Name: murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest
Uploaded: 2015-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
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NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali durata della vita e di tutti gli animali e le procedure secondo la Nazionale Guide Consiglio di ricerca per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio 10. 1. Balloon Fabbricazione e ventricolare sinistra Pressure Monitoring Circuit <ol><li> Costruire palloni LV secondo Miller et al. 11 in un bicchiere con un ancoretta, miscelare 9.5 ml di acqua distillata, 14,2 ml di sciroppo di mais luce e 33,8 g di saccarosio, e il calore su un piatto caldo, mescolare fino a quando lo zucchero si scioglie . Continuare soluzione di riscaldamento fino a raggiungere circa 150 ºC. NOTA: esistono numerosi metodi per la costruzione di palloncini BT, tra cui la modifica di consigli preservativo e trasparente pellicola di costruzione 9,12. Troviamo il metodo di cui sopra sia relativamente facile da costruire palloni perdite liberi, ma un vantaggio di aggrapparsi palloncini pellicola comprende caratterizzazione precedente un&#39;adeguata frerelazioni cy-risposta 9. </li><li> Rompere fili di spaghetti secchi in pezzi di circa 5 cm di lunghezza e immergere un lato di ogni pezzo di circa 1 cm di profondità nella soluzione di zucchero e rimuovere lentamente. </li><li> Posizionare la parte secca del filo di pasta in un blocco di schiuma di polistirene e sospendere così il mix di zucchero gocciola verso il basso e forma uno stampo forma a goccia. Lasciare O / N in un essiccatore così stampo indurisce. </li><li> Il giorno seguente, immergere gli stampi in gel di silicone dispersione. Posizionare fili di pasta di nuovo in polistirene blocco di schiuma e il luogo in aa 37 ºC forno per 2 ore o fino a secco. Ripetere questo passaggio una volta di più vengono applicati due strati di silicone. </li><li> Una volta asciutto, posto in acqua per diverse ore per aiutare nella rimozione di pallone dallo stampo. Conservare palloncini in 0,02% soluzione di sodio azide. </li><li> Utilizzare una raccolta di sangue 23 G impostata per produrre una cannula balloon personalizzato tagliando un ago per creare una punta smussata e mettendo tacche nell&#39;ago. </li><li> Collegare il tubo ad una pressione transduttore e sciacquare con acqua mantenendo tubi e cannule completamente sommerse per impedire l&#39;ingresso di aria nel sistema. Posizionare un palloncino che è stato riempito con acqua sulla cannula e utilizzare 2-0 punti di sutura in seta per legare sulla cannula. Prova palloncino capacità di mantenere la pressione (~ 100 mmHg per almeno 1 ora) </li></ol> 2. Preparazione del sistema di perfusione del cuore isolato <ol><li> Inizialmente, lavare e riscaldare il sistema. Accendere un 37 ºC acqua calda bagno circolatore che è stato collegato all&#39;apparato Langendorff, e riempire il serbatoio tampone con acqua distillata. Collegare un nuovo filtro in fibra di vetro dei tubi scorre in apparati e accenda la pompa per scovare il sistema. Durante il tempo di preparazione, il controllo della temperatura dell&#39;acqua espulsa dal blocco Langendorff usando una sonda di temperatura, per garantire che bagnomaria è impostato correttamente. Inoltre, accendere una pompa di circolazione refrigerato e impostare a 20 ° C che verrà utilizzata durante l&#39;arresto cardioplegico del cuore. </li><li> IOn frattempo preparare le seguenti soluzioni. Preparare 1 L di soluzione di cardioplegia (NaCl 110 mM, KCl 16 mM, 16 mM MgCl 2, 1.5 mM CaCl 2, 10 mM NaHCO3) e filtrare. Inoltre, preparare 2 litri di KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,2 mm KH 2 PO 4, 1.7 MgSO mm 4, 2 mM Na-piruvato, destrosio 6 mm 24,9 NaHCO mm 3 (pre-cellulare con il CO 2) , 1.4 mM CaCl 2 (aggiunto ultima). Una volta sciolto, rimuovere precipitati filtrando in un pallone con una lente 5 micron imbuto sinterizzato. Porre un in un piccolo piatto su ghiaccio per essere usato durante la chirurgia e isolamento. </li><li> Ossigenare il perfusato (KHB) con 95% O 2/5% CO 2 per almeno 30 minuti prima dell&#39;uso. Sistema Perfuse Langendorff con KHB per rimuovere eventuale acqua residua dal sistema e tampone serbatoio. Per i topi, impostare la velocità iniziale della pompa a ~ 2,0 ml / min. Mettere 2-0 e 4-0 punti di sutura in seta vicino perfusione cannula. Eseguire la pompa fino a quando il tubo e l&#39;apparecchiatura sono pieni di spiritoh perfusato e garantire la strup bolla è pieno di perfusato. NOTA: per lunghi periodi di perfusione e la funzione stabile si raccomanda di installare un filtro in linea in fibra di vetro (~ 1 micron) nel circuito di perfusione a raccogliere eventuali precipitati che potrebbero costituire la formazione di coaguli nel cuore </li></ol> 3. mouse Chirurgia 3.1) Topo Anestesia e trattare <ol><li> Preparare siringa con la dose di anestetico di 80 mg / kg di ketamina e 5 mg / ml miscela xilazina e aggiungere 0,9% soluzione salina sterile per richiamare il volume di 0,2 ml. Iniettare eparina IP (50 ml di 1.000 U / ml soluzione). </li><li> Posizionare il mouse di nuovo nel contenitore per il trasporto (~ 10-20 min) e attendere che si perda la coscienza come l&#39;eparina ha effetto. Periodicamente fare un pizzico punta a monitorare il dolore riflesso. </li></ol> 3.2) Rimuovere il Cuore <ol><li> Una volta che il mouse è completamente privo di sensi e non risponde a pizzico piedi, fissarla ad un tavolo operatorio adeguato con perni o 25 G<html> puntali attraverso le arti. Eseguire una toracotomia per esporre il cuore. Tagliare un piccolo foro appena sotto lo sterno ed estendere il taglio ai lati del mouse evitando il diaframma. </li><li> Tagliare rapidamente il diaframma e poi rapidamente tagliare i lati della gabbia toracica. Capovolgere indietro la gabbia toracica come una conchiglia per esporre la cavità toracica. Afferrare delicatamente cuore, posizionare sotto le forbici e togliere il cuore. NOTA: E &#39;indispensabile per rimuovere rapidamente il cuore una volta che è esposto nella cavità toracica e polmoni sono non-funzionali. </li></ol> 3.3) Pulire il Cuore <ol><li> Mettere il cuore nel piatto contenente ghiaccio KHB freddo e tagliare eventuali grossi pezzi di tessuto polmonare allegati. Utilizzare pinze a prendere il cuore e individuare l&#39;aorta. Premere delicatamente il cuore e cercare il sangue che viene visualizzata, come questo dovrebbe essere l&#39;estremità aperta dell&#39;aorta. Utilizzare pinzette punta fine di tenere cuore dalla estremità aperta dell&#39;aorta. </li></ol>e &quot;&gt; 4. Montaggio del Cuore, partenza perfusione, e Posizionamento del palloncino 4.1) Montaggio e Cannulating Cuore <ol><li> Prima di trasportare il cuore all&#39;apparato Langendorff, accendere la pompa assicurandosi che la pressione di perfusione è bassa (~ 20 mmHg). Tenere cuore dall&#39;aorta appena sotto la cannula. Utilizzando un altro set di pinzette punta fine, aprire con cautela l&#39;aorta e far scorrere cardiaca sulla cannula. Tenerlo in posizione con una serie di pinzette e poi usare un clip morbido bordi per fissare temporaneamente a cannula. NOTA: montare rapidamente il cuore alla cannula di perfusione è fondamentale per una buona preparazione. Con l&#39;esperienza, le procedure di apertura della cavità toracica fino montare il cuore dovrebbe prendere tra 1 e 2 min. </li><li> Legare e avviare perfusione come segue, con 4-0 sutura di seta aorta sicuro alla cannula direttamente sotto il clip. Assicurarsi che la cravatta è anche intorno alla cannula aortica metallo, così l&#39;aorta non ottenere legati off durante il serraggioil nodo. Una volta che una cravatta è ben posizionato, rimuovere la clip. </li><li> Utilizzare punti di sutura in seta aggiuntivi per fissare l&#39;aorta saldamente alla cannula facendo attenzione a legare sotto i rami dei vasi che possono essere venuta fuori l&#39;aorta. Questi possono spesso essere individuati da perdite perfusato o tiro fuori dall&#39;aorta. NOTA: Durante le fasi iniziali della perfusione del sangue deve essere lavando dal cuore e l&#39;intero cuore dovrebbe apparire di un colore rosa tenue. Decolorazioni scure che non si lavano fuori indicano le aree ischemiche probabilmente a causa di emboli o coaguli di aria e il cuore non deve essere utilizzato. </li></ol> 4.2) Stabilire perfusione e LVP misura <ol><li> Aumentare lentamente la pressione di perfusione e aumentare la velocità della pompa fino a che la pressione di perfusione raggiunge i 70 mmHg. NOTA: la pressione di perfusione standard per il mouse perfusione possono essere 70-90 mmHg, ma devono essere tenuti costanti da un animale all&#39;altro all&#39;interno di un esperimento. </li><li> Pulire il residuo di tessuto (polmone, tiroide ecc) Che potrebbe essere ancora fissato al cuore. Utilizzare le forbici per tagliare gli atri sinistra per creare un&#39;apertura nel ventricolo sinistro. </li><li> Posizionare il palloncino sul supporto e sgonfiare. Posizionare la cannula pallone vicino la cannula aortica, direttamente sopra l&#39;apertura nel ventricolo sinistro. Inserire con cautela pallone verso il basso nel ventricolo sinistro tenendo il cuore in atto in modo aorta non si strappi. </li><li> Una volta che è a posto lentamente inizia a gonfiare il palloncino fino a quando il LVEDP raggiunge ~ 8 mmHg. Posizionare la sonda di temperatura contro il fondo del cuore in modo che misura la temperatura dell&#39;effluente. </li></ol> 4.3) Misura basale <ol><li> Sigillare il cuore in una camicia d&#39;acqua camera di perfusione. Durante questo periodo profumato continuamente il cuore con KHB, e assicurarsi che la temperatura continua a salire. Monitorare la temperatura e regolare il bagno di acqua di conseguenza, fino a raggiungere circa ~ 37 ºC. NOTA: temperat Monitoraggioure nelle fasi iniziali di perfusione è critica come flussi coronariche e successivamente temperatura può variare da cuore a cuore. Temperatura del perfusato effluente viene monitorato per temperature infarto desiderata tramite una sonda di temperatura posta all&#39;apice del cuore. Inoltre, in confronto ad altri protocolli di perfusione Langendorff, cuore non è immerso in CP o KHB durante la perfusione o arresto, questo è fatto principalmente di regolare rapidamente la temperatura, oltre a fornire la consegna CP efficiente senza diffusione. </li><li> Inizia a registrare continuamente misurazione funzionale utilizzando un sistema di acquisizione dati collegato ai sensori appropriati, compresa la pressione di perfusione, pressione ventricolare sinistra (trasduttore di pressione collegato al palloncino LVP), la temperatura, e parametri elettrofisiologici (EKG, MAP se presente) (allegato sarà I fabbricanti e le specifiche ai singoli sensori e sistema di acquisizione dati). Una volta che l&#39;effluente KHB raggiunge ~ 37 ° C per almeno 15<html> min e parametri funzionali cardiaci sono stabili, prendere nota del tempo per misurazioni di riferimento. NOTA: i criteri di inclusione / esclusione vengono applicate a ogni cuore. Un LVDP di &lt;60 mmHg al basale indica un cuore che deve essere rimosso dall&#39;analisi. Inoltre, il flusso coronarico&gt; 4,5 ml / min, o l&#39;incapacità di mantenere la pressione di perfusione al basale probabilmente indica una perdite o dell&#39;aorta strappati. Anche eventuali cuori che hanno chiare le aree ischemiche che possono essere confermati visivamente (ad esempio, coagulo) o riduzioni di ischemia associata espositive della funzione cardiaca (ad esempio, l&#39;aumento LVEDP, estremamente aritmici) vengono rimossi dall&#39;analisi. </li><li> Misurare flusso coronarico mediante raccolta dell&#39;effluente coronaria in un cilindro graduato per 1 min. Chiudere la camera e consentire la temperatura e la funzione di ritorno ai valori basali. Alternativamente misurare il flusso coronarico continuo nella linea di perfusione con una sonda di flusso posto dopo il circuito di scarico della pressione. </li></ol>&quot;&gt; 5. Avvio cardioplegica arresto <ol><li> Mettere 100 ml di tampone cardioplegia fredda in un altro serbatoio e. trasferire il serbatoio cannula KHB al serbatoio cardioplegia. </li><li> Staccare il corpo rivestito acqua e il circuito di riscaldamento di perfusione dal bagno di acqua calda e connettersi al circolatore refrigerato utilizzando tubi sgancio rapido. Utilizzare circolatori di riscaldamento e raffreddamento separati per consentire rapidi cambiamenti di temperatura del cuore e perfusato. </li><li> Seguire la bolla d&#39;aria che viene introdotto nel tubo durante la commutazione, e una volta raggiunta vicino al cuore isolato avviare la temporizzazione per cardioplegia. Consegnare cardioplegia per 2 minuti. Dopo la dose iniziale di fermare la pompa. Assicurarsi di arrestare cuore in diastole ed essere vicino alla temperatura desiderata CP. NOTA: Una trappola bolla sufficiente è necessario per evitare emboli aria nel cuore. In alternativa un sistema di erogazione per entrambi i serbatoi commutate da un rubinetto può essere facilmente costruito, tuttavia troviamo seguirezione la piccola bolla d&#39;aria che viene introdotto quando cambi la cannula tra bacini, un metodo facile di tempistiche di consegna, CP dato potenzialmente differenti velocità della pompa tra esperimenti (ad esempio, a causa di topo / ratto, pressione di perfusione, resistenza del filtro, ecc.) </li><li> Mantenere il cuore in cardioplegia per 2 ore a ~ 20 ° C. Ogni mezz&#39;ora durante CP accendere la pompa nuovamente per 1 minuto in modo da un&#39;altra dose viene somministrata. NOTA: dosi intermittenti di CP ogni 30 min comporta compromissione funzionale del cuore, senza la necrosi del tessuto. Periodi più lunghi tra le dosi di CP (cioè,&gt; 45 min) possono provocare necrosi e contrattura ischemica e sarebbe più appropriato per un modello di danno necrotico associato con ischemia non protetto. </li></ol> 6. riperfusione <ol><li> Alla fine del CP, trasferire la cannula serbatoio indietro al ossigenato KHB. Collegare i circuiti di controllo della temperatura per il circolatore riscaldamento e spegnere la pompasu per iniziare riperfusione. A questo punto la cardioplegia lava fuori, osservare l&#39;aumento di temperatura e il cuore inizia a battere dopo 2-4 minuti di riperfusione. Quando il cuore inizia a battere il cuore è lento e spesso aritmica. NOTA: di solito non è un grande aumento diastolica LVP (vale a dire, ≤10 mmHg aumento), che spesso è caratteristico in modelli di ischemia puri. Le aritmie possono persistere anche nel riperfusione e di tanto in tanto il cuore dovranno essere defibrillato. Ciò può essere ottenuto con l&#39;uso di un insieme stimolatore a tensioni superiori (~ 10-50 V) ed elettrodi posti alla base e apice del cuore. </li><li> Lasciare cuore per reperfuse per 30 minuti, e durante questo periodo di tempo prendere misure di flusso coronarico come necessario. Misurare il flusso coronarico raccogliendo l&#39;effluente con un cilindro graduato per 30-60 secondi. </li></ol> 7. Raccolta Tissue <ol><li> Sgonfiare il palloncino e rimuoverlo dal ventricolo sinistro. Prendete il cuore fuori dalcannula e si pesa. In esperimenti iniziali, almeno una porzione trasversale del cuore dovrebbe essere presa e TTC macchiato valutare la necrosi per garantire che il cuore è libero di lesioni necrotiche. </li><li> Raccogliere le fette di cuore per gli studi di microscopia, pesi wet / dry, ecc Il resto o tutto il cuore dovrebbe essere rapidamente congelati mettendo in azoto liquido. Conservare cuori congelati in un freezer -80 ° C. NOTA: Per la misurazione di composti fosfato ad alta energia (cioè, l&#39;ATP, fosfato creatina), il cuore deve essere congelato immediatamente. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

I particolari del protocollo precedenti metodi per valutare stunning miocardico secondario all&#39;ischemia globale associato con l&#39;arresto cardioplegic. Nelle nostre mani questo protocollo produce un approssimativo ~ riduzione del 40% della funzione cardiaca (LVDP, +/- dP / dt) con modifiche minime della frequenza cardiaca al 30 min punto tempo di post-riperfusione. Mentre il cuore è riperfuso e rewarmed tutti i parametri di funzionalità cardiaca sono ridotte in momenti iniziali con una frequenza cardiaca molto ridotto prima di stabilizzarsi tra 20 e 30 minuti. Flusso coronarico è generalmente aumenta notevolmente durante la prima riperfusione causa di iperemia, e poi cade a ~ 20-30% in meno rispetto ai livelli di controllo seguenti 30 min di riperfusione. E &#39;importante ricordare che stunning miocardico, per definizione, dovrebbe lasciare il cuore libero di morte cellulare e necrosi, che è caratteristica di ischemia puro / modelli MI (cioè,&gt; 20 min senza ischemia regionale di flusso). Gli studi iniziali dovrebbero valutare Histol tessutogia per garantire una mancanza di lesioni necrotiche. Inoltre, anche se stunning miocardico, per definizione, dovrebbe tradursi in funzione normale dopo riperfusione prolungata (ore o giorni), è probabile che questo protocollo non sarà dimostrare pienamente recuperato funzione a causa della ex vivo Langendorff perfusione che è associato con reductons della funzione cardiaca in controllo cuori perfusi nel tempo. Tuttavia cambia nel recupero della funzione cardiaca acuta in assenza di morte cellulare / necrosi può essere utilizzato come indici di gravità di stordimento La principale differenza in questo protocollo vs. protocolli classici ischemia no-flusso è l&#39;uso di una strategia cardioprotezione, in questo caso è cardioplegia hyperkalemic. Le soluzioni cardioplegia hyperkalemic proteggono da lesioni necrotiche e la morte cellulare, provocando l&#39;arresto cardiaco diastolico. Arresto diastolica del cuore favorisce la conservazione delle riserve energetiche. Inoltre, i protocolli di cardioprotezione usati clinicamente più utilizzano ipotermia a ulteriormente limit danno miocardico riducendo la domanda metabolica. Altri fattori che possono essere modulate durante il protocollo di cui sopra comprendono diverse formulazioni di soluzioni cardioplegia (formulazioni iperpolarizzanti, Mg ++, K + livelli, etc.), le strategie (caldo contro il freddo, &#39;Hot Shot&#39;, etc.), e vari farmaci (chinasi inibitori, modulatori canali ionici, agenti cardioprotettivo, etc.). Poiché il cuore è in uno stato relativamente ben protetta, per ottenere menomazioni funzionali riproducibili in questo modello richiede necessariamente tempi di ischemia più lunghi (cioè, maggiore di 2 hr). Abbiamo scoperto che il cuore roditori sono relativamente resistenti al danno in questo modello, soprattutto se confrontato con i più grandi animali (suini, umani) che mostrano in modo affidabile miocardio stordito durante i periodi molto più brevi (ad esempio, 30 min). Abbiamo anche scoperto che la consegna intermittente è necessario per proteggere il cuore da un grave danno ischemico in 45-60 minuti intervallo folloala consegna CP può provocare la disfunzione diastolica lordo, contrattura ischemica, e lesione dei tessuti su riperfusione. Altri componenti facilmente adattabili del protocollo possono includere indagini relative ai componenti CP e il ruolo di ipo / arresto normotermica così come le strategie di cattura diverse non prive di autonomia K + (bloccanti dei canali Na, agenti iperpolarizzanti) 3. Ci sono anche una serie di importanti limitazioni a questa tecnica quando viene usato per modellare stordimento associati con chirurgia cardiaca clinica. In primo luogo, la maggior parte al lordo delle soluzioni CP clinici sono mescolati con il sangue (~ 4 sangue: 1 ratio CP). Questo non è generalmente fattibile in topi a causa del volume circuiteria perfusione nonché la necessità di tubi trattati e da fibra ossigenatori. Spesso per gli animali più grandi (cavie / conigli) animali donatori dovrebbero anche essere richiesto. Inoltre, come in tutti i modelli di organi isolati, l&#39;influenza dei fattori periferici (cioè, segnali infiammatori, re sangueperfusione, ecc) viene completamente ignorato. Tuttavia si tratta di un modello pratico, efficiente ed economico per gli studi preliminari per testare gli additivi farmacologici e strategie cardioprotezione differenti. Il protocollo è essenzialmente la stessa in cuori di ratto, con l&#39;eccezione di un palloncino grande e aortica cannula 13,14. Inoltre, ratto preparato cuore richiede portate significativamente maggiori (12-20 ml / min). Grazie alle sue dimensioni, il ratto di preparazione cuore è molto più facile da imparare e riproducibile eseguire. Per valutare altri tipi di lesioni con conseguente infarto mozzafiato il protocollo può essere facilmente modificata. Per emulare reversibili danno ischemico, fermare semplicemente la pompa di perfusione per brevi periodi. Nei ratti ~ 20 min di ischemia globale si tradurrà in funzione contrattile ridotta senza effetti lordi morte cellulare e infarto.

Miocardico stordimento è definito come reversibile attività contrattile ridotto nonostante il ripristino di un adeguato flusso di sangue dopo un breve periodo di ischemia o periodi prolungati di insulti ischemici con cardioprotezione 1,2,3,4,5. Il metodo presentato è specificamente utilizzato per modellare clinicamente rilevanti insulti ischemici che possono provocare alterazioni reversibili in funzione contrattile (vale a dire, gli insulti ischemici associati alla chirurgia cardiaca utilizzando arresto cardioplegico, brevi periodi di ischemia, angina, ecc). In contrasto con gli studi di ischemia gravi (infarto miocardico, necrosi) questo protocollo è stato sviluppato per valutare il recupero funzionale del miocardio e cardioprotezione senza danno tissutale, rimodellamento, e la morte cellulare. La maggior parte della carta discute un protocollo standard arresto cardioplegic con elementi simili a un cardiochirurgia utilizzando ipotermia e consegna cardioplegia intermittente. Prot miocardicaezione durante la maggior parte di interventi chirurgici cardiaci si basa su cardioplegia e bypass cardiopolmonare. Sebbene cardioplegia soluzioni e strategie (CP) sono molto variabili (sangue, crystalloid, freddo, caldo, ecc) gli elementi più comuni sono 1) iperkaliemia e / o altre strategie per arrestare il cuore in diastole, limitando così l&#39;utilizzo di energia derivante dalla contrazione del miocardio, e 2) l&#39;ipotermia per rallentare il metabolismo e aiutano a mantenere ATP e altre riserve di energia mentre arrestato. Le soluzioni cardioplegia attuali offrono protezione per il cuore contro gli insulti ischemici che altrimenti rivelarsi letale. Tuttavia, le strategie cardioprotettivi durante insulti ischemici chirurgici non sono perfetti, e la conseguente lieve danno ischemico può provocare reversibile disfunzione contrattile cardiaca nonostante un adeguato flusso di sangue (stunning miocardico), l&#39;acidosi, danni cardiomiociti, e gli effetti vascolari, tra cui ridotta perfusione coronarica e vasospasmo. Questo protocollo è diversoda modelli standard di ischemia cardiaca isolati valutazione infarto miocardico e ischemia grave in quanto valuta più lievi insulti ischemici che può portare a insufficienza cardiaca seguente breve ischemia o insulti ischemici associati con l&#39;arresto cardioplegic. (Per la revisione sulle tecniche di perfusione Langendorff e I / studi R vedi 6-8). Per linee guida generali e un&#39;analisi approfondita dei parametri sperimentali connessi con il mouse isolato cuori perfusi vedere Sutherland e t al., 2003 9 La tecnica qui presentata dettagli l&#39;attrezzatura necessaria, reagenti, gradini, strategie e suggerimenti per indurre affidabile mozzafiato in cuori del mouse. Modifiche minori sono necessarie per applicare la tecnica a ratti. Brevemente cuori isolato mouse sono Langendorff perfusi per circa 30 minuti con fisiologica tampone Krebs-Henseleit (KHB), seguiti da freddo protetta arresto cardiaco mediante consegna di un hypotherm hyperkalemicsoluzione cardioplegia ic. Dopo l&#39;arresto, il recupero funzionale cardiaca viene monitorato nel corso rewarming e riperfusione del cuore con KHB. Le variazioni del grado di recupero della funzione contrattile cardiaca può essere valutata per valutare agenti cardioprotettivi e strategie cardioprotezione differenti.

<table><tbody><tr><td>Cardioplegia Solution (St Thomas II)</td><td></td><td></td><td>Symbol / Concentrations (mM)</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td>NaCl; 110</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td></td><td></td><td>KCl; 16</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.5</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td></td><td></td><td>MgCL2; 16</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 10</td></tr><tr><td>Krebs-Heinslet Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td>NaCl; 118</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td></td><td></td><td>KCl; 4.8</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td></td><td></td><td>MgSO4; 1.7</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 24.9</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (monobasic)</td><td></td><td></td><td>KH2PO4; 1.2</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.4</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td></td><td></td><td>Na pyruvate; 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>C6H12O6; 6</td></tr><tr><td>Balloon reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corn Syrup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spaghetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon Dispersion Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>styrofoam block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab oven/incubator ( 50C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langendorff Perfusion equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water circulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooling water circulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump capable of 2-30 ml/min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline perfusion filters - 1 um glass fiber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small graduated cylinder (~10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfusion resevoir (1L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cardioplegia resevoir (~200 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gas bubbler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95/5 O2/CO2 mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical tools and reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum and Potz surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>two Dumont size 5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xylazine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silk 2-0 and 4-0 sutures</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest

Il protocollo seguito è utile per valutare la funzione cardiaca compromessa o miocardiche splendida seguenti moderati insulti ischemici. La tecnica è utile per modellare danno ischemico associato con numerosi fenomeno clinicamente rilevanti tra cui la chirurgia cardiaca con arresto cardioplegica e bypass cardiopolmonare, CABG off-pump, trapianto, angina, breve ischemia, ecc. Il protocollo presenta un metodo generale per modellare ipotermico arresto cardioplegico hyperkalemic e riperfusione nei cuori roditori concentrandosi su misura della funzione contrattile miocardica. In breve, un cuore mouse è perfuso in modalità Langendorff, strumentato con un palloncino intraventricolare, e parametri funzionali cardiaci di base sono registrate. Dopo la stabilizzazione, il cuore è quindi soggetta a brevi infusione di una soluzione cardioprotettivo cardioplegia ipotermico di avviare arresto diastolica. Cardioplegia viene consegnato in modo intermittente su 2 ore. Il cuore è quindi riperfuso e warmed a temperature normotermici e recupero della funzione miocardica è monitorata. L&#39;uso di questo protocollo si traduce in affidabilità funzione contrattile cardiaca depressa esenti da danni ai tessuti del miocardio lordo nei roditori.

La Figura 1 presenta i risultati tipici da un esperimento del mouse. LVP (linea rossa), dP / dt (linea verde), e la temperatura (linea viola) sono state continusouly registrato oltre ~ 3 ore. Lettere indicano un - misurazione di base, b, c, d, e - consegna di soluzione cardioplegia, f - inizio della riperfusione, g, h, i, j - misurazione del flusso cornary durante la riperfusione. Nota, LVDP depresso e dP / dt su riperfusione rispetto al basale. Figura 1B include i dati da un registrato oltre ~ 2 sec. Si noti, la diminuzione del LVP e dP / dt simile ad A, lievi riduzioni di risorse umane e lievi aumenti LVEDP. Solitamente dopo 30 min di riperfusione c&#39;è una diminuzione ~ 40% in funzione cardiaca come evidenziato dal ventricolo sinistro LVDP pressione sviluppata illustrato nella Figura 1C. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52433/52433fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentante risultatos di un intero esperimento. (A) di registrazione pressione ventricolare sinistra (in alto), derivata prima di pressione LV, e la temperatura. (B) le registrazioni intervalli brevi per vedere i dettagli traccia e (C) Quantificazione del ventricolo sinistro pressione sviluppata (LVDP) per esperimenti multipli (n = 6). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52433/52433fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murino Isolato Cuore modello di infarto stordimento associati con arresto cardioplegica

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K Views.  Brown University. The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

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Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused by whole-body hypoperfusion.5,6 Successful reproduction of whole-body hypoperfusion in rodent models has been fraught with 
difficulty.7-9,9,10 Models which employ focal ischemia have repeatedly demonstrated results which do not translate to the clinical setting, and larger 
animal models which allow for whole body hypoperfusion lack access to the full toolset of genetic manipulation possible in the mouse.11,12 However, in recent 
years a mouse model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation has emerged which can be adapted to model AKI.13 This model reliably reproduces 
physiologic, functional, anatomic, and histologic outcomes seen in clinical AKI, is rapidly repeatable, and offers all of the significant advantages of a murine surgical 
model, including access to genetic manipulative techniques, low cost relative to large animals, and ease of use. Our group has developed extensive experience 
with use of this model to assess a number of organ-specific outcomes in AKI.14,15

A powerful model for perioperative and critical care related acute kidney injury is presented. Using whole body hypoperfusion induced by cardiac arrest it is possible to nearly replicate the histologic and functional changes of clinical AKI.

Normotermico arresto cardiaco e rianimazione cardiopolmonare: un modello murino di ischemia-riperfusione

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

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A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

A Murine chiuso del torace modello di ischemia miocardica e riperfusione

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

La conferma di ischemia miocardica e riperfusione nei topi mediante il rilievo della superficie elettrocardiografia

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Un modello murino per studiare la fisiologia del cervello durante l'arresto cardiaco

Mouse Cardiac Arrest Model for Brain Imaging and Brain Physiology Monitoring During Ischemia and Resuscitation

Most cardiac arrest (CA) survivors experience varying degrees of neurologic deficits. To understand the mechanisms that underpin CA-induced brain injury and, subsequently, develop effective treatments, experimental CA research is essential. To this end, a few mouse CA models have been established. In most of these models, the mice are placed in the supine position in order to perform chest compression for cardiopulmonary resuscitation (CPR). However, this resuscitation procedure makes the real-time imaging/monitoring of brain physiology during CA and resuscitation challenging. To obtain such critical knowledge, the present protocol presents a mouse asphyxia CA model that does not require the chest compression CPR step. This model allows for the study of dynamic changes in blood flow, vascular structure, electrical potentials, and brain tissue oxygen from the pre-CA baseline to early post-CA reperfusion. Importantly, this model applies to aged mice. Thus, this mouse CA model is expected to be a critical tool for deciphering the impact of CA on brain physiology.

Autore in primo piano: un modello murino unico di arresto cardiaco indotto da asfissia 

This protocol demonstrates a unique mouse model of asphyxia cardiac arrest that does not require chest compression for resuscitation. This model is useful for monitoring and imaging the dynamics of brain physiology during cardiac arrest and resuscitation.

Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

Most cardiac arrest (CA) survivors experience varying degrees of neurologic deficits. To understand the mechanisms that underpin CA-induced brain injury ...

Neuroscienze

Improved Rodent Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence suggests that thrombolytic therapy or primary percutaneous coronary intervention (PPCI) does not prevent reperfusion injury. There is still no ideal animal model for MIRI. This study aims to improve the MIRI model in rats to make surgery easier and more feasible. A unique method for establishing MIRI is developed by using a soft tube during a key step of the ischemic period. To explore this method, thirty rats were randomly divided into three groups: sham group (n = 10); experimental model group (n = 10); and existing model group (n = 10). Findings of triphenyltetrazolium chloride staining, electrocardiography, and percent survival are compared to determine the accuracies and survival rates of the operations. Based on the study results, it has been concluded that the improved surgery method is associated with a higher survival rate, elevated ST-T segment, and larger infarct size, which is expected to mimic the pathology of MIRI better.

Myocardial ischemia-reperfusion model of rat heart is improved by using a self-made retractor, polyvinyl chloride tube, and a unique knotting method. Electrocardiogram, triphenyltetrazolium chloride and histological staining, and percent survival analysis results showed that the improved model group has higher success and survival rates than the already existing model group.

Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), induced by coronary heart disease (CHD), causes damage to the cardiomyocytes. Furthermore, evidence ...

Murino Isolato Cuore modello di infarto stordimento associati con arresto cardioplegica

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Normotermico arresto cardiaco e rianimazione cardiopolmonare: un modello murino di ischemia-riperfusione

A Murine chiuso del torace modello di ischemia miocardica e riperfusione

La conferma di ischemia miocardica e riperfusione nei topi mediante il rilievo della superficie elettrocardiografia

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Un modello di criolesionismo per studiare l'infarto miocardico nel mouse

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

Modello murino di arresto cardiaco per l'imaging cerebrale e il monitoraggio della fisiologia cerebrale durante l'ischemia e la rianimazione

Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione