Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), e Boston Children Hospital Facoltà Career Development Fellowship (TM, AM). Gli autori ringraziano Amanda Jiang e Jiang Elisabeth per l&#39;assistenza tecnica.

NOTA: Lo studio in vivo degli animali in stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato esaminato e approvato dalla cura degli animali e uso Comitato di Hospital di Boston per bambini (numeri di protocollo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tutti i farmaci utilizzati in questo protocollo sono di qualità farmaceutica e questi farmaci sono preparati in condizioni sterili. 1. fibrina Gel Preparazione <ol><li> Preparare gel di fibrina che contiene VEGF e bFGF. <ol><li> Scongelare soluzioni stock di fibrinogeno e trombina che sono immagazzinate a -80 ° C a temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Aggiungere trombina (concentrazione finale: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentrazione finale: 45 mM), VEGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) al fibrinogeno soluzione (concentrazione finale: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium soluzione di cloruro 43-45) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Mescolare delicatamente pipettando. </li><li> Pipettare delicatamente 200 microlitri della miscela su un piatto di plastica sterile in modo goccia a goccia con punta p200 pipetta. </li><li> Incubare le gocce a 37 ° C per 30-60 min fino a che solidificano. NOTA: Il gel solidificato può essere mantenuto nel piatto di plastica sigillata a temperatura ambiente (25 ° C) per diverse ore prima dell&#39;impianto (Figura 1a). </li></ol></li><li> Tagliare il gel di fibrina in circa 3 x 3 x 3 millimetri cubi utilizzando piccole forbici chirurgiche prima dell&#39;impianto. </li></ol> 2. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare topo adulto (8-12 settimane) da intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando punta del mouse. <ol><li> Usare pomata veterinario su occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Shave fur su lato sinistro della gabbia toracica del mouse. </li><li> Eseguire intubazione endotracheale del mouse. </li><li> Posizionare il mouse sul basamento intubazione angolata a 70 ° e tenere in posizione il mouse agganciando suoi incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto. </li><li> Ritrarre delicatamente la lingua da un lato con pinze smussato. </li><li> Visualizzare la laringe con l&#39;aiuto di un microscopio a collo d&#39;oca illuminatore a fibre ottiche. </li><li> Inserire endotracheale catetere elastico (21 G) nella trachea. </li><li> Verificare che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> Posizionare il mouse in posizione prona al microscopio di dissezione. </li><li> Meccanicamente ventilare il mouse utilizzando un ventilatore roditore (150 respiri / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contare costole di individuare spazio intercostale tra 4 ° e 5 ° costola. </li><li> Creare un campo sterile sull&#39;area by accuratamente pulire giù con alcool e Povidone-iodio. Coprire il campo chirurgico adeguato con un telo chirurgico sterile. </li></ol> 3. mouse Chirurgia <ol><li> Dopo iniezione locale di 0,25% bupivacaina (200 microlitri) nella pelle, fare una incisione cutanea trasversale (circa 1 cm di lunghezza) sopra spazio intercostale usando forbici dissezione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione di 0,25% bupivacaina (200 ml) nel muscolo intercostale fare un&#39;incisione muscolo tra il 4 ° e 5 ° costola con belle piccole forbici. </li><li> Inserire un divaricatore dissezione tra le costole di visualizzare completamente il polmone sinistro. <ol><li> Raschiare una piccola area (1 x 1 mm quadrato) di pleura viscerale del centro di polmone sinistro utilizzando una pinza sottile. </li><li> Applicare una leggera pressione sulla zona con un tampone di cotone sterile fino sanguinamento e perdite d&#39;aria sono completamente controllati. </li><li> Mettete piccola quantità di miscela fresca di fibrinogeno / trombina (colla di fibrina) (fase 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sopra la zona utilizzando punta p200 pipetta. </li></ol></li><li> Posizionare delicatamente un gel di fibrina (passo 1,2) con piccole pinze sopra la zona (Figura 1b). <ol><li> Verificare che il gel è ben fissato sulla superficie durante i movimenti respiratori del polmone. </li></ol></li><li> Verificare che non vi è né perdite di aria massiccia né sanguinamento dal polmone. </li><li> Chiudi incisioni (strati muscolari e cutanee) con sutura riassorbibile, che non devono essere rimosse. </li><li> Aspirare la cavità toracica con 27 G ago e siringa da 1 ml per evitare pneumotorace. </li><li> Terminare la ventilazione meccanica. </li></ol> 4. Il recupero del mouse <ol><li> Assicurarsi che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> IP iniettare 1 ml di pre-riscaldato 0,9% NaCl per prevenire la disidratazione. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare sul pad circolare acqua calda. </li><li> Rimuovere il endotracheal tubo dopo aver confermato che il mouse ha respirazione stabile. </li><li> Iniettare Meloxicam (5 mg / kg, iniezione sottocutanea (SC), per 3 giorni come analgesico postoperatorio. </li><li> Monitorare i movimenti del mouse attentamente un minimo di 15 min intervalli finché è sternale (grado di rotolare sul suo stomaco e restare in piedi) e consapevole. </li><li> Dopo il recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia isolata da topi senza intervento chirurgico. </li><li> Monitorare il sito chirurgico per segni di infezione (rossore, gonfiore, scarico), le funzioni biologiche di base di animali (cibo e acqua presa, minzione, defecazione, corpo aumento di peso), così come i segni clinici di sofferenza (piloerezione, ridotta locomozione) al giorno dopo la procedura chirurgica. </li></ol> 5. La raccolta Polmone <ol><li> 7 a 30 giorni dopo l&#39;impianto, eutanasia il mouse utilizzando CO 2 tramite fonte di gas compresso. </li><li> Fare un&#39;incisione tra la punta del processo xifoideo e sternalenotch (sternotomia mediana) e il raccolto intero polmone con il gel impiantato per l&#39;analisi istologica e biochimica tagliando la trachea e sezionare tutti i collegamenti con il cuore, i polmoni, e la trachea. </li><li> Fissare gel impiantato con polmoni con soluzione di paraformaldeide 4% per una notte a 4 ° C, incorporare in OCT, e prendere le sezioni di passo di serie di 30 micron di spessore. </li><li> Eseguire istologico (ematossilina e eosina) e le analisi immunoistochimica (marcatore endoteliale: CD31, marcatore epiteliale: aquaporin (AQP) 5 e surfattante proteina (SP) -B) utilizzando il microscopio confocale 22,37,40. </li><li> Compilare pile di sezioni ottiche (30 micron di spessore) per formare le immagini tridimensionali di cellule endoteliali e cellule epiteliali del polmone mediante immagini 3D software di analisi 37. </li><li> Quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni di nuova formazione con immagine software di analisi 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo articolo introduce un nuovo metodo per impiantare biomateriali sulla superficie del polmone di vivere topo adulto. Con questo sistema, angiogenesi ospitante polmone-derivato è ricapitolato correttamente all&#39;interno del materiale. Questo sistema permette ai ricercatori di esplorare diafonia tra le cellule endoteliali, altre cellule (ad esempio, cellule epiteliali, cellule mesenchimali, cellule immunitarie) e vari componenti ECM che sono necessari per l&#39;angiogenesi locale 50-53 e rigenerazione alveolare 24,54. Sebbene convenzionali in vivo idrogel sottocutaneo impianto è stato ampiamente utilizzato per la ricerca angiogenesi 37-39, questi metodi non ricapitolano angiogenesi organo-specifica. Questo sistema, in cui idrogel viene impiantato direttamente sulla superficie del polmone, permetterà ai ricercatori di esplorare il ruolo del microambiente specifico-polmone di angiogenesi e rigenerazione alveolare in topo adulto polmone. Questi gel possono essere fabbricate da varie BIOMATE ricchi di ECMrial (ad esempio, collagene, fibrina), che possono essere integrate con vari fattori chimici (ad esempio, fattori angiogenici, fattori di crescita) 55,56, cellule progenitrici e / o cellule iPS. Oltre a fattori chimici, forze meccaniche controllano anche angiogenesi 23,37. La rigidità dei cambiamenti gel di fibrina in fibrinogeno concentrazione-dipendente modo 57 e manipolando la concentrazione di fibrinogeno possono influenzare angiogenesi non solo attraverso segnali chimici, ma anche attraverso spunti fisici 58,59. Pertanto, le proprietà fisico-chimiche dei gel di fibrina possono avere bisogno di essere ottimizzato attentamente ricapitolare fisiologico angiogenesi organo-specifica nel futuro. La guarigione delle ferite dopo la raschiatura della pleura viscerale produce anche un coagulo di fibrina endogena, che comprende vari tipi di cellule ospiti e promuove il processo di guarigione e la rigenerazione dei tessuti. Questo coagulo naturale può interagire con il gel di fibrina esogena impiantato, e quindi controllare angiogenesi nel gel impiantato. Fluorescenza fibrinogeno marcato può consentire ai ricercatori di distinguere tra coagulo di fibrina naturale e gel di fibrina impiantato ed esplorare questi meccanismi. Anche se questo è un potente metodo per caratterizzare l&#39;angiogenesi nei polmoni adulti del mouse, l&#39;applicazione per lo studio dello sviluppo polmonare e di malattie nei topi neonati probabilmente presenti sfide tecniche. L&#39;obiettivo finale di questo studio è quello di reclutare vasi sanguigni funzionali in gel di fibrina impiantati sui polmoni malati e di utilizzare la matrice come un dispositivo medico per ripristinare le strutture polmonari funzionali. Possibili comunicazioni tra cellule ospiti e vascolare e strutture alveolari all&#39;interno dei gel nonché la funzionalità di queste strutture dovrebbero essere esplorate in esperimenti futuri. Dal momento che i livelli di VEGF nei polmoni sono diminuiti in pazienti con disturbo borderline 60 ed enfisema 61, aggiungendo VEGF alla matrice può migliorare il reclutamento dei vasi sanguigni nei impl matriceanted su questi polmoni malati. Le proprietà meccaniche differiscono anche tra sani e malati polmoni 23,62. Ad esempio, l&#39;espressione di metalloproteinasi della matrice e lysyl ossidasi, che controllano la degradazione e la reticolazione di collagene, rispettivamente, sono alterati in varie malattie polmonari, tra cui la BPCO e fibrosi polmonare 63-67. In polmoni malati, alcuni lignaggi di progenitori endoteliali per polmoni e le cellule epiteliali sono esauriti 68. Pertanto, manipolando questi fattori (fattori angiogenici, ECM, ECM rigidità) o impiantare gel di fibrina supplementati con cellule progenitrici 69 probabilmente portare alla formazione di vasi sanguigni funzionali all&#39;interno della matrice e il recupero della funzione polmonare in diverse condizioni patologiche. Poiché fattori chimici possono essere integrati all&#39;interno dei gel di fibrina di modulare l&#39;angiogenesi locale, questo sistema può essere utilizzato anche esplorare specifici stimoli ambientali che possono normalizzare polmoni malati in malattie polmonari croniche. </p&gt; In sintesi, si introduce un metodo per impiantare fibrina idrogel sulla superficie polmone di topo vivente, che consente ai ricercatori di caratterizzare angiogenesi specifico polmone in vivo. Modifica dei vari fattori (ad esempio, nel tempo, concentrazioni e combinazioni di fattori angiogenici, vari tipi di idrogel, le proprietà fisico-chimiche di idrogel) In questo sistema, presenterà i meccanismi di angiogenesi e rigenerazione nel polmone. Così, questo sistema avanzerà notevolmente conoscenze scientifiche della biologia vascolare base, ingegneria tissutale, così come medicina polmonare.

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di topo adulto, che permette ai ricercatori di caratterizzare i meccanismi molecolari di vascolare polmonare e sviluppo alveolare, e di sfruttare questa conoscenza per sviluppare materiali biomimetici grado di ricapitolare vascolare polmonare fisiologica e formazione alveolare per il trattamento di varie malattie polmonari. Più di 35 milioni di americani soffrono di malattie polmonari croniche, tra cui malattia polmonare ostruttiva cronica e fibrosi polmonare. Questi pazienti hanno sintomi di lunga durata croniche respiratorie, come mancanza di respiro, senso di costrizione toracica, tosse fastidiosa, e la stanchezza, che limitano considerevolmente la loro vita quotidiana 1-3. Nonostante una grande quantità di sforzo per sviluppare terapie efficaci per queste malattie polmonari, attualmente non esiste una cura; quindi, la qualità della vita di questi pazienti è scarsa ed economica e costi umani sono high 4-7. Attualmente, il trapianto di polmone è l&#39;unico modo per salvare i pazienti con stadio terminale malattie polmonari croniche. Tuttavia, a causa della carenza di donatori di trapianto, costo elevato, gravi complicazioni, e basso tasso di sopravvivenza 8-11, il trapianto non è un approccio ottimale. Recenti rapidi progressi nelle tecniche di ingegneria tissutale ha permesso ai ricercatori di bioingegnere polmone impiantabile da ripopolamento decellularized intero polmone con vari tipi di cellule progenitrici o staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 12,13. Tuttavia, questi polmoni bioingegneria sono funzionali in animali ospiti solo per diverse ore dopo l&#39;impianto 12,14,15. Utilizzando biomateriali per rigenerare le strutture complesse e le funzioni dei polmoni è stato abbastanza infruttuoso anche. Ciò può essere dovuto processi biologici fondamentali che regolano la rigenerazione dei polmoni per adulti non sono stati ben esplorato. Nel polmone, formazione del sistema vascolare è uno degli eventi prime e più importanti durisviluppo ng e rigenerazione 16-21. Vasculatures nuova formazione nel polmone non solo fornire ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari necessari per la formazione di organi, ma anche fornire segnali regolatori istruttivi alle cellule circostanti 22-25. Così, l&#39;angiogenesi svolge un ruolo chiave nel alveolarization rigenerativa nei polmoni adulti 24,26,27. Inoltre, l&#39;angiogenesi deregolamentato contribuisce a malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) 28, displasia broncopolmonare (BPD) 21-23, e la fibrosi polmonare 29. Così, per sviluppare strategie più efficaci per l&#39;ingegneria polmoni o la cura delle malattie polmonari croniche, è necessario capire i meccanismi fondamentali di angiogenesi specifici polmone. Ogni organo visualizza uniche proprietà meccaniche e chimiche, che possono differire tra le condizioni fisiologiche e patologiche 30-33. Questi microenviron organo-specificamenti regolano i comportamenti delle cellule endoteliali e orchestrare la formazione della rete vascolare in maniera specifica per organo 24,34-36. Così, per sviluppare strategie più efficaci per la rigenerazione dei polmoni, il meccanismo alla base dell&#39;angiogenesi specifici polmone deve essere capito. Mentre convenzionali in vivo test di angiogenesi come il sottocutaneo idrogel l&#39;impianto sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca angiogenesi 37-39, questi metodi non ricapitolano angiogenesi organo-specifica. Recentemente, un nuovo metodo per impiantare Matrigel in uno stampo elastico sul polmone del mouse è stato sviluppato e dimostrato di reclutare vasi sanguigni e cellule epiteliali polmonari nei gel 22. Questo approccio unico permetterà ai ricercatori di esplorare il meccanismo di angiogenesi specifici polmone, nonché le interazioni tra i vasi sanguigni e cellule polmonari non-vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche. Poiché 1) Matrigel non è adatto per l&#39;applicazione clinica; 2) la emuffa lastic utilizzato per lanciare il gel possono influenzare le interazioni tra idrogel e tessuto polmonare ospitante e 3) lo stampo elastico sul polmone potenzialmente causa compromissione della funzione polmonare e dolore durante la respirazione, come un approccio più clinicamente rilevante, una matrice di fibrina 3D contenente fattori angiogenetici (fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) / base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)) è stato impiantato il polmone mouse senza fusione in stampo elastico, ed è ricapitolata successo ospite angiogenesi polmone-derivato. Gel di fibrina, fibrille polimeriche generati dal fibrinogeno-trombina spaccati, è noto per intrappolare una varietà di fattori angiogenici come bFGF e VEGF per accelerare l&#39;angiogenesi in vivo 40,41. A causa della sua capacità rigenerativa e la natura biodegradabile 42, gel di fibrina è ampiamente usato nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti. Questo articolo introduce un approccio nuovo e unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di Adul viveret mouse e dimostra che ospitano l&#39;angiogenesi polmone-derivato è ricapitolato all&#39;interno dei gel in vivo. Questo metodo, che consente ai ricercatori di studiare l&#39;angiogenesi specifici polmone, probabilmente porterà allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari e far avanzare in modo significativo gli sforzi per rigenerare con successo polmonare adulta.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

I recenti progressi significativi nelle tecniche di ricerca e bioingegneria delle cellule staminali hanno fatto grandi progressi nell&#39;utilizzazione biomateriali per rigenerare e riparare i danni nei tessuti semplici nel settore ortopedico e parodontali. Tuttavia, i tentativi di rigenerare le strutture e le funzioni più complesse tridimensionali (3D) organi come polmoni non hanno avuto molto successo perché i processi biologici di rigenerazione di organi non sono stati ben esplorato. E &#39;ormai chiaro che l&#39;angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni, gioca un ruolo chiave nella rigenerazione degli organi. Di recente formazione vasculatures forniscono non solo ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari che sono necessari per la rigenerazione di organi, ma anche fornire segnali istruttivi ai rigeneranti tessuti locali. Pertanto, per rigenerare successo polmoni in un adulto, è necessario ricapitolare i microambienti specifico polmonari in cui angiogenesi unità rigenerazione dei tessuti polmonari locali. Sebbene conventional saggi in vivo di angiogenesi, come impianto sottocutaneo di matrice extracellulare (ECM) ricchi di idrogel (per esempio, fibrina o collagene gel o Matrigel - miscela di proteine ​​ECM secreta dalle cellule del mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma), sono ampiamente utilizzati per esplorare la meccanismi generali di angiogenesi, angiogenesi specifici polmone non è stato ben caratterizzato, perché i metodi per l&#39;impianto ortotopico di biomateriali a livello polmonare non sono stati ben stabiliti. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di vivere topo adulto, consentendo la ricapitolazione di successo dell&#39;ospite angiogenesi polmone-derivati ​​all&#39;interno del gel. Questo approccio consente ai ricercatori di esplorare i meccanismi con cui il microambiente specifico-polmone controlla l&#39;angiogenesi e la rigenerazione alveolare sia in condizioni normali e patologiche. Dal biomateriali impiantati rilascio e fornire segnali fisici e chimici a adiacente ltessuti ung, l&#39;impianto di questi biomateriali sul polmone malato possono potenzialmente normalizzare i tessuti malati adiacenti, consentendo ai ricercatori di sviluppare nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari.

Per esaminare se ospite polmone-derivato formazione vascolare è ricapitolato all&#39;interno dei biomateriali impiantati sul polmone, gel di fibrina integrati con i principali fattori angiogenici VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) sono stati impiantati sulla superficie della vita polmoni mouse come segnalato con Matrigel 22. Gel di fibrina 47 che contengono questi fattori di crescita angiogenici sono stati fabbricati come mostrato in Figura 1a. Dopo toracotomia, una piccola area della superficie polmone sinistro è stato raschiato con pinze e il gel di fibrina fabbricato è stato impiantato sul polmone di topo adulto usando una piccola quantità di colla di fibrina, che è approvato dalla FDA e ampiamente usato come sigillante efficace per fermare perdite d&#39;aria e ridurre il sanguinamento in chirurgia polmonare 48,49 (figura 1b). La maggior parte dei topi recuperati senza gravi sintomi respiratori (ad esempio, pneumotorace, difficoltà respiratoria). Sette giorni dopo l&#39;impianto, i topi sono stati sacrificati e polmoni erano harvested. Gel di fibrina impiantato è stato incorporato nel polmone ospitante 7 giorni dopo l&#39;impianto (Figura 1c). Ricostruzione 3D di immagini di fluorescenza confocale ha dimostrato che CD31-positive cellule endoteliali ospite derivate formate reti vascolari all&#39;interno dei gel 7 giorni dopo l&#39;impianto in / modo dose-dipendente bFGF VEGF (Figura 2a, c). Tipo I (AQP5 positivo) e tipo II (SP-B positivo) cellule epiteliali polmonari sono stati reclutati lungo i vasi sanguigni di nuova formazione all&#39;interno dei gel che sono state aggiunte concentrazioni più elevate di VEGF e bFGF (ogni 100 ng / ml) (Figura 2a) . H &amp; E colorazione di sezioni istologiche rivelato che altri tipi di cellule ospiti migrate anche nel gel 7 giorni dopo l&#39;impianto (Figura 2b). Questi risultati suggeriscono che le reti vascolari rigenerativi ospitanti polmonari derivati ​​sono costruiti con successo all&#39;interno dei gel di fibrina, che sono integrate con fattori angiogenici e impiantati sulla superficie di mou adultise polmone. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1:. (A) il gel di fibrina preparata prima dell&#39;impianto (b) il gel di fibrina impiantato nel pleura viscerale raschiato del polmone sinistro (punte di freccia) (c) Impiantato gel di fibrina (punte di freccia) incorporato nel polmone ospitante 7 giorni dopo l&#39;impianto.. Bar Scala 1 mm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: (a) mostra micrografie fluorescenza formazione di reti vascolari (CD31 positive; verde) e tipo reclutati I (AQP5-positivi; magenta) o tipo II (SP-B positive; magenta) cellule epiteliali del polmone all&#39;interno del gel di fibrina integrati con varie concentrazioni di VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) 7 giorni dopo l&#39;impianto. Le linee tratteggiate indicano l&#39;interfaccia tra impiantato gel di fibrina e del polmone di accoglienza. Scala bar:. 20 micron (b) luce microfotografia di H &amp; E colorazione mostrando infiltrazione di cellule ospiti nel gel di fibrina 7 giorni dopo l&#39;impianto. Le frecce indicano l&#39;interfaccia tra il gel e polmone host. Scala bar: 20 micron (c) Grafico che mostra le aree proiettate dei vasi sanguigni di nuova formazione in gel di fibrina che sono integrate con varie concentrazioni di VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) 7 giorni dopo l&#39;impianto..

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Ricerca

Medicina

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Bioingegneria

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

L&#39;angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Ricerca sul cancro

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Immunologia e infezioni

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Trapianto di polmone bioingegnerizzato utilizzando polmoni di topo decellularizzati e cellule endoteliali umane primarie

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

L'impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata