Name: in vivo microinjection and electroporation of mouse testis
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
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Ringraziamo Birgit Westernstroeer del Centro di Medicina della Riproduzione e Andrologia presso l&#39;Università di Muenster per l&#39;insegnamento della microiniezione testicolare. Inoltre, siamo grati a Ursula Antkewitz e Petra Reckling per l&#39;assistenza tecnica. Ringraziamo la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) per sostenere questo lavoro (WE2458 / 10-1). &#160;

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal comitato etico locale (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Germania). 1 plasmidi Preparazione <ol><li> Per la preparazione plasmide, utilizzare i kit di purificazione del plasmide (vedi tabella materiali) o metodi simili con buffer di rimozione di endotossine in modo che le reazioni immunitarie dell&#39;animale possono essere evitati. Seguire le istruzioni del manuale. Impiegare DDH 2 O per diluire la soluzione plasmide. </li><li> Eliminare i detriti facendo girare la soluzione di DNA alla massima velocità (20.000 xg). Poi raccogliere il surnatante. </li><li> Determinare la concentrazione plasmide con uno spettrofotometro (vedi materiali). </li><li> Regolare la concentrazione plasmide con DDH 2 O a 1-3 mg (DNA) / ml. Nota: le concentrazioni più basse riducono l&#39;efficienza di trasfezione, mentre concentrazioni più elevate possono provocare una soluzione iniettabile troppo viscoso. Inoltre, l&#39;efficienza di trasfezione dipende dalle dimensioni del plasmide e deve essere testato singolarmente. </li><li> Prima dell&#39;iniezione preparare una miscela della soluzione con ad esempio 40 microlitri plasmide con 5 ml di PBS (10x) e 5 microlitri Verde veloce (0,5%). Veloce verde è necessaria per il monitoraggio del processo di iniezione. Preferibilmente, utilizzare parete PCR-tubi sottili o Parafilm. Nota: a seconda delle dimensioni del testicolo, sarà necessario un volume di 20-50 ml per ogni testicolo. </li></ol> 2 Preparazione di microiniezione pipetta <ol><li> Utilizzare capillari borosilicato (vedi tabella materiali) per la preparazione dei pipette microiniezione. </li><li> Tirare capillari di vetro con un capillare estrattore verticale (vedi tabella Materials). </li><li> Rompere la punta capillare con una pinza da dolcemente banding. La punta è di solito 50-80 micron di diametro e lunghezza di circa 1 cm. Cercate di evitare punte troppo lungo in quanto questi non sono sufficientemente rigido per penetrare il tessuto. </li><li> Infine, shaRPEN la punta di un 30 ° a 45 ° utilizzando un beveler micropipetta (vedi tabella Materials). </li><li> Caricare la pipetta microiniezione con il mix di soluzione iniettabile (vedere plasmidi Preparazione). Applicare la soluzione nel retro del capillare di vetro con una piccola siringa. Nota: Cercate di evitare bolle d&#39;aria durante il caricamento, altrimenti questi saranno iniettati nei tubuli seminiferi con la soluzione di plasmide e quindi ridurre la conducibilità, nonché, eventualmente, causare danni ai tessuti. </li></ol> 3 Anestesia e Chirurgia <ol><li> Eseguire l&#39;operazione in condizioni asettiche, utilizzando materiale sterile (ad esempio, siringa, ago, strumenti chirurgici, ecc). Ciò consentirà di ridurre le infezioni degli animali e garantire buoni tassi di sopravvivenza. </li><li> Utilizzare topi maschi di elettroporazione ad un&#39;età di 6-8 settimane. </li><li> Per inizializzare il trattamento analgesico post-chirurgica, forniscono il mouse con analgesici aggiunto l&#39;acqua potabile, il giorno prima dell&#39;intervento. Questo culoUres una analgesia preventiva in caso di altamente probabile hypodipsia post-chirurgica (assunzione di acqua diminuita). A tal fine, esporre acqua potabile con ad esempio una sospensione ibuprofene pediatrico (20 mg / ml). L&#39;acqua da bere medicata deve essere fornito anche il primo giorno e due di recupero in concentrazione identici. Ciò significa che una dose giornaliera di 7,5 mg / kg, valida per 5 ml / acqua potabile d e peso corporeo di 25 g per 8 settimane di età C57BL / 6J. Questo regime analgesico garantisce un sollievo dal dolore fondamentale e recupero accelerato con alto benessere 26. </li><li> Per preparare l&#39;anestesia soluzione sul giorno dell&#39;intervento di lavoro, miscelare il 10% e il 2% Ketamin Xylazin in un rapporto 1: 1 (vedi tabella Materials). </li><li> Per anestetizzare l&#39;animale, diffusa 0,25 ml / 100 mg di peso corporeo di anestetico per via sottocutanea soluzione (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Utilizzare un sito di iniezione tra bacino e degli arti, al fine di evitare danni d&#39;organo e lesioni dei topi. Di solito, 10 min sono necessarifino a quando il mouse è profondamente anestetizzati. </li><li> Coprire gli occhi del mouse con vet pomata per prevenire la secchezza durante l&#39;anestesia. </li><li> Prova profonda arresto anestetico, che è evidente da una totale mancanza di risposta. A tal fine, basta pizzicare la punta dell&#39;animale. </li><li> Per avviare l&#39;operazione, rimuovere i capelli addominale con un rasoio elettrico o simile e disinfettare la zona funzionamento con sterilium o simili. </li><li> Fare una incisione ventrale direttamente sopra le ghiandole prepuziale nel centro della zona addominale. In quel luogo, prima tirare la pelle fuori e condurre un piccolo taglio trasversale cutanea di circa 8-14 mm. Quindi, proseguire lungo lo strato muscolare addominale. Nota: La lesione deve essere il più piccolo possibile per ridurre i danni all&#39;animale. </li><li> Sollevare i cuscinetti di grasso addominale con attenzione per esporre il testicolo collegato e posizionarlo su una precedente preparato impermeabile usa e getta di carta drappo proprio accanto al sito di incisione (Figura 2A). </li><li> Utilizzare un binocolo per find il condotto efferente come destinazione di iniezione. Il dotto efferente è identificato come la multa di giunzione nave tra il testicolo e dell&#39;epididimo. Si trova adiacente alla arteria testicolare prominente. Il dotto corre quasi con un angolo di 45 ° verso l&#39;arteria e visibilmente entra nel epididymidis caput. Nota: A seconda dell&#39;età del mouse, il dotto è di solito sepolto nel tessuto adiposo. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per cancellare il canale efferente di questo tessuto adiposo. Dopo di che, posizionare il dotto rilasciato su una striscia di carta sterile per garantire la chiara visibilità del condotto senza compromettere dintorni. </li></ol> 4. Microiniezione e applicazioni del DNA <ol><li> Collegare la pipetta microiniezione, che viene caricato con la soluzione plasmide all&#39;unità micromanipolatore / iniettore. </li><li> Inserire la microiniezione ago parallelo al condotto efferente con la punta verso rete testis (Figura 2B). </li><li> Utilizzare pinzette sottili etogliere il condotto sopra la pipetta microiniezione. Assicurarsi che il capillare è mantenuta parallela al condotto mentre si tira su. Nota: Questa procedura è più conveniente che penetra la nave spostando l&#39;ago con il micromanipolatore. </li><li> Dirigere l&#39;ago con attenzione verso il testicolo e fermarsi proprio come penetra la rete testis direttamente sotto la tunica albuginea (Figura 2C). Nota: Nel caso che travalica la rete testis, la soluzione plasmide perderà nello spazio interstiziale. Questo generalmente porta al fallimento di transfezione tubuli seminiferi. </li><li> Per l&#39;iniezione della soluzione plasmide utilizzare il microinjector con le seguenti impostazioni: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sec, e pc: 0 hPa (Figura 2D). </li><li> Monitorare l&#39;intero processo di iniezione osservando testicolo stato di riempimento con l&#39;aiuto del colore verde. Fare attenzione che il testicolo è riempito solo fino a 2/3 del suo volume con la plsoluzione asmid (Figura 2E). Nota: Se il volume di iniezione viene superato, il tessuto testicolare potrebbe essere danneggiato. </li></ol> 5. Elettroporazione di Testicolo <ol><li> Per abilitare elettroporazione efficace, immergere gli elettrodi pinzetta in PBS (1x). Questo assicura un adeguato conduttanza. </li><li> Uniformemente spremere il testicolo tra gli elettrodi bagnati (Figura 2F). Misurare la resistenza elettrica con il elettroporatore. </li><li> Applicare corrente al testicolo. Eseguire otto impulsi quadrati di 40 V a 4 diversi siti testicolo con una durata costante di tempo di impulso 50 msec e 950 msec intervallo di tempo. </li></ol> 6. ferita chiusura e post-operatorio <ol><li> Quando elettroporazione è finito, posizionare il testicolo torna nella posizione originale. </li><li> Cucire lo strato muscolare interno con sutura chirurgica (vedi materiali). </li><li> Chiudere la pelle utilizzando spezzoni di sutura (vedi tabella materiali). Tirare la pelle fino with pinzette. Assicurati di escludere lo strato muscolare. Posizionare le clips, ciascuno ad una distanza di non più di 5 mm. Nota: Poiché sutura chirurgica può essere inghiottito dal mouse, clip di sutura sono favoriti per la chiusura della lesione cutanea. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare da anestesia su carta assorbente sterili collocati in una gabbia sterile topo vuoto, che è temperato su un 37 ° C pad caldo. Il tampone dovrebbe garantire il riscaldamento di una metà della gabbia creando un gradiente termico. Per l&#39;animale questo rende possibile effettuare la ricerca per la singola area, più comodo per la varietà temperatura nella gabbia. Inoltre, coprire il mouse con un foglio di carta assorbente sterile in modo che lo stress può essere ulteriormente ridotto. Nota: Dal momento che la superficie del corpo del mouse è insolitamente alta in relazione alla massa corporea, se confrontato con gli animali più grandi, il supporto termico è di particolare importanza per il successo il recupero dei roditori. </li><li> Quando l&#39;animale operato si è completamente risvegliato, trasferire it per un ulteriore recupero di una nuova gabbia del mouse completamente attrezzata. Non mettere l&#39;animale torna alla sua vecchia gabbia o ad un gruppo di topi. Assicurarsi che la gabbia è pulita e sterile possibile per prevenire l&#39;infezione della ferita. Monitorare l&#39;intero processo di recupero. Per trasferire il mouse torna alla struttura di cura degli animali, attendere fino a che non ha pienamente recuperato e sembra comportarsi normalmente. Nota: persona aggiuntiva e strategie post-chirurgici sono discusse da Pritchett-Corning KR et al 6. </li></ol>

