Name: isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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Gli autori desiderano ringraziare James Oesterling per citometria a flusso assistenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del US National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) e una sovvenzione US National Institutes Postdoctoral formazione (5T32CA009035-37, LWY).

L&#39;uso di animali in questo protocollo è stata effettuata in conformità con le procedure approvate dal Cancer Center Animal Care and Use Committee Fox Chase. 1 preparazione di strumenti, soluzioni e coprioggetto <ol><li> Pulire i due set di # 5 pinza sottile, un set di 7 # pinze curve sottili, una grande forbice chirurgica, una forbice microdissecting, una spatola e un cucchiaio forato. Mettere gli strumenti in un sacchetto di sterilizzazione autosigillante e autoclave. Mantenere gli strumenti in sacchetto fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione di agarosio temperatura 3% basso punto di fusione. <ol><li> Aggiungere 1,5 g di agarosio in 50 ml di sterile Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) poi posizionare in forno a microonde e fino alla comparsa di bolle. Pallone Swirl e riscaldare fino a quando tutti agarosio è sciolto. Mescolare la soluzione con una ancoretta prima del riscaldamento, se appaiono grumi. </li><li> Conservare la soluzione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per conten-lungo terminee, conservare la soluzione di agarosio per uso futuro a temperatura ambiente oa 4 ° C per mesi. Riscaldate in forno a microonde per liquefare. Per il riscaldamento ripetuto della soluzione di agarosio, pesare il pallone prima di riscaldare per mantenere il suo peso iniziale con acqua distillata sterile tiepida. </li></ol></li><li> Preparare le seguenti soluzioni basate papaina-dissociazione cella come descritto in precedenza 2: <ol><li> Una soluzione di papaina con papaina (100 U / ml), cisteina (0,2 mg / ml) e DNasi (250 U / ml) in fenolo sterile rossi contenenti DPBS. </li><li> Una soluzione ovomucoid con albumina di siero bovino (BSA; 8 mg / ml), inibitore di tripsina di soia (8 mg / ml)) e DNasi (250 U / ml) in fenolo sterile rossi contenenti DPBS. Filtro sterilizzare entrambe le soluzioni e regolare il pH a restituire il colore originale di rosso fenolo contenenti DPBS. </li></ol></li><li> Preparare mezzi di coltura cellulare (NB / B27): integrare i media basale con 1 mM di sodio piruvato, 2 mM L-glutammina, 1% di penicillina-streptomicina (P / S) e B27 supplemento. Filter sterilizzare e proteggere dalla luce. Equilibrare i media a 37 ° C e 5% di CO 2 prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare tampone FACS: 5% di siero fetale bovino (FBS) in DPBS. Aggiungere 2,5 ml di FBS 47,5 ml DPBS. </li><li> Preparare poli-D-lisina (PDL) coprioggetto Rivestiti. <ol><li> Autoclave nuovi vetrini. </li><li> Cappotto i coprioggetti con PDL (100 mcg / ml in acqua distillata sterile) e incubare per 2 ore a 37 ° C oa temperatura ambiente per una notte. </li><li> Lavare coprioggetto con acqua distillata sterile. Lavare una volta con NB / B27 media. Lasciate asciugare completamente coprioggetto in cappa coltura tissutale prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2 dissezione e preparazione di fette di tessuto <ol><li> Il giorno della dissezione, pulire l&#39;area dissezione con etanolo al 70% e la copertura con un tampone assorbente. </li><li> Rimuovere strumenti di dissezione dal sacchetto di sterilizzazione. Aggiungere ghiaccio freddo, DPBS sterile / 1% P / S a una piccola scatola di Petri e posto sul ghiaccio. </li><li> Decapitare P4 Math1-GFP / Nestin-CFP cuccioli di topo con grandi forbici chirurgiche poi tenere la testa in giù con pinze curve sottili. Togliere la pelle e rimuovere delicatamente il cranio con 5 # pinza sottile con una spatola poi scavare il cervello dal cranio e trasferirlo alla piastra di Petri contenente DPBS / 1% P / S. <ol><li> Uso # 5 pinza sottile, separare accuratamente il cervelletto dal resto del cervello. Assicurati di sezionare un cucciolo alla volta il più rapidamente possibile. </li><li> Raccogliere un minimo di 8 cerebella al fine di ottenere sufficienti NEP per analisi molecolari e funzionali. </li></ol></li><li> Riempire uno stampo embedding misura 2 x 2 x 2 cm con 3% soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione. Assicurarsi che la temperatura di agarosio non è più di 37 ° C. </li><li> Rimuovere il liquido in eccesso dal cervelletto tamponando delicatamente su un tessuto di laboratorio. Inserire cervelletto in stampo in posizione verticale. Mettere lo stampo sul ghiaccio per consentirgli di solidificare rapidamente. Utilizzare ~ 4 cerebella per blocco. </li><li> Ottenere lisezioni di tessuto Ving con lama vibratome vibrante. Trim-cerebella blocco contenitore di agarosio con una lama di rasoio. Incollare il blocco di agarosio al piatto vibratome con cerebella orientato in posizione verticale. </li><li> Riempire il vassoio del vibratome con ghiaccio-freddo DPBS sterile / 1% P / S e posto sotto ghiaccio. <ol><li> Tagliare 600 micron sezioni attraverso tutta la lunghezza del cervelletto. Raccogliere sezioni dal vassoio di ghiaccio con un cucchiaio forato. Posizionare le sezioni in una capsula di Petri riempita con DPBS / 1% P / S sul ghiaccio. </li></ol></li></ol> 3. Microdissezione e dissociazione cellulare <ol><li> Porre la capsula di Petri contenente fette di tessuto con un microscopio a fluorescenza dissezione. <ol><li> Separare con cautela la EGL dal resto della sezione cerebellare utilizzando una pinza sottile sezionando tra lo strato PCP + molecolare e la GFP + EGL (vedi linea tratteggiata in figura 1). Fare attenzione a non includere alcuna parte del livello molecolare, che si tradurrà incontaminazione del-Nestin esprimere Bergmann glia. </li><li> Completare questo passaggio il più rapidamente possibile e mantenere il tessuto in ghiaccio per evitare la morte delle cellule. </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio circonda il tessuto prima di procedere alla fase successiva. </li></ol></li><li> Digerire il tessuto EGL microdissezione utilizzando un protocollo basato papaina, come precedentemente descritto 2 per ottenere una sospensione di cellule singole. <ol><li> Risospendere le cellule in tampone FACS per la raccolta di cellule CFP-positivi tramite FACS. </li></ol></li></ol> 4. cellulare Ordinamento e placcatura <ol><li> Cellule Ordina per PCP fluorescenza utilizzando una sterile, flusso ad alta velocità citometro contenente un filtro PCP appropriato e raccogliere le cellule in tampone FACS su ghiaccio. Ottenere circa 100.000 NEP di ogni cervelletto P4. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Utilizzare immediatamente le cellule per l&#39;analisi molecolare o cultura per ulteriori sperimentazioni. </li><li> Per le cellule di coltura, risospendere le cellule in pre-riscaldato NB / B27 media e piastra su vetrini PDL rivestite come precedentemente descritto 2. </li></ol>

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	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. 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M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo microdissezione qui descritto è il primo procedimento in grado di isolare una popolazione pura di cellule viventi per uso nelle analisi molecolari e funzionali. Come dimostrato da Li et al. 9, NEP ottenuti con tale metodo può essere coltivato e incorporati in vari esperimenti e per la loro elevata purezza, possono essere utilizzati anche per analisi microarray. E &#39;molto importante prendersi il tempo per diventare esperti con questa tecnica microdissezione. NEP si trovano nella regione profonda del EGL molto vicino al livello molecolare, in cui-Nestin esprimendo Bergmann glia potrebbe contaminare l&#39;isolamento delle cellule NEP e compromettere la purezza. Microdissezione dovrebbe quindi essere fatto in modo conservativo per assicurarsi che le cellule contaminanti nei tessuti adiacenti non sono inclusi. Il principale vantaggio della tecnica microdissezione qui descritta è la possibilità di ottenere cellule viventi che possono essere coltivate per further sperimentazione. Per questo motivo, è fondamentale che tutti i passaggi durante questa procedura essere eseguite rapidamente e che il tessuto tenuti in ghiaccio il più possibile. Inoltre, tutti gli strumenti e reagenti devono essere sterili. Seguendo questi passaggi si riduce la morte cellulare e la contaminazione coltura cellulare. Inoltre, il montaggio cerebella multipla per blocco di agarosio sarà di aiuto nel ridurre il tempo di procedura. Questa tecnica non è limitato a isolamento di NEP e può essere utilizzato per raccogliere cellule da altre aree del cervelletto, come le cellule gliali dallo strato molecolare e cellule staminali neurali dalla sostanza bianca. Accanto al cervelletto, microdissezione può essere utilizzato con altri tessuti che contengono regioni riconoscibili, come l&#39;ippocampo, per esempio. L&#39;uso di transgeni fluorescenti, come utilizzato qui, può aiutare nella creazione di confini o di identificare le regioni per la dissezione, che può essere particolarmente utile nei tessuti che mancano aree facilmente identificabili e che non sarebbero altrimenti in grado di essere microdissected. Questa tecnica potrebbe quindi aiutare a purificazioni cellulari in una vasta gamma di aree di ricerca e delle applicazioni.

Il cervelletto è costituito da più strati di cellule, ciascuna contenente tipi cellulari distinti. Durante lo sviluppo, la EGL contiene proliferazione dei precursori neuronali dei granuli (PNL), mentre lo strato molecolare e strato di Purkinje contengono Bergmann glia e neuroni di Purkinje, rispettivamente. Nel profondo del cervelletto si trova la sostanza bianca, che contiene le cellule staminali neurali (NSC) e oligodendrociti 1. Sonic hedgehog (Shh) svolge un ruolo critico nella regolazione dello sviluppo cerebellare e, in particolare, promuove la proliferazione di PNL tramite legame al suo recettore Patched (Ptc), un regolatore negativo di Shh segnalazione 2-4. L&#39;attivazione aberrante di segnalazione Shh genera medulloblastoma (MB), il tumore cerebrale maligno più comune nei bambini 5,6. Ptc MB mutanti modelli di topi transgenici sono strumenti potenti per lo studio di MB e si sviluppano i tumori che assomigliano MB umano 7,8. L&#39;utilizzo di questitopi, si è scoperto che PNL sono la cellula di origine per riccio di tipo MB 7. Inoltre, oltre al PNL, abbiamo recentemente identificato una popolazione unica di progenitori neuronali all&#39;interno EGL del cervelletto sviluppo che può anche dar luogo a MB. Queste cellule esprimono alti livelli di tipo VI, proteina dei filamenti intermedi, Nestin, e sono chiamati NEP 9. NEP si trovano all&#39;interno della parte profonda della EGL ed esistono transitoriamente solo durante lo sviluppo cerebellare neonatale. Essi si sono impegnati per la linea cellulare dei granuli come PNL, ma sono distinte come sono quiescenti e non esprimono Math1, un marker ben consolidata per la PNL convenzionali 10. Inoltre, NEP danno luogo a MB più efficiente rispetto PNL dopo l&#39;attivazione della via di segnalazione Shh 9, che li un romanzo origine per MB tumorigenesi fa. Abbiamo già NEP dalla cerebellare EGL isolati al giorno postnatale 4 (P4) con la tecnica microdissezionedescritto qui 9. Microdissezione tramite la visualizzazione microscopica diretta del tessuto permette di specifico dissezione del cerebellare EGL. Questo è necessario in quanto Nestin viene espressa anche dal NSC nella sostanza bianca cerebellare e da Bergmann glia nello strato molecolare 1,7,11,12 ed era fondamentale che queste cellule non essere inclusi, come avrebbero confondere l&#39;analisi. Le cellule isolate dal tessuto microdissezione possono essere utilizzati immediatamente per l&#39;analisi molecolare oppure possono essere coltivati ​​per ulteriori applicazioni. Per aiutare in modo specifico microdissecting la EGL e per purificare ulteriormente NEP, topi Math1-GFP (green fluorescent protein) sono stati incrociati con topi Nestin-CFP (proteina fluorescente ciano). Il fattore di trascrizione Math1 è specificamente espresso da PNL e l&#39;espressione della GFP è chiaramente visibile nella EGL 9,13. Topi Nestin-PCP esprimono una forma nucleare di PCP e possono essere facilmente visualizzati nello strato molecolare 9,14. Insieme, GFP e di espressione CFP creano confini per microdissezione del EGL (vedi Figura 1). NEP CFP-positivi sono stati poi isolati da FACS, dopo dissociazione enzimatica delle EGLS sezionati. Attualmente, il metodo più ben utilizzato per isolare le cellule dal EGL è Percoll centrifugazione in gradiente di tutto il tessuto cerebellare 15,16. Questo metodo, tuttavia, è in grado di escludere completamente popolazioni di cellule nestina + dal livello molecolare e la materia bianca e pertanto non può essere utilizzato per lo studio della NEP. Laser cattura microdissezione, che utilizza il trasferimento di energia laser per rimuovere le cellule di interesse, è un altro metodo usato per isolare cellule specifiche all&#39;interno di un tessuto eterogeneo 17,18 ma cellule catturate possono essere utilizzate solo per il recupero di DNA, RNA e proteine ​​e non sono in grado di essere coltivato. Questo protocollo fornisce un modo per isolare in particolare un vivo, popolazione pura della NEP dal EGL.Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di tessuto che hanno o architettura anatomica riconoscibile o fluorescente cellule / regioni. Pertanto, il principale vantaggio di incorporare questa nuova tecnica di microdissezione nei protocolli di isolamento delle cellule è che le cellule possono essere isolate dalle regioni tissutali specifici per eliminare la contaminazione dei tessuti vicini e le cellule possono essere raccolte immediatamente per l&#39;analisi o in coltura per altre applicazioni.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Microdissezione è una nuova tecnica in grado di isolare le regioni specifiche di un tessuto ed eliminare la contaminazione da fonti cellulari in aree adiacenti. Questo metodo è stato utilizzato nello studio di nestina-esprimendo progenitrici (NEP), una popolazione di recente identificato delle cellule dello strato germinativo cerebellare esterno (EGL). Utilizzando microdissection in combinazione con l&#39;ordinamento delle cellule fluorescenti-attivata (FACS), una popolazione pura di NEP è stato raccolto separatamente dagli convenzionali precursori neuronali dei granuli in EGL e da altri contaminanti cellule nestina-esprimono nel cervelletto. Senza microdissezione, analisi funzionali della NEP, non sarebbe stato possibile con i metodi attualmente disponibili, come Percoll centrifugazione in gradiente e microdissezione laser. Questa tecnica può essere applicata anche per l&#39;utilizzo con vari tessuti che contengono sia regioni riconoscibili o cellule fluorescenza marcata. Ancora più importante, un grande vantaggio di questo microdissectiotecnica n è che le cellule isolate vivono e possono essere coltivate per ulteriori sperimentazioni, che non è attualmente possibile con altri metodi descritti.

Come mostrato nella Figura 1A, fettine cerebellari sono stati preparati da P4 Math1-GFP / topi Nestin-PCP, in cui il cerebellare EGL è stata dominata da PNL-GFP che esprimono e lo strato molecolare è stata arricchita da cellule gliali CFP-positivi. Per isolare NEP che si trovano nella parte profonda della EGL, fette sono state microdissezionate tra EGL e lo strato molecolare (lungo la linea tratteggiata; Figura 1A). EGLS sezionato (Figura 1B) sono stati poi raccolti per dissociazione enzimatica seguita da FACS. Come previsto, la maggioranza (oltre il 85%) delle cellule nel EGL sezionato erano PNL convenzionali, che erano positive per GFP (Figura 2A). NEP (PCP +) rappresentano solo il 5% della popolazione di cellule EGL. Quasi nessuna delle celle erano doppio-positive per GFP e CFP sulla base dell&#39;analisi FACS. Cellule PCP + purificate da FACS, sono state coltivate in vitro per esaminare il pote differenziazionential. Come mostrato nella Figura 2B, NEP esclusivamente dato luogo alla β-tubulina + neuroni dopo 4 giorni di coltura, suggerendo NEP sono progenitori neuronali lignaggio limitato. Con questo protocollo microdissezione, NEP e PNL sono stati purificati dal EGL di Ptc cervelletto carente. Dopo il trapianto intracranica, NEP MB sviluppano più rapidamente rispetto al PNL, che indica che NEP sono particolarmente suscettibili di trasformazione oncogenica 9. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Identificazione della regione per EGL microdissezione. Immagini fluorescenti da P4 Math1-GFP / animali Nestin-PCP. (A) espressione della GFP si trova nel EGL, mentre la maggioranza di espressione CFP si trova nello strato molecolare. Microdissezione è stato fatto lungo tegli giallo linea tratteggiata. (B) EGLS sono stati raccolti per la dissociazione dei tessuti. Questo dato è stato modificato da Li et al 9. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52034/52034fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. NEP rappresentano una piccola popolazione di cellule nel EGL e sono progenitori neuronali lignaggio limitato. (A) l&#39;analisi di citometria a flusso delle PCP + cellule isolate da microdissezione EGL. (B) NEP sono state coltivate in condizioni di differenziazione per 4 giorni e colorate per la β-tubulina (rosso) e counterstained con DAPI (blu). Questo dato è stato modificato da Li et al. 9

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Progenitori nestina-esprimendo sono una popolazione recentemente identificato di progenitori neuronali del cervelletto in via di sviluppo. Utilizzando la tecnica di microdissezione qui presentata in combinazione con fluorescenza-attivato cell sorting, questa popolazione cellulare può essere purificato senza contaminazione da altre regioni cerebellari e può essere coltivato per ulteriori studi.

Isolamento di distinte popolazioni cellulari dal cervelletto in via di sviluppo da Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

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Nanyang Technological University

Research

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Neuroscience

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

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The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

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Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

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Biologia

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Immunologia e infezioni

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Neuroscienze

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolamento e coltura dei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolamento di cellule staminali dal cervelletto di topo postnatale e differenziazione in cellule neurali

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...