Name: cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System at JoVE.com

This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1 Accesso <ol><li> Accendere il bioreattore. Fare clic su un punto qualsiasi per aprire la pagina di login. Selezionare il nome utente e inserire la password e clicca su &quot;Accedi&quot;. </li></ol> 2 Calibrazione <ol><li> Calibrare sensore di pH (2 punti prima di autoclave). </li><li> Controllare il sensore di pH e confermare punta del sensore è piena di soluzione elettrolitica. Preparare due bicchieri con soluzioni di calibrazione pH (elettrolito) pH 4 e pH 7 e hanno a disposizione un flacone di lavaggio con acqua distillata. </li><li> Collegare il cavo pH al sensore di pH. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su &quot;calibrazione&quot;. Inserisci temperatura del tampone nel campo Temp soluzione di calibrazione. </li><li> Inserire sensore pH in tampone 1 (pH 4) e inserire il valore nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il tasto &quot;1 calibrare&quot; fare clic su. Sciacquare il sensore di pH con acqua distillata. </li><li> Sensore nel buffer di 2 (pH 7). Inserisci tampone2 valore nel campo &quot;span&quot;. Attendere grafico per stabilizzare e fare clic su Calibra pulsante 2. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li><li> Calibrare il sensore dell&#39;ossigeno disciolto (DO). </li><li> Assicurarsi che il sensore DO è stato polarizzato essendo collegato al sistema per diverse ore. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su Calibra. Fare clic sul pulsante &quot;DO A&quot;. </li><li> Scollegare il sensore DO e inserire 0 nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 1&quot; fare clic su. </li><li> Ricollegare il sensore DO e immettere 100 nel campo &quot;Span&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 2&quot; fare clic su. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li></ol> 3. Autoclave ed installare i sensori e navi reagenti <ol><li> Dopo la calibrazione, sensori posto e ben termico in AUTOCsacchetti Lave e autoclave per 30 minuti a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Sterilizzare sacchetti autoclave con il 70% alcol isopropilico (IPA) e di trasferimento sacchetti di cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio esterno della nave. </li><li> Sterilizzare imballaggio interno con il 70% di IPA e trasferire nave cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio interno e ispezionare la nave e il tubo per i danni inflitti durante il trasporto. </li><li> Installare il pH e DO sensori delle due porte anteriori. Installare il pozzo termico alla porta posteriore sinistra. Aprire il tappo del sensore. </li><li> Guida sensore attraverso la porta del sensore. Infilare il sensore saldamente nella porta. </li><li> Trasferimento nave fuori BSC. </li><li> Appendere la cavi dei sensori di pH DO e fuori il manicotto nave e verificare che nulla è nel manicotto. Far scorrere la nave nella manica, i piedi prima. </li><li> Inserire con cautela il sensore di temperatura nel pozzo termico nave. Assicurarsi che il fondo del recipiente poggia contro i riscaldatori. </li><li> Rimuovereil tubo imposta dalle loro borse. Codice colore Corrispondenza sulla tubazione ai connettori corrispondenti e pompe sulla centralina bioreattore. </li><li> Installare la linea principale del gas premendo il connettore nella sua presa di gas. Installare la linea del gas micro ruotando in senso orario il connettore nella presa del gas. Installare il tubo di scarico del filtro: </li><li> Aprire il forno del filtro. Fissare il filtro di scarico sul canale U per cui il suo tubo passa attraverso i due ganci al filtro e fuori del forno. </li><li> Installare il tubo dal sacchetto condensatore nel supporto tubo. Chiudere la porta. </li><li> Itinerario linee di addizione A e B, entrambe le linee di media, e la linea raccolto dietro il sensore DO e sulla panca accanto alla centralina bioreattore. </li><li> Collegare i cavi ai sensori DO e pH. </li></ol> 4. Aggiunta Medie e Micro-vettori <ol><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Controllo Pompe&quot; sull&#39;interfaccia computer. </li><li> Formare una Stericollegamento tra le linea inutilizzato mezzo oltre (1 banda arancione) e il supporto di origine flacone / sacca saldando il tubo o con raccordi Luer. </li><li> Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa media su. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare il supporto pompa spenta dopo l&#39;aggiunta desiderata quantità di mezzo. </li><li> Mettere microcarrier perline in Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare più volte con perline Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS. </li><li> Autoclave per 15 minuti a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Aggiungere 3 g / L (peso a secco) in questo esperimento. </li><li> Pompa a micro-vettori che sono stati idratati, lavati e sterilizzati in autoclave nel reattore nello stesso modo è stato aggiunto il mezzo nel passaggio 4.1. </li></ol> 5. equilibrazione e One-punto di calibrazione DO <ol><li> Impostare i controller per Auto e immettere i valori di riferimento desiderati. Qui, utilizzare Agitazione Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendere il parametri equilibrare. </li><li> Confermare sensore è completamente polarizzata. Confermare il valore attuale DO si è stabilizzato. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;calibrazione&quot;. Fare clic su &quot;DO A&quot;, fare clic su &quot;One-point&quot;. </li><li> Immettere &#39;100&#39; nel campo &quot;Span&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibra 1&quot;, cliccare su &quot;Salva&quot; e cliccare su &quot;close&quot;: </li></ol> 6 Avvio di una corsa <ol><li> Passare alla scheda Azioni. Fare clic su &quot;Batch&quot;. Utilizzare la tastiera su schermo o una tastiera esterna per immettere un nome lotto di 16 caratteri o meno. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Nascondi&quot; della tastiera su schermo. Fare clic su &quot;Avvia partita&quot; confermare facendo clic su &quot;Start&quot; nella sovrapposizione. </li></ol> 7 Inoculare con celle <ol><li> Formare una connessione sterile tra una linea non utilizzata Oltre media (1 banda arancione) e la bottiglia di cellule / fonte bag mediante saldaturail tubo o utilizzando i raccordi Luer. </li><li> Installare la sezione in silicone del tubo nella pompa media in modo che la freccia verso il tubo tra la pompa e serbatoio. </li><li> Controllare morsetto tubo è aperto e la sua fascetta tubi ramificati è chiuso. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa dei media e cliccare su &quot;Off&quot;, dopo l&#39;aggiunta di cellule. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Pompe di controllo&quot;. </li></ol> 8 Campionamento <ol><li> Dopo inoculazione e la frequenza che desidera monitorare la cultura, estrarre un campione dalla cultura nel modo seguente: </li><li> Passare alla scheda &quot;azioni&quot; e fare clic su &quot;prendere esempio&quot;. Posizionare il tubo di campionamento nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di campionamento in base alle istruzioni visualizzate sullo schermo. </li><li> Eseguire almeno una osservazione al microscopio ogni giorno e conta delle cellule su questi campioni. </li><li> Quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata, in questo case 1,2 x 10 6 cellule / ml, di infettare le cellule con l&#39;aggiunta di un inoculo del virus. </li><li> Aggiungere asetticamente l&#39;inoculo di una siringa da 20 ml, e collegare la siringa ad una delle porte di addizione pezzi sul reattore. Introdurre l&#39;inoculo al reattore premendo sullo stantuffo della siringa. </li><li> Continuare campionamento e l&#39;analisi della cultura per il adenovirus concentrazione di particelle intracellulare. </li></ol>