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Marten Michaelis, Alexander Sobczak, e Joachim M. Weitzel impiegati presso l&#39;Istituto di Biologia della Riproduzione, Leibniz Institute for Biologia Animal Farm (FBN), Dummerstorf, Germania, dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La ricerca nel campo della biologia riproduttiva, in particolare nel settore della fertilità maschile e la spermatogenesi inevitabilmente si basa su organismi viventi. Al fine di esaminare la funzione testicolare, no / sistema di coltura cellulare adeguata in vitro è stata stabilita in grado di riflettere tutti i cambiamenti morfologici cruciali da un spermatogonio diploide ad aploide un maturo 1,2 spermatozoo. Così, la generazione di animali geneticamente modificati è spesso necessario e come uno strumento prezioso nella biologia riproduttiva maschile. A tal fine, un numero considerevole di transgenici, knock-out e knock-in topi sono stati creati che hanno espresso intuizioni fertilità maschile. Tuttavia, la generazione di topi transgenici di solito è fatto iniettando costrutti genici nel pronucleo di uova fecondate. Tuttavia, questa tecnica è in termini di tempo e dovrebbe essere fatto da laboratori specializzati. La procedura per generare knock-out o knock-in animaliè ancora più sofisticato. Un altro modo di studiare la funzione dei geni di organismi viventi modello è di trasfezione transiente. Tuttavia, la trasduzione comune con vettori virali possono causare reazioni aspecifiche immunogenicità o altri e richiede norme speciali di sicurezza. Lipofezione 3 e microparticelle bombardamento 4 approcci sono, purtroppo, trattenuti per una profondità cella specifica e anche potrebbe innescare effetti negativi sul tessuto. Tuttavia, per mezzo di impulsi applicati direttamente quadrati elettrica sul tessuto bersaglio, così chiamato elettroporazione, in realtà è possibile transfettare tessuti viventi, ad esempio, qui il mouse testicolo. Inoltre, questo metodo richiede solo bassi costi, bassi attrezzature e adeguatamente qualificato personale di laboratorio. Un ulteriore vantaggio degno di nota associata a metodi di trasfezione in vivo rispetto alla persistente modalità di animale gene alteratols è la possibilità di co-trasfezione. Mentre transgenici o knock-topi di solito portano solo un costrutto genico, in vivo trasfezione consente completi, analisi simultanee di diversi costrutti genici all&#39;interno della stessa cella. Questo può essere fatto con l&#39;uso di vari geni reporter, per esempio, contro GFP o YFP Gaussia- contro Renilla-luciferasi, in modo che una indagine comparativa di tipo selvatico e gli effetti del gene mutante è possibile. Inoltre, mediante l&#39;applicazione di promotori specifici di tipo cellulare, l&#39;espressione di costrutti genici può essere squisitamente convogliata sulla cellule specifiche all&#39;interno del testicolo. Ad esempio, questo potrebbe consentire una espressione genica testicolare solo in cellule di Sertoli o spermatociti. Il protocollo presentato in questo articolo riguarda due metodi importanti nel campo della biologia riproduttiva maschile. Il primo è la microiniezione in tubuli seminiferi con la preparazione del capillare di iniezione. Questa tecnologianique è stato comunemente implicato in germe / trapianto di cellule staminali da animali transgenici al destinatario 7 o nel contesto di xenotrapianto 8. Il secondo metodo è la transfezione elettroporazione in grado di indurre transitori pori nella membrana plasmatica, nonché un flusso di massa diretta di molecole cariche come plasmidi, assicurando ingresso in determinate cellule o tessuti piuttosto. Questa specifica direzione di macromolecole di elettroporazione è spesso apprezzato in trasfezione delle cellule neurali unilateralmente spesso fatto in utero 9,10 o nello sviluppo di retina 11. Il protocollo dettagliato metodo precedente contiene i primi passi cruciali anestesia di topi maschi, l&#39;esposizione del testicolo con lesione addominale, la preparazione del dotto efferente, nonche la microiniezione nel dotto. Poiché queste azioni sono molto esigenti, è fortemente consigliato di prima pratica su animali morti prima di eseguire oda operazioni sui topi viventi. Inoltre, vengono fornite istruzioni su come iniettare e riempire i tubuli seminiferi con plasmide-DNA e come condurre l&#39;elettroporazione del testicolo in modo appropriato. A causa della domanda di energia elettrica durante EP, produzione di calore potrebbe provocare danni tissutali soprattutto ad alta tensione. Questo aumento di efficienza di trasfezione 12, 13, 15, da elevata tensione si accompagna l&#39;effetto negativo della contrazione testicolare 12-14. Il range di tensione più favorevole sembra essere tra 30-50 V, garantendo piccoli effetti su integrità testicolare, una normale qualità dello sperma 16, un normale comportamento di accoppiamento 17, il mantenimento della prole capacità di produzione 16-20, nonché una efficacia di trasfezione sufficiente. Per quanto riguarda l&#39;intensità di espressione genica dei costrutti genici trasferiti, Yomogida et al. 21 hanno inoltre rivelato una expr marcatamente ridottaESSIONE di vettori linearizzate 3 giorni dopo l&#39;attuazione EP considerando circolare plasmide-DNA, ovviamente, sostiene ancora l&#39;espressione dopo 35 giorni con la più alta in cellule di Sertoli. Questo suggerisce che i migliori risultati si ottengono quando si utilizza costrutti plasmidici per elettroporazione come fatto qui. Nel nostro approccio, abbiamo studiato l&#39;efficienza di trasfezione 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione dovuto alla constatazione che questo periodo di tempo è sufficiente per una adeguata cicatrizzazione, riparazione di integrità delle cellule così come la corretta espressione desiderata delle proteine ​​reporter eGFP e DsRed2. Così, un tempo di incubazione di 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico e l&#39;intera procedura di trasfezione sembra essere necessaria per garantire funzioni cellulari opportunamente restaurati tra cui espressione genica in modo che un segnale di fluorescenza intensiva come possibile può essere rilevato garantendo un risultato trasfezione affidabile. Per quanto riguarda l&#39;efficienza di trasfezione, Yomogida et al. Ha rivelato che il 21 °E cellule di Sertoli somatiche sono apparentemente più sensibili alle EP-trasfezione di cellule germinali. Si consiglia di co-trasfezione di testicolo con bersaglio e di controllo plasmidi, ogni codifica per un diverso gene reporter. L&#39;approccio elettroporazione presentato è applicabile ad un ampio spettro di possibili problemi relativi ai processi delle cellule germinali e fertilità maschile. Ad esempio, può essere utilizzato per analizzare elementi regolatori di geni specifici spermatogenesi 17,22. Il metodo è adatto anche per la perdita di funzione studi con piccolo RNA interferente 23 e guadagnare di funzione studi 24. Inoltre, ci sono possibilità promettenti per realizzare anche EP per il trattamento terapeutico e la generazione della prole transgenica come gruppi di ricerca hanno già dimostrato 18,20,25. Quindi, l&#39;approccio metodologico romanzo di topo testicolo elettroporazione in vivo illustrato in collaborazione con canale efferente microinjection di costrutti plasmidici, si spera, salirà a una tecnica preziosa per svelare con successo la natura della spermatogenesi.

Spermatogenesi dei mammiferi è considerato un sofisticato processo di cellule staminali di auto-rinnovamento successivamente sottoposti a mitosi, meiosi e la differenziazione al fine di sviluppare in maturo spermatozoi aploidi. Questi cambiamenti morfologici sono orchestrati da diversi tipi di cellule e nonostante i profondi tentativi, è ancora impossibile imitare questi processi in coltura cellulare 1,2. Quindi, la ricerca sulla spermatogenesi fino ad ora si affida a organismi viventi come modelli in vivo. In generale, gli studi di funzione genica si basano generalmente su animali transgenici. Tuttavia, generare e sostenere questo tipo di modello animale è in termini di tempo, costi-intensive e molto elaborata. Questo è attribuito al processo di allevamento lungo necessario per generare e mantenere il transgene nel corso delle generazioni. Inoltre, la manipolazione genetica di tutto l&#39;organismo dall&#39;approccio transgenici o knockout è incline a causare alterazioni fisiologiche quando il targeting gEnes con funzioni essenziali in più regioni, ad esempio, al di fuori del testicolo o sistemica. Inoltre, alcuni metodi di trasfezione transiente sono associati con alcuni svantaggi cruciali. Ad esempio, inconvenienti tipici di trasferimento genico virus-mediata sono la possibile provocazione di immunoreazioni e dei regolamenti di sicurezza supplementari, mentre lipofezione 3 e 4 microparticelle bombardamento potrebbe danneggiare il tessuto e sono limitate a una certa profondità cella di una sufficiente efficienza di trasfezione. In contrasto, elettroporazione (EP) come un altro modo comune di trasfezione transiente, sembra costituire una tecnica promettente per consentire a trasfezione vivo e vivo analisi del gene coerente. In generale, EP viene indicato come un fenomeno dinamico che dipende dalla tensione transmembrana locale con pori di conseguenza mediate all&#39;interno nanosecondi. Queste lacune possono essere mantenuti per i millisecondi, sufficienti to concedere l&#39;accesso al DNA, RNA o piccole molecole 5. Quando la tensione applicata è troppo alta, il carattere di solito transitoria di EP è contrastata a causa della produzione di calore e di induzione di permeabilizzazione troppo globale con conseguente danno irreversibile della cellula 5. Qui mostriamo che elettroporazione è un sistema trasfezione efficace ed economico che possa essere utilizzato per la trasformazione genetica testicolo per chiarire caratteristiche genetiche testicolari in vivo. Questo articolo affronta la preparazione plasmide, microiniezione attraverso il dotto efferente e la successiva elettroporazione del mouse del testicolo. Questa procedura può essere il mezzo di scelta per raggiungere velocemente, specifico ed efficiente trasfezione dei tubuli seminiferi del testicolo topo in vivo al fine di indagare i processi di spermatogenesi.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>vertical capillary puller</td></tr><tr><td>Microinjection capillaries</td><td>Clark</td><td>GC100-10</td><td>borosilicate standard wall</td></tr><tr><td>Micropipette beveler</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td><td>rotating disk beveler</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>square wave electroporator</td></tr><tr><td>Tweezer electrodes</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 mm &amp;Oslash; disk electrodes</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Cold light source</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection pump</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>homemade</td><td></td><td>XYZ cross table</td></tr><tr><td>Surgical instruments</td><td>FST</td><td></td><td>scissors, forceps, needle holder</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>FST</td><td>Dumont #5, #7</td><td>efferent ducts preparation</td></tr><tr><td>Michel clip applying stapler</td><td>FST</td><td>Michel, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Michel suture clips</td><td>FST</td><td>Michel, 12040-01</td><td>7.5 x 1.75 mm</td></tr><tr><td>Surgical suture</td><td>Catgut, Markneukirchen, Germany</td><td>Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>Syringe with 30 G needle</td><td>B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>to load micropipette and for anesthesia</td></tr><tr><td>Plasmid isolation kit</td><td>Promega</td><td>Cat. # A2495</td><td>plasmid Midiprep</td></tr><tr><td>Plasmid pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>CMV-promoter + EGFP</td></tr><tr><td>Plasmid pDsRed2-N1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>CMV-promoter + DsRed2</td></tr><tr><td>Fast Green dye</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>for dilution in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>10% Ketamine</td><td>Serum Werk, Bernburg, Germany</td><td>Urotamin</td><td>mix in a rate 1:1 with xylazine</td></tr><tr><td>2% Xylazine</td><td>Serum Werk, Bernburg, Germany</td><td>Xylazin</td><td>mix in a rate 1:1 with ketamine</td></tr><tr><td>Sterilium</td><td>Bode Chemie</td><td>Sterillium</td><td>disinfection</td></tr><tr><td>Vet ointment</td><td>S&amp;amp;K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%, Augensalbe</td><td>opthalmic ointment to prevent eye dryness</td></tr><tr><td>To-Pro-3 iodide</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10x PBS, pH 7.4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, Dolormin</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Consumer Health Care Germany</td><td>01094902</td><td>analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief</td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo microinjection and electroporation of mouse testis

Questo contributo video e articolo fornisce una descrizione completa di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Questa particolare tecnica di trasfezione di cellule testicolari del mouse permette lo studio di processi unici in spermatogenesi. Il seguente protocollo si concentra sulla trasfezione delle cellule testicolari del mouse con costrutti plasmidici. In particolare, abbiamo utilizzato il vettore giornalista pEGFP-C1, che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il vettore pDsRed2-N1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (DsRed2). Entrambi i geni reporter codificati erano sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV). Per eseguire il trasferimento genico in testicoli di topo, i costrutti reporter di plasmide vengono iniettate in testicoli di topi viventi. A tal fine, il testicolo di un animale anestetizzato è esposto e il sito di microiniezione è preparato. Il nostro posto preferito diiniezione è il condotto efferente, con la rete testis in ultima analisi, collegato come via di trasporto anatomica degli spermatozoi tra il testicolo e dell&#39;epididimo. In questo modo, il riempimento dei tubuli seminiferi dopo microiniezione è ottimamente gestito e controllato grazie all&#39;utilizzo di soluzioni di DNA macchiati. Dopo aver osservato un ripieno sufficiente del testicolo dalla sua struttura tubulo colorata, l&#39;organo è elettroporata. Questo consente il trasferimento della soluzione di DNA in cellule testicolari. Dopo 3 giorni di incubazione, il testicolo viene rimosso ed esaminato al microscopio per fluorescenza verde o rosso, illustrando il successo trasfezione. Generalmente, questo protocollo può essere impiegato per la consegna DNA o RNA-costruisce in soggiorno topo testicolo per (sopra) esprimere o abbattere i geni, facilitando l&#39;analisi della funzione genica in vivo. Inoltre, è adatto per studiare costrutti reporter o putativo regula geneElementi Tory. Così, i principali vantaggi della tecnica di elettroporazione sono prestazioni veloci in combinazione con il minimo sforzo, così come le attrezzature tecniche moderato e le competenze necessarie rispetto alle tecniche alternative.

