e ha raggiunto un plateau dopo 7 giorni 16. Decorso simile di attività di ALT e AST sierici sono stati anche segnalati per i ratti sottoposti BDL. In un recente studio è stato dimostrare che AST e ALT livelli aumentati fino a 5 o 10 volte di normale nella prima settimana dopo l&#39;intervento chirurgico BDL e diminuito dopo due settimane 19. In genere, i fegati di animali sham sembrano ancora smooth alla fine dell&#39;esperimento, mentre i fegati di animali che hanno ricevuto BDL mostrano alterazioni architettoniche caratterizzate principalmente dalla formazione di edema e fibrotiche noduli sulla superficie corrispondente fegato e idrope della cistifellea che viene riempito con grandi quantità di bile (Figura 7). Le caratteristiche alterazioni morfologiche del fegato che sono indotte dalla chirurgia BDL sono dimostrabili nella norma analisi istologica (figura 8). Nella stessa serie di esperimenti, lo sviluppo di fibrosi epatica era semi-quantitativamente valutati sulla base istologia epatica valutati da un patologo cieco utilizzando un sistema di punteggio in cui fibrosi periportale stato organizzato 0-4 e fibrosi perisinusoidale 0-2, con un massimo valore che era equivalente a cirrosi di 6. Come previsto, il punteggio di fibrosi media nel gruppo di animali sham era 0.00 ± 0.00. Al contrario, nel gruppo di animali tcappello ricevuto BDL, il punteggio è aumentato costantemente fino al giorno 60 per un valore di 4,83 ± 0,17. È stato raggiunto il massimo di 3 fibrosi periportale al giorno 20. In tutti gli animali analizzati, fibrosi perisinusoidale era assente durante i primi 10 giorni dell&#39;esperimento ed era evidente in primo luogo dopo due settimane. Successivamente, è aumentato costantemente fino alla fine dell&#39;esperimento a valori di 1,8 ± 0,17 (Tabella 1). Anche in diversi altri esperimenti su animali indipendenti che sono state eseguite, si è osservato che la formazione di fibrosi era altamente riproducibile aumento dipendente dal tempo proiezione di espressione collagene intraepatica e la deposizione in conseguenza di fibrogenesi in corso (Figura 9). Analogamente, il processo di fibrogenesi in corso è evidente in elevata espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) che rappresenta un marcatore di cellule fibroblastiche, cioè attivato epatica cellule stellate e miofibroblasti portali,e idrossiprolina epatica, un aminoacido abbondantemente trovato in collagene matrici 18 (Figura 9). Inoltre, l&#39;espressione di vimentina che indica quantità crescenti di miofibroblasti o fibroblasti aumenta dopo l&#39;impostazione della chirurgia BDL 20. La concomitanza di infiammazione in fegati feriti sono ulteriormente riflessa da una maggiore espressione di lipocalina 2 (Lipocalina-2), che è fortemente indotta durante lesioni epatiche acute e croniche e si evolve effetti epato-protettiva durante lesioni epatiche acute 21,22. Cellule infiammatorie che infiltrano i fegati di animali che hanno ricevuto BDL possono essere rilevati mediante colorazione con un anticorpo specifico che è specifico per CD45 (Figura 10). Questo marcatore superficie cellulare che è anche conosciuto come PTPRC (proteina tirosina fosfatasi, tipo recettore) è specificamente espresso in tutte le cellule ematopoietiche differenziate tranne eritrociti e plasmacellule. <table fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot; border = &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo dopo legatura del dotto biliare (giorni) </td><td> Bilirubina totale </td><td rowspan="2"> AST (U / L) </td><td rowspan="2"> ALT (U / L) </td><td rowspan="2"> Fibrosi portale </td><td rowspan="2"> Fibrosi perisinusoidale </td><td rowspan="2"> Punteggio totale </td></tr><tr><td> (Mg / dL) </td></tr><tr><td> 0 (n = 3) </td><td> 0.17 ± 0.06 </td><td> 192,67 ± 30,50 </td><td> 50.33 ± 6.03 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 3 (n = 5) </td><td> 6.85 ± 2.21 </td><td> 1159,25 ± 319,27 </td><td> 566,50 ± 335,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 7 (n = 5) </td> &lt;td&gt; 14.38 ± 2.14 ± </td><td> 976,60 ± 477,16 </td><td> 448,20 ± 259,47 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 10 (n = 5) </td><td> 15.92 ± 2.60 </td><td> 1916,60 ± 868,25 </td><td> 560,40 ± 80.88 </td><td> 1.40 ± 0.25 </td><td> 0.25 ± 0.25 </td><td> 1.67 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 14 (n = 5) </td><td> 17.90 ± 3.84 </td><td> 1088,60 ± 276,32 </td><td> 505,00 ± 96.15 ± </td><td> 2.4 ± 0.25 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 3.40 ± 0.24 </td></tr><tr><td> 20 (n = 4) </td><td> 18.00 ± 2.12 </td><td> 1072,67 ± 364,27 </td><td> 404,00 ± 195,48 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 4.0 ± 0.0 </td></tr><tr><td> 30 (n = 5) </td><td> 16.04 ± 4.79 </td><td> 446,40 ± 169,75 </td><td> 260,20 ± 126,97 </td><td> 2.8 ±; 0.2 </td><td> 1.4 ± 0.25 </td><td> 4.20 ± 0.20 </td></tr><tr><td> 60 (n = 6) </td><td> 16.02 ± 1.19 </td><td> 484,67 ± 117,79 </td><td> 257,17 ± 50.97 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.8 ± 0.17 </td><td> 4.83 ± 0.17 </td></tr></tbody></table> Abbreviazioni utilizzate sono: ALT, alanina aminotransferasi; AST, aspartato aminotransferasi. Tabella 1: Fibrosi aver realizzato in un esperimento rappresentativo I dati di questa tabella è stata riprodotta da uno studio in cui la fibrosi epatica è stata indotta dal condotto biliare legatura in topi C57BL / 6 16.. In questo studio, il tasso di mortalità dopo l&#39;intervento chirurgico BDL era del 5% (2 su 40 animali sono stati prematuramente sacrificati perché alle norme di polizia cattive sviluppati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig1highres.jpg" /> Figura 1: installazione sperimentale per l&#39;esecuzione di una bilecondotto di legatura. L&#39;animale è mantenuto su una piastra di riscaldamento alla temperatura di 37 ° C e la zona operativa è coperta complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Durante l&#39;intervento completo, l&#39;animale è permanentemente collegata ad un sistema di anestesia. Tutte le strumentazioni e soluzioni (analgesici, anestetici, soluzione antisettica, 0,9% NaCl) sono disposti in modo chiaro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Preparazione dell&#39;area chirurgia apertura Prima della cavità peritoneale, la cute addominale deve essere rasato con un rasoio elettrico pelliccia e disinfettato con un tampone di garza antisettica. L&#39;area di intervento viene poi ricoperto con, tende autoadesive impermeabile al fluido. L&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana (~ 2 cm di lunghezza). La cavità è allargata inserendo una sutura tenendo in sterno e l&#39;area funzionamento diffusa dal&#39;inserimento di un divaricatore Colibri permette la sperimentazione senza ostacoli durante l&#39;intervento chirurgico. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig3highres.jpg" /> Figura 3: Esposizione del dotto biliare. (A) Per condurre la legatura del dotto biliare, la parte ventrale del fegato viene sollevato in modo che possa aderire alla membrana e l&#39;ilo epatica diventa chiaramente visibile. (B) Per esporre meglio il dotto biliare, l&#39;intestino viene mosso con caudalmente un batuffolo di cotone inumidito. Il dotto biliare è contrassegnato da una freccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig4highres.jpg" /> Figura 4: legatura del dotto biliare. (A) In una prima fase, il dotto biliare è separato accuratamente dal fiancheggiamento vena porta e l&#39;arteria epatica usando un micro-dentatura pinze. (B) Successivamente, una sutura è disposto intornodotto biliare e fissata con un nodo chirurgico. (C) Successivamente, una seconda sutura è posizionata in prossimità della prima sutura e annodato intorno al dotto biliare. (D) La sutura viene accorciato, la cavità risciacquati con 0,9% di soluzione di NaCl , e tutti gli organi sostituiti alla loro posizione fisiologica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig5highres.jpg" /> Figura 5:.. Rappresentazione precisa di annodatura Per documentare la collocazione delle suture e l&#39;impostazione dei due nodi che impediscono il flusso biliare, la stessa procedura