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	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

Autori D. Giroux e Y. Hashimura sono dipendenti di PBS Biotech che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo sistema di bioreattore monouso è relativamente semplice da usare e fornisce analisi in tempo reale per il monitoraggio e l&#39;analisi del reattore. E &#39;estremamente adatto per la coltura di cellule di mammiferi e insetti con densità di cellule che raggiungono oltre 30 milioni di cellule / ml. Oltre cellule A549 descritti in questo rapporto 11, siamo cresciuti SF-9 cellule di insetto nel bioreattore pure. La miscelazione delicata fornito dalla ruota di aria pneumatica riduce il danno cellulare. Diversi passaggi sono fondamentali quando si imposta questo reattore. In primo luogo, la corretta calibrazione del pH e DO sensori è importante per il controllo ottimale della coltura e per l&#39;aggiunta di reagenti per regolare il pH o l&#39;ossigeno nel sistema. In secondo luogo, i flaconi dei reagenti e sementi devono essere riempiti e gli attacchi luer effettuate in ambiente sterile come una BSC. Una volta che i flaconi dei reagenti vengono spostati fuori dell&#39;ambiente sterile, i collegamenti con le linee di alimentazione bioreattore devono essere fatte con cura per evitare la contaminazione microbica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Anche se questo sistema di bioreattore funziona bene per le linee cellulari di mammiferi e insetti non è progettato per colture batteriche. Il sistema non può fornire la miscelazione rapida e ossigenazione che è necessario per le cellule batteriche. La crescita batterica è meglio realizzato in un bioreattore serbatoio agitato. Rispetto ad altri bioreattori monouso per colture cellulari di mammifero o di insetto, questo sistema è facile da usare, fornisce dati sufficienti per l&#39;analisi di piste, e ha una crescita cellulare simile o migliore rispetto agli altri sistemi monouso abbiamo valutato. Il sistema di bioreattore pneumatico uso singola ha il potenziale per soddisfare molte delle attività di ricerca e applicazioni cliniche nel campo delle bioterapie, vaccini, cellule staminali e medicina personalizzata 4. Inoltre, la flessibilità di questo sistema permette di batch, fed-batch, perfusione, e le applicazioni bioreattore trasfezione basate 5. Infine, i sistemi di bioreattori monouso monouso hanno il potenziale per soddisfare le esigenze di larga scala la produzione industriale e di aderire alle linee guida e raccomandazioni di agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali 6-10.