L&#39;impostazione sperimentale per l&#39;esecuzione di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo in quanto è utilizzato in base al protocollo è illustrato in Figura 1. Anche se è possibile acquisire micropipette industrialmente, abbiamo preferito di generare le nostre pipette tirando (Figura 1A ) e smussatura (Figura 1B) capillari di vetro in modo che essi montati nostre esigenze. L&#39;attrezzatura per microiniezione ed elettroporazione è illustrato nella Figura 1C. Per ragioni di efficienza di trasfezione, è di importanza di utilizzare un elettroporatore un&#39;onda quadra. La Figura 2 mostra i passaggi chiave della chirurgia mouse con particolare attenzione alla preparazione del condotto efferente. In questo contesto il testicolo è esposto (Figura 2A) e il condotto efferente è identificato con l&#39;osservazione binoculare e rilasciato dal tessuto adiposo (Figure 2B). Successivamente, il dotto efferente è perforato con una pipetta microiniezione e la soluzione plasmide è somministrato (Figure 2C-E). Infine, il testicolo caricata viene schiacciato tra due elettrodi e trasfettate da impulsi ad onda quadra applicata (Figura 2F). Questo approccio trasfezione in vivo permette l&#39;utilizzo di diversi plasmidi codificanti vari geni reporter. Qui abbiamo usato il vettore giornalista pEGFP-C1 (figura 3A), che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il pDsRed2-N1 (Figura 3C) vettore che consente transattivazione di proteina fluorescente rossa (DsRed2). Nel nostro caso, entrambi i geni reporter sono sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV). Al fine di valutare il successo trasfezione, i testicoli microiniettati e elettroporate sono state raccolte 3 giorni dopo l&#39;intera procedura e osservati sotto fluoresmicroscopia scenza (Figura 3). Per un&#39;indagine approfondita, testicoli erano formaldeide-fisso, inclusi in paraffina, affettato (5 micron) e contrastate con A-Pro-3, con conseguente nuclei di colore blu. Infine, le sezioni sono state esaminate al microscopio a fluorescenza. Due esempi di possibili risultati trasfezione può essere visto in Figura 4. L&#39;espressione del gene reporter EGFP è indicato da fluorescenza verde, la transattivazione di DsRed2 è indicato con emissione rossa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51802/51802fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1 Apparecchiatura per microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Capillari di vetro sono formati utilizzando micropipetta estrattore (A), mentre le punte vengono affilati utilizzando la micropipetta beveler ( <sTrong&gt; B). L&#39;unità sia tecniche microiniezione ed elettroporazione è illustrato in (C). Invece di impiegare un micromanipolatore commerciale abbiamo usato un tavolo XYZ-cross di un microscopio e attaccato una unità per tenere la micropipetta. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51802/51802fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51802/51802fig2highres.jpg" /> Figura 2 Illustrazione del testicolo in vivo microiniezione ed elettroporazione procedere nel topo tra cui l&#39;intervento chirurgico prima. L&#39;accesso al testicolo è concesso mediante apertura dell&#39;addome del topo che è stato anestetizzato prima. Il taglio è fatto appena sopra le ghiandole prepuziale. Dopo aver rivelato il testicolo, che viene rilasciato dal grasso addominale pa<html> ds (A). Sotto osservazione binoculare, il condotto efferente viene identificato e liberato grasso. La pipetta microiniezione è posizionato accanto al ductus, mentre la punta dell&#39;ago sia rivolta verso il condotto efferente (B). Il capillare di vetro viene inserito nel dotto e si sposta verso il testicolo a trovarsi direttamente all&#39;interno della rete testis (C). La procedura di applicazione DNA e riempimento dei tubuli seminiferi è monitorato con l&#39;aiuto di Green veloce (D). Solo due terzi del testicolo si riempie per prevenire danni del tessuto (E). Per la fase di elettroporazione finale, il testicolo viene schiacciato tra gli elettrodi pinzetta tipo per applicare impulsi quadri elettrici (F). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51802/51802fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51802/51802fig3highres.jpg" /> Figura 3: tutto il monte testicolo 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione in vivo al microscopio a fluorescenza, testicolo trasfettate di C57BL / 6 del mouse mostra espressione della proteina fluorescente verde -. EGFP (A) e proteina fluorescente rossa - DsRed2 (C) sia codificato in pEGFP- C1 e pDsRed2-N1 plasmide, rispettivamente. L&#39;espressione di entrambi i geni reporter era sotto il controllo del promotore CMV elemento ubiquitariamente attiva. La trasfezione efficace dei tubuli seminiferi mirati è dimostrato da intensità di fluorescenza. Pannelli (B) e (D) illustrano auto-fluorescenza di untransfected testicolo controllo. Barra di scala = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51802/51802fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51802/51802fig4highres.jpg" /> Figura 4. Sezioni di topo testicolo 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione in vivo unilaterale con pEGFP-C1 plasmide. Esito trasfezione di sezioni di testicolo di topo fisso (5 micron) sono mostrati i 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione unilaterale con pEGFP-C1 plasmide. Transfettate con successo testicolare cellsare tubolare indicato dalla fluorescenza verde. TO-PRO-3 nuclei controcolorate sono rilevabili mediante emissione blu (A e B). Le strutture circolari sono tipici per l&#39;organizzazione delle cellule nei tubuli seminiferi. Barra della scala = 20 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51802/51802fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

27.8K Views.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN).  Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione. 

Video: In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Ricerca

Biologia

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfection DNA dei mammiferi muscoli scheletrici con In Vivo Elettroporazione

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. However, the time and cost associated with colony creation and maintenance are high. Recent advances in CRISPR-mediated genome editing have allowed the generation of somatic GEMMs (S-GEMMs) by directly targeting the cell/tissue/organ of interest.
The oviduct, or fallopian tube in humans, is considered the tissue-of-origin of the most common ovarian cancer, high-grade serous ovarian carcinomas (HGSCs). HGSCs initiate in the region of the fallopian tube distal to the uterus, located adjacent to the ovary, but not the proximal fallopian tube. However, traditional mouse models of HGSC target the entire oviduct, and thus do not recapitulate the human condition. We present a method of DNA, RNA, or ribonucleoprotein (RNP) solution microinjection into the oviduct lumen and in vivo electroporation to target mucosal epithelial cells in restricted regions along the oviduct. There are several advantages of this method for cancer modeling, such as 1) high adaptability in targeting the area/tissue/organ and region of electroporation, 2) high flexibility in targeted cell types (cellular pliancy) when used in combination with specific promoters for Cas9 expression, 3) high flexibility in the number of electroporated cells (relatively low frequency), 4) no specific mouse line is required (immunocompetent disease modeling), 5) high flexibility in gene mutation combination, and 6) possibility of tracking electroporated cells when used in combination with a Cre reporter line. Thus, this cost-effective method recapitulates human cancer initiation.

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

This protocol describes microinjection and in vivo electroporation for regionally restricted CRISPR-mediated genome editing in the mouse oviduct.

Modelli murini di ingegneria genomica somatica mediante microiniezione ed elettroporazione in vivo

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Ricerca sul cancro

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes are critical for the investigations of spindle assembly and chromosome segregation in male meiotic division. The mouse spermatocyte is an ideal model for mechanistic studies of meiosis, however, the effective methods for the analyses of spermatocytes are lacking. In this article, a practical and efficient method for the in vivo inhibition of kinesin-7 CENP-E in mouse spermatocytes is reported. A detailed procedure for testicular injection of a specific inhibitor GSK923295 through abdominal surgery in 3-week-old mice is presented. Furthermore, described here is a series of protocols for tissue collection and fixation, hematoxylin-eosin staining, immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy. Here we present an in vivo inhibition model via abdominal surgery and testicular injection, that could be a powerful technique to study male meiosis. We also demonstrate that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and metaphase arrest in primary spermatocytes during meiosis I. Our in vivo inhibition method will facilitate mechanistic studies of meiosis, serve as a useful method for genetic modifications of male germ lines, and shed a light on future clinical applications.

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

This article reports an in vivo inhibition of CENP-E through abdominal surgery and testicular injection of GSK923295, a valuable model for male meiotic division. Using the immunofluorescence, flow cytometry and transmission electron microscopy assays, we show that CENP-E inhibition results in chromosome misalignment and genome instability in mouse spermatocytes.

Valutazione funzionale della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti mediante inibizione in vivo , immunofluorescenza e citometria a flusso

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...