descritta in figura 4 è stata documentata sotto binoculare (A) confinamento del dotto biliare con il (C) confinamento del dotto biliare con la seconda sutura prima sutura. (B) annodamento del primo suture.. (D) Knotting della seconda sutura. (E) a doppia legatura bile dUCT dopo accorciamento delle suture in eccesso. (E &#39;) Questo pannello raffigura uno schizzo di (E). Le posizioni della destra (rl), a sinistra (ll) e mediana (ml) lobi del fegato e del dotto biliare, stomaco e del duodeno sono da lettere. Nello schizzo del dotto biliare è doppia legatura da due punti di sutura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig6highres.jpg" width="400" /> Figura 6:. Anatomia del dotto biliare, vena e arteria epatica nei topi Per una migliore localizzazione anatomica del dotto biliare comune, vena porta e l&#39;arteria epatica sono raffigurati come schema. Contrassegnati sono anche le posizioni di destra (rl), a sinistra (ll) mediana (ml) e le caudato (cl) lobi del fegato. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig7highres.jpg" /> Figura 7: appeara Rappresentantence di fegatini di due settimane dopo l&#39;operazione sham e BDL. C57BL / 6 topi sono stati sottoposti a sham operazione o intervento chirurgico BDL. Dopo due settimane cavità viscerale è stato aperto. Mentre i fegati di animali sham hanno mostrato alcun segno di fibrosi, fegato di animali che ricevono legatura del dotto biliare avevano una struttura superficiale irregolare con formazione di edema e noduli fibrotici sulla superficie di fegati corrispondenti. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig8highres.jpg" /> Figura 8:. Ematossilina eosina macchia sezioni di fegato sono stati preparati da C57BL / 6 di tipo animali selvatici che erano sham-operated (A) o ricevuti BDL per tre settimane (B). Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina seguenti procedure standard. Si prega di notare le alterazioni tipiche nel fegato BDL che includono segni di infiammazione (infiltranti celle), parenchimale (epatocyte) necrosi, e la proliferazione dei dotti biliari. La barra di scala in ogni pannello figura rappresenta 50 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52438/52438fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig9highres.jpg" /> Figura 9: letture istologici e biochimici per fibrogenesi epatica. (A) sezioni di fegato sono stati preparati da animali che hanno ricevuto operazione sham o BDL per 2 settimane e colorate con Sirius Red (pannello superiore, le fibre di collagene in rosso) o analizzati per l&#39;espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) (pannello inferiore , α-SMA cellule positive in marrone) di immunoistochimica. La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 100 micron. (B) Gli estratti proteici da fegati sono stati sottoposti a Western Blot e analizzato per espresfissione di collagene di tipo I, α-SMA, e Vimentin che sono ben marcatori di fibrogenesi epatica stabilito. L&#39;espressione di lipocalin-2 (Lipocalina-2) indica la risposta infiammatoria associata con fibrogenesi in corso. In questa analisi, la parità di proteine ​​di carico è stata dimostrata sondando le macchie con un anticorpo specifico per β-actina. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52438/52438fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig10highres.jpg" /> Figura 10:. Colorazione immunologica di infiltrarsi cellule infiammatorie sezioni di fegato seriali sono state preparate da un fegato di un animale che ha ricevuto condotto biliare legatura per 3 settimane. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (A) o con un anticorpo che è specifico per CD45 (B). Notare che,l&#39;elevato numero di cellule positive CD45 circondano i dotti biliari. Questi infiltrati massicce che indicano l&#39;infiammazione non sono visibili in sezioni di fegato derivati ​​da animali sham (non mostrato). La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 500 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52438/52438fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

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Medicine

52.1K Views.  RWTH Aachen University. Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Video: Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Creation of Reversible Cholestatic Rat Model

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Cholestasis can cause various physiological changes and affect the nutritional status and surgical outcomes. Study of the pathophysiological changes occurring in the liver and other organs is of importance. Various studies have been done in cholestatic rat models.
We used a reversible cholestatic rat model in our recent study looking at the role of methylprednisolone in the ischemia reperfusion injury. Various techniques for creation of a reversible cholestatic model have been described. Creation of a reversible cholestatic rat model can be challenging in view of the smaller size and unique hepatopancreatobiliary anatomy in rats. This video article demonstrates the creation of a reversible cholestatic model.
This model can be used in various studies, such as looking at the changes in nutritional, physiological, pathological, histological and immunological changes in the gastrointestinal tract. This model can also be used to see the effects of cholestasis and various therapeutic interventions on major hepatic surgeries.

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Creation of a reversible cholestatic rat model can be challenging in view of the smaller size and unique hepatopancreatobiliary anatomy in rats. This video article demonstrates the creation of a reversible cholestatic model.

Creazione del Modello reversibile Rat colestatico

Cholestasis is a clinical condition commonly encountered by both surgeons and gastroenterologists. Cholestasis can cause various physiological changes and ...

Ricerca

Medicina

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Biologia dello sviluppo

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Immunologia e infezioni

The Influence of Liver Resection on Intrahepatic Tumor Growth

The high incidence of tumor recurrence after resection of metastatic liver lesions remains an unsolved problem. Small tumor cell deposits, which are not detectable by routine clinical imaging, may be stimulated by hepatic regeneration factors after liver resection. It is not entirely clear, however, which factors are crucial for tumor recurrence.
The presented mouse model may be useful to explore the mechanisms that play a role in the development of recurrent malignant lesions after liver resection. The model combines the easy-to-perform and reproducible techniques of defined amounts of liver tissue removal and tumor induction (by injection) in mice. The animals were treated with either a single laparotomy, a 30% liver resection, or a 70% liver resection. All animals subsequently received a tumor cell injection into the remaining liver tissue. After two weeks of observation, the livers and tumors were evaluated for size and weight and examined by immunohistochemistry.
After a 70% liver resection, the tumor volume and weight were significantly increased compared to a laparotomy alone (p &#60;0.05). In addition, immunohistochemistry (Ki67) showed an increased tumor proliferation rate in the resection group (p &#60;0.05).
These findings demonstrate the influence of hepatic regeneration mechanisms on intrahepatic tumor growth. Combined with methods like histological workup or RNA analysis, the described mouse model could serve as foundation for a close examination of different factors involved in tumor growth and metastatic disease recurrence within the liver. A considerable number of variables like the length of postoperative observation, the cell line used for injection or the timing of injection and liver resection offer multiple angles when exploring a specific question in the context of post-hepatectomy metastases. The limitations of this procedure are the authorization to perform the procedure on animals, access to an appropriate animal testing facility and acquisition of certain equipment.

A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.

L&#39;influenza della resezione epatica sulla intraepatica crescita tumorale

The high incidence of tumor recurrence after resection of metastatic liver lesions remains an unsolved problem. Small tumor cell deposits, which are not ...

Ileectomy-induced Bile Overaccumulation in Mouse Intestine

Intestinal resection is a common therapeutic approach for human diseases such as obesity, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and colon cancer that often results in severe short bowel syndrome-like adverse effects including bile acid diarrhea, dehydration, electrolyte disturbances, and nutrient malabsorption. Here we introduce a murine ileal resection model, termed ileectomy, to evaluate tissue communication and the maintenance of systemic homeostasis. After ileal resection, circulating blood is permanently devoid of the ileum-specific endocrine hormone fibroblast growth factor 15 (FGF15), which releases its endocrinal inhibition of bile acid synthesis in the liver. In combination with the increased production and abolished reabsorption of bile acids after removing the ileum, mice that underwent surgery suffer from bile salt overaccumulation in the intestine and associated diarrhea, morbidity, and mortality. Novel usage of the surgery model introduced in this study may provide mechanistic and functional insights into ileal control of systemic metabolic regulation in physiology and disease.

Small intestine-dependent bile acid reabsorption and feedback inhibition of hepatic bile acid synthesis is important for systemic homeostasis and health. In this study, we describe a mouse model for ileal resection to evaluate ileectomy-induced bile malabsorption, overaccumulation, and toxicity in mouse intestine.

Overaccumulation ileectomy-indotta della Bile nell'intestino del Mouse

Intestinal resection is a common therapeutic approach for human diseases such as obesity, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and colon cancer ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to the complex etiology and unknown pathogenesis, there are still no effective drug treatments. At present, the classic BA mouse model induced by rhesus rotavirus (RRV) is the most commonly used model for studying the pathogenesis of BA. This model is characterized by growth retardation, jaundice of the skin and mucosa, clay stools, and dark yellow urine. The histopathology shows severe liver inflammation and obstruction of the intrahepatic and extrahepatic bile ducts, which are similar to the symptoms of human BA. However, the livers of end-stage mice in this model lack fibrosis and cannot fully simulate the characteristics of liver fibrosis in clinical BA. The presented study developed a novel BA mouse model of chronic liver fibrosis by injecting 5-10 &#181;g of anti-Ly6G antibody four times, with gaps of 2 days after each injection. The results showed that some of the mice successfully formed chronic BA with typical fibrosis after the time lapse, meaning these mice represent a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of BA and a platform for developing future BA treatments.

We established a mouse model of chronic liver fibrosis, which provides a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of biliary atresia (BA) and a platform for future BA treatments.

Un modello murino di fibrosi epatica cronica per lo studio dell'atresia biliare

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Sodium Taurocholate Induced Severe Acute Pancreatitis in C57BL/6 Mice

Biliary acute pancreatitis induction by sodium taurocholate infusion has been widely used by the scientific community due to the representation of the human clinical condition and reproduction of inflammatory events corresponding to the onset of clinical biliary pancreatitis. The severity of pancreatic damage can be assessed by measuring the concentration, speed, and volume of the infused bile acid. This study provides an updated checklist of the materials and methods used in the protocol reproduction and shows the main results from this acute pancreatitis (AP) model. Most of the previous publications have limited themselves to reproducing this model in rats. We have applied this method in mice, which provides additional advantages (i.e., the availability of an arsenal of reagents and antibodies for these animals along with the possibility of working with genetically modified strains of mice) that may be relevant to the study. For acute pancreatitis induction in mice, we present a systematic protocol, with a defined dose of 2.5% sodium taurocholate at an infusion speed 10 &#181;L/min for 3 min in C57BL/6 mice that reaches its maximal level of severity within 12 h of induction and highlight results with outcomes that validate the method. With practice and technique, the total estimated time, from the induction of anesthesia to the completion of the infusion, is 25 min per animal.

Animal models for severe acute pancreatitis enable the study of pathophysiological changes at the initial stage, facilitating observation of the evolution of inflammatory events. Here we provide a protocol for the induction of severe acute biliary pancreatitis by retrograde infusion of sodium taurocholate into the pancreatic duct of anesthetized C57BL/6 mice.

Pancreatite acuta grave indotta da taurocolato di sodio nei topi C57BL/6

Biliary acute pancreatitis induction by sodium taurocholate infusion has been widely used by the scientific community due to the representation of the ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

Riepilogo

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