Linee di cellule di mammifero possono essere classificati in una delle tre categorie in base alle loro caratteristiche di crescita: le cellule che crescono in sospensione, le cellule che crescono come aggregati, e le cellule che crescono ancorate ad un substrato. Anche se il bioreattore aria-wheel dimostrato in questo video è in grado di crescere tutti e tre i tipi di cellule, questo video dimostra l&#39;uso del bioreattore a crescere celle dipendenti di ancoraggio sul micro-portanti. Cellule di mammifero dipendenti di ancoraggio possono essere coltivate per lo scopo di produrre più cellule - in cui le cellule stesse sono il prodotto. Ad esempio, osseo derivate cellule staminali mesenchimali osseo umano sono attualmente coltivati ​​con lo scopo di raccolta delle cellule e parenterale in tessuto malato. Il bioreattore pneumatico dimostrato in questo video è dimostrata adatta alla realizzazione di tali cellule staminali mesenchimali per questa applicazione (Serra et al., Comunicazione personale, 2013). Anchorage depcellule di mammifero Endentski sono tipicamente coltivate su piccola scala in recipienti di coltura 2D come piastre di coltura cellulare, fiasche di coltura cellulare, o bottiglie a rulli, dove aderiscono ad una superficie di crescita specialmente trattata 1. Quando più celle sono desiderati, le piastre o flaconi possono essere espansi utilizzando più o grandi vasi. Tuttavia, per più conveniente coltivazione di grandi quantità di celle dipendenti ancoraggio, aumentando la superficie per l&#39;adesione delle cellule può essere realizzato utilizzando piccole perle solidi chiamati micro-portanti. A seconda delle caratteristiche di fissaggio della cella, diversi tipi di micro-portanti sono disponibili in commercio, come il destrano, peptide, o collagene rivestito. Micro-vettori hanno una grande superficie in rapporto al volume che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare; e le micro-vettori possono essere mantenuti in sospensione con agitazione, che permette alle cellule di essere coltivati ​​a alta densità nei sistemi di bioreattori 2. Attualmente, i tipi di bioreactors dove cellule aderenti sono coltivate su micro-vettori comprendono fiaschi filatore e sistemi di serbatoi agitati, che utilizzano giranti assiali per mantenere in sospensione le cellule rivestite con micro-portanti. Diversi fattori sono importanti per la coltivazione di successo di cellule, tra cui tensione di ossigeno, sforzo di taglio, matrici di superficie, e di nutrienti e le concentrazioni del metabolita. L&#39;uso di bioreattori consente il monitoraggio in tempo reale delle condizioni di crescita e il potenziale di costi di produzione notevolmente inferiori 1. Ci sono parecchi disegni bioreattore comune per la coltivazione in vitro di cellule tra cui, sospensione agitata, ruotando vaso a parete, a fibre cave, borsa bioreattore su una piattaforma rocker, e sistemi a letto fluido 3. Molti di questi sistemi presentano problemi particolari per la coltivazione delle cellule e la scala -up, come il costo elevato, gradienti di concentrazione di nutrienti, taglio idrodinamico, l&#39;aggregazione delle cellule, e la difficoltà di campionamento, il monitoraggio, il controllo e cell scale-up. Varie linee cellulari aderenti sono usati nella produzione di virus, sia nella produzione di vaccini virali o per la produzione di vettori virali per applicazioni in terapia genica. In questo video, utilizzando l&#39;unico uso pneumatico sistema di bioreattore (Air-Wheel), dimostriamo la coltura delle cellule di carcinoma polmonare umano (A549), le cellule di micro-vettori per la produzione di un adenovirus oncolitici. Il disegno bioreattore pneumatico utilizza una ruota agitazione verticale che è alimentato dalla galleggiabilità di gas strippata nel fondo del bioreattore. Questo metodo agitazione delicato limita le forze di taglio idrodinamiche, ma assicura comunque di medie e cellulare ottimale miscelazione 4. Rispetto al reattore serbatoio agitato, il reattore pneumatico ha una bassa sforzi di taglio anche con sistemi di bioreattori Air-Wheel grande disponibilità (Figura 1). In contrasto bioreattori agitati cisterna, la girante verticale di questo unico reattore uso è attivata da un flusso di bolle di gas all&#39;internoil vaso, che consente delicata ed uniforme miscelazione medio (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Nella Figura 3, sono indicati i parametri per l&#39;inizio della corsa bioreattore. Questa figura mostra la schermata prima di impostare i parametri di temperatura, ossigeno disciolto, pH e agitazione. Una volta che i parametri sono impostati, i parametri della corsa vengono continuamente monitorati e le regolazioni possono essere fatte per mantenere le condizioni richieste. Il software produce una lettura continua che permette una facile identificazione dei problemi. In questo esperimento utilizzando 2,5 L di DMEM contenente 10% FBS, 250 ppm di SAFC antischiuma C, 2 mm L-glutammina e 3 g / L di micro-portanti, il sistema è stabilizzato in modo che la percentuale di ossigeno è del 50%, la temperatura è di 37 ° C, e il pH è 7,2. Il reattore viene inoculato con cellule A549 ad una concentrazione di 7 x 10 4 cellule / ml (o 10 cellule / micro-carrier). I parametri scelti per questa esecuzione comportato la maggior parte delle cellule aderenti alle micro-vettori in 2 ore (Figura 4). Dopo 12 ore, le cellule sono demonitrarsi segni di appiattimento e diffusione sulla superficie micro-portante (Figura 5). Entro 24 ore, micro-vettori hanno una distribuzione abbastanza uniforme della cellule, senza micro-vettori senza cellule e senza grandi ciuffi di celle micro-portanti (Figura 6). La percentuale di colonizzazione micro-carrier dalle cellule A549 è del 75% in 24 ore e 90% successivamente (Figura 7). Le cellule hanno continuato a crescere in modo esponenziale a ~ 1 milione di cellule / ml dopo 48 ore (Figura 8). Dopo l&#39;infezione da una dose di adenovirus oncolitici (2 x 10 8 virioni / ml) a 50 ore, la densità è aumentato a 1,2 milioni di cellule / ml e poi ha cominciato a diminuire, come l&#39;infezione litica progredito. C&#39;era ~ 10.000 volte amplificazione del inoculo virale. In esperimenti precedenti, abbiamo trovato che il monitoraggio e la regolazione del flusso di gas è fondamentale per massimizzare la crescita delle cellule (dati non pubblicati). Rapidamente cellule in crescita possono esaurire il sistema di ossigeno con<html> il livello DO cadere a zero. Mentre le cellule hanno continuato a crescere, era a un ritmo molto più lento. E &#39;fondamentale per controllare e regolare il flusso di ossigeno per soddisfare le esigenze di cella durante la fase di crescita logaritmica. Ogni corsa può essere analizzato per una crescita ottimale confrontando il pH, DO, e la temperatura con conta delle cellule quotidiane. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluidodinamica del pneumatico bioreattore System (PBS), rispetto a un serbatoio bioreattore agitatore misura parete forze di taglio in vari volumi reattori. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> Figura 2 girante reattore Pneumatic Air-Wheel. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3 Pneumatic Air Wheel software schermata di parametri di avviare la corsa bioreattore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> Figura 4 colonizzazione Micro-carrier con le cellule A549 2 ore dopo l&#39;inoculazione. (Diametro medio di micro-carrier ~ 180 micron.) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> Figura 5 12 ore dopo l&#39;inizio della cultura, le cellule A549 attribuiscono, appiattimento, e diffondendo sui micro-portanti.5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> Figura 6. Micro-portanti rivestiti con cellule dopo 24 ore di coltura. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> Figura 7 Percentuale di colonizzazione micro-carrier da parte delle cellule A549 post-inoculazione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> Figura 8 Il numero di cellule vitali A549 in coltura prima e dopo l&#39;infezione con adenovirnoi. Notare che il punto infezione virale si è verificato a 50 ore.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

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Biologia

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

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Bioingegneria

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

Bioreattori fibra cava per<em&gt; In Vivo</em&gt; -come Mammiferi Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This work has developed a low-cost perfusion bioreactor system that allows culture medium to be continuously perfused into a cell culture module and fractionated in a downstream module to measure dynamics on this scale. The system is constructed almost entirely from commercially available parts and can be parallelized to conduct independent experiments in conventional multi-well cell culture plates simultaneously. This video article demonstrates how to assemble the base setup, which requires only a single multichannel syringe pump and a modified fraction collector to perfuse up to six cultures in parallel. Useful variants on the modular design are also presented that allow for controlled stimulation dynamics, such as solute pulses or pharmacokinetic-like profiles. Importantly, as solute signals travel through the system, they are distorted due to solute dispersion. Furthermore, a method for measuring the residence time distributions (RTDs) of the components of the perfusion setup with a tracer using MATLAB is described. RTDs are useful to calculate how solute signals are distorted by the flow in the multi-compartment system. This system is highly robust and reproducible, so basic researchers can easily adopt it without the need for specialized fabrication facilities.

This paper presents a method to construct and operate a low-cost, multichannel perfusion cell culture system for measuring the dynamics of secretion and absorption rates of solutes in cellular processes. The system can also expose cells to dynamic stimulus profiles.

Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

Produzione in sistema chiuso di cellule aderenti basate su microcarrier solubili

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

Autore in primo piano: Avanzamento della produzione di terapie cellulari con microcarrier solubili 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Una piattaforma automatizzata versatile per micro-scala Cellulari esperimenti di stimolazione

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

Bioreattori fibra cava per

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP