Name: biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
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Work in the authors' laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.

1 ATP-dipendenti nucleosoma ritocca saggi Per misurare ATP-dipendente attività nucleosoma rimodellamento, immunopurified INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono incubati con ATP e un substrato mononucleosomal, che contiene un singolo nucleosoma posizionato ad una estremità di un frammento di DNA di 216 bp, 32 P-marcato. I prodotti di reazione vengono quindi sottoposti ad elettroforesi in gel di poli-acrilammide native. <ol><li> Per generare il P-marcato, &#39;601&#39; frammento di DNA 32, amplificare da pGEM-3Z-601 4 un frammento di DNA 216 bp contenente un 601 nucleosoma sequenza di posizionamento finale in posizione, utilizzando gli oligonucleotidi 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG come avanti e retromarce primer. <ol><li> Impostare un 100 microlitri reazione di PCR come descritto nella Tabella 1. </li><li> Eseguire le reazioni PCR in un termociclatore con il seguente programma: 1 min a 96 ° C, followed da 45 sec a 94 ° C, 30 sec a 57 ° C, 60 sec a 72 ° C per 30 cicli; termina con 7 min a 72 ° C. </li><li> Dopo la reazione di PCR, rimuovere i nucleotidi non incorporati facendo passare i prodotti di reazione per due volte attraverso le colonne di spin priva di nucleasi. </li><li> Eseguire 5 ml di prodotto purificato PCR in un gel di agarosio 1,2% per confermare che la reazione di PCR generato il ~ 216 bp frammento di DNA desiderato. </li><li> Diluire 5 ml di prodotto di PCR purificato 20 volte, e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. La resa media è ~ 40 ng / ml. </li><li> Misurare la radioattività di 1 ml di prodotto purificato PCR in un contatore a scintillazione. Stimare l&#39;efficienza di etichettatura calcolando il cpm / ng. Una reazione di marcatura di successo si prevede di cedere ~ 15.000 cpm / ng di 601 frammento di DNA. </li></ol></li><li> Trasferimento nucleosomi cellule Hela sul marcato 601 DNA utilizzando un metodo di diluizione in serie 5. <ol><li> Mescolare 2 pmol di32 P-601 frammento di DNA marcato con 6 mg di nucleosomi Hela (preparato come descritto 5) in 50 ml di un tampone contenente 1,0 M di NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT e incubare a 30 ° C per 30 min. </li><li> Sequenziale diluire la miscela a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M di NaCl per diluizione con 12,5 ml, 20,8 ml, e 41,6 ml, rispettivamente, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT, con 30 minuti di incubazione a 30 ° C dopo ogni diluizione. </li><li> Diluire ulteriormente la miscela a 0,2 M e 0,1 M di NaCl per aggiunta di 125 ml e poi 250 ml dello stesso tampone contenente 0,1% di Nonidet P-40, 20% glicerolo, e 200 mg / ml BSA, con 30 min di incubazione a 30 ° C tra le ultime due diluizioni. Conservare il substrato mononucleosome a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol></li><li> Eseguire reazioni nucleosoma scorrevole ATP-dipendenti in un volume totale di 10 microlitri. La reaction componenti sono elencati nella Tabella 2. Poiché la concentrazione ottimale di NaCl per INO80 attività nucleosoma rimodellamento è ~ 50 mM NaCl (risultati non pubblicati), regolare la concentrazione totale di NaCl in ogni reazione a 50 mm, tenendo conto della quantità di NaCl contenuta in preparazioni di nucleosomi ed enzimi. <ol><li> Prima di iniziare a creare i saggi, espressi poli-acrilammide gel nativi (18 x 16 cm). Per preparare un singolo gel contenente il 5% di acrilammide (acrilammide: bisacrilammide 37.5: 1), 0.5x TBE (Tris 45 mM borato, 1 mM EDTA), 0,01% di ammonio persolfato (APS), e il 0,001% N, N, N, N&#39;-tetramethylethylenediamine (TEMED), mescolare gli ingredienti elencati nella tabella 3. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Nel frattempo, per ogni reazione da eseguire, unire in un pre-raffreddata siliconato provetta da 1,5 ml microcentrifuga ~ 20 nM INO80 o INO80 subcomplesso (preparato come descritto 3) con una quantità di tampone EB100 ( <strong&gt; Tabella 4) sufficiente ad ottenere un volume di 4,75 ml. Immediatamente ri-congelare tutte le rimanenti frazioni-INO80 contenenti ghiaccio secco in polvere o azoto liquido. </li><li> Impostare un cocktail master con il resto degli ingredienti, scaling up di un fattore &#39;X&#39; (dove X = numero totale di reazioni +3). La quantità di ogni ingrediente necessario per una singola reazione di 10 microlitri è elencato nella Tabella 5; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di reazioni da eseguire. Mescolare bene toccando il tubo o pipettando su e giù con un Pipetman e far girare il tubo per alcuni secondi in una microcentrifuga da banco. </li><li> Dispensare 5,25 ml di cocktail master per ciascuna delle provette di reazione istituito nel punto 1.3.2. Mescolare bene pipettando su e giù. Iniziate le reazioni con il trasferimento di provette di reazione in un bagno a 30 ° C blocco di calore o acqua e incubare per 2 ore. </li><li> Nel frattempo, preparare &#39;la rimozione mix&#39; cocktail contenente concorrente DNAe nucleosomi, scaling up di un fattore X (X = numero totale di reazioni + 4). La quantità di ogni ingrediente necessario per preparare 1,5 microlitri rimozione di mix per una singola reazione è elencato nella Tabella 6; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di test da eseguire. </li><li> Terminate le reazioni con l&#39;aggiunta di 1,5 ml di miscela rimozione. Mescolare bene, centrifugare, e incubare a 30 ° C per altri 30 min. </li><li> Nel frattempo, pre-eseguire il gel di poliacrilammide nativo in una unità di elettroforesi verticale a 100 V per 30 minuti a 4 ° C, usando TBE 0.5x come tampone di corsa con un ancoretta magnetica all&#39;interno della camera inferiore per mantenere costante la circolazione del buffer. </li><li> Per caricare il campione, aggiungere 2,5 ml di loading dye contenenti 3x TBE, 30% glicerolo, 0,25% blu di bromofenolo, e lo 0,25% xilene Cyanol FF. Mescolare bene, far girare brevemente i campioni, e caricare sul gel con punte di carico. </li><li> Attivare il gel a 200 V per 4,5 ore a 4 ° C con circolazione tampone.</li><li> Per rilevare il segnale, trasferire il gel ad una pila di due fogli di carta da filtro. Avvolgere la carta da filtro con il gel sulla parte superiore con involucro di plastica trasparente, e poi esporlo a uno schermo di archiviazione al fosforo a 4 ° C per il tempo desiderato. </li><li> Scansione lo schermo con un sistema di scanner di imaging isotopi e analizzare i dati utilizzando un software adatto. </li></ol></li></ol> 2 Mononucleosome saggi Binding Per saggiare l&#39;affinità di legame di un dato complesso INO80 per mononucleosomes, effettuare uno spostamento di mobilità elettroforetica Assay (EMSA) utilizzando il substrato mononucleosomal generato nel passaggio 1.2. <ol><li> Impostare la reazione Miscele per saggi di legame come descritto per i test di rimodellamento nucleosoma ma omettere l&#39;ATP e il mix di rimuovere dalle reazioni; incubare a 30 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di loading dye per ciascuna miscela di reazione, e si applicano a un gel di poliacrilammide nativo contenente 3,5% di acrilammide (acrilammide: 3 bis7.5: 1), 1% glicerolo, TBE 0.5x, 0,01% APS, e il 0,001% TEMED. </li><li> Utilizzando TBE 0.5x come tampone di corsa, eseguire il gel a 200 V per 2,5 ore a 4 ° C con la circolazione del buffer ed esporre a una schermata di archiviazione fosforo. </li></ol> 3. DNA-e Nucleosome-dipendenti ATPasi saggi Eseguire saggi ATPasi in miscele di reazione 5 microlitri contenenti 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glicerolo, 0,1 mg / ml di BSA, 1 DTT mM, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 μCi di [α- 32 P] ATP (3.000 Ci / mmol). Per ogni complesso INO80 o la quantità di complessi INO80 da dosare istituire tre reazioni parallele, uno contenente tampone EB100 per misurare DNA o nucleosoma-indipendente ATPasi, uno contenente chiuso DNA plasmide circolare (5.000 bp, ~ 30 nM) per misurare il DNA ATPasi dipendente, e uno contenente Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) per misurare nucleosoma-dipendente ATPasi. Impostare tutte le reazioni su ghiaccio. <ol&gt; <li> Per ogni reazione, combinare 10-50 nM dei INO80 o INO80 Sottocomplessi immunopurified con una quantità di tampone EB100 sufficiente a fornire un volume di 2,2 ml in lubrificati provette da 1,5 ml microcentrifuga pre-refrigerati. Immediatamente ri-congelare eventuali frazioni-INO80 contenenti ghiaccio secco in polvere o azoto liquido. </li><li> Impostare un cocktail master. La quantità di ogni ingrediente necessario per una singola reazione è elencato nella Tabella 7. Scalare la ricetta di scaling up di un fattore 3 (x + 2) +1, dove X = il numero di preparati INO80 da dosare. </li><li> Per preparare contenente tampone &#39;sotto-cocktail&#39; solo, DNA, o nucleosomi, dispensare 2,5 (x + 2) microlitri del cocktail maestro in tre tubi separati. Aggiungere 0,3 (x + 2) ml di entrambi EB100, il DNA plasmide circolare chiuso (1.5 mg / mL), o Hela oligonucleosomes (1.5 mg / mL) e mescolare bene. </li><li> Dispensare 2.8 ml di appropriata sub-cocktail per le provette di reazione-enzima contenente istituiti in vep 3.1. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare; evitare di introdurre bolle. </li><li> Per avviare reazioni, trasferire le provette di reazione ad un blocco di calore C a 30 °. </li><li> Dopo 5, 15, 30, e 60 min di incubazione, individuare 0,5 ml di ogni miscela di reazione su una cromatografia su strato sottile di cellulosa polietileneimmina (TLC) piastra (20 x 10 cm) in linea retta di almeno 1,5 cm dal bordo inferiore . Riportare immediatamente provette di reazione al blocco di calore 30 ° C in modo più punti di tempo possono essere presi da un unico tubo. Dopo di macchie, pulire le piastre TLC utilizzando un asciugacapelli. </li><li> Trasferire le piastre TLC ad una camera di vetro contenente abbastanza 0,375 M di fosfato di potassio (pH 3,5) per consentire la parte inferiore 0,5 cm la piastra TLC di essere immersi nella soluzione. </li><li> Coprire la camera, e sviluppare fino alla parte anteriore della fase liquida raggiunge la parte superiore delle piastre TLC. Immediato asciugare le piastre accuratamente con un asciugacapelli. </li><li> Esporre le piastre TLC secchi per uno schermo di archiviazione Phosphor a RT.Scansione lo schermo con un sistema di scanner di imaging isotopo e determinare la quantità di substrato ATP radioattivo e di prodotto ADP. </li><li> Per calcolare la quantità di ATP idrolizzata, moltiplicare ATP% idrolizzato dalla quantità di ATP presenti nella miscela di reazione partendo con la seguente formula: pmol ATP idrolizzata = 10 pmol ATP partendo reazione x [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Per garantire che il rimodellamento dei nucleosomi e le attività ATPasi che osserviamo nei test dipendono l&#39;attività catalitica di complessi INO80, e non sulla contaminazione di rimodellamento e / o enzimi ATPasi, abbiamo nucleosomi regolarmente test rimodellamento e l&#39;attività ATPasica di versioni cataliticamente inattive di complessi INO80, purificata in parallelo con wild type INO80 utilizzando la stessa procedura. Una reazione di controllo negativo manca ATP dovrebbe essere eseguita quando saggiando l&#39;attività di rimodellamento dei nucleosomi per verificare la presenza di contaminanti ATP e / o attività di rimodellamento ATP-indipendenti, che potrebbe complicare l&#39;interpretazione degli esperimenti a confronto le attività delle diverse preparazioni di complesso INO80 o Sottocomplessi. Cataliticamente versioni inattive di INO80 o Sottocomplessi INO80 devono presentare nessun rimodellamento dei nucleosomi o attività ATPasi. Inoltre, la rilevazione di DNA o nucleosoma-indipendente ATPasi indica la presenza di contaminanti ATPasi (s) in enzimae frazione. Se l&#39;attività viene ancora rilevato in presenza di attività catalitica INO80 o se vi è sostanziale DNA o attività ATPasi nucleosoma-indipendente anche dopo l&#39;ottimizzazione purificazione come descritto in &#39;Rappresentante dei risultati,&#39; complessi possono essere ulteriormente purificati mediante ulteriori misure quali lo scambio ionico o cromatografia di gel filtrazione o sedimentazione gradiente. Quando la misurazione rimodellamento nucleosoma e attività ATPasi, si consiglia di effettuare saggi per diversi periodi di tempo e con più di una concentrazione della INO80 o Sottocomplessi INO80 per garantire misure vengono prese quando il prodotto-time e curve dose-risposta è lineare. Allo stesso modo, vincolante nucleosoma test devono essere eseguiti utilizzando diverse concentrazioni di complesso INO80 (ES); in caso contrario, non si può confrontare in modo affidabile le attività delle diverse preparazioni INO80. Nucleosoma scorrevole e saggi di legame dovrebbe sempre includere reazioni di controlloche includono mononucleosome substrato da solo come un indicatore per mostrare la mobilità elettroforetica della popolazione a partire nucleosoma. In questo modo, si può facilmente identificare variazioni dovute specificamente alla presenza della frazione enzima. Tali reazioni di controllo anche valutare l&#39;integrità dei mononucleosomes ricostituiti. Al fine di condurre nucleosoma facilmente interpretabili scorrevole e saggi di legame, è utile generare substrati mononucleosomal omogenei; per questo motivo, il test descritto in questo protocollo utilizza nucleosomi montate su un frammento di DNA contenente una forte sequenza di posizionamento nucleosoma. Sebbene il complesso INO80 tende a riposizionare nucleosomi posizionati lateralmente ad una posizione più centrale su un frammento di DNA, altri enzimi rimodellamento della cromatina, come il complesso NURF ISWI contenenti 9, muovono nucleosomi da posizioni più centrali verso le estremità dei frammenti di DNA. Così, durante la caratterizzazione di qualsiasi rimodellamento cromatina itZYME è utile preparare substrati mononucleosome in cui la sequenza di posizionamento nucleosoma è in luoghi diversi. In alternativa, si può impiegare substrati in cui nucleosomi sono stati montati su frammenti di DNA, senza una sequenza di posizionamento nucleosoma. In questo caso, la popolazione iniziale nucleosoma includerà una miscela di nucleosomi più centralmente e lateralmente posizionati. Il processo di rimodellamento dei nucleosomi ATP-dipendente può portare a diversi risultati di rimodellamento, tra cui completa spostamento nucleosoma dal DNA, movimento nucleosomi sul DNA, o alterazioni transitorie della struttura del nucleosoma che non può portare a cambiamenti nelle posizioni dei nucleosomi una volta la reazione raggiunge l&#39;equilibrio ma sono comunque funzionalmente significative. Il saggio nucleosoma scorrevole descritto in grado di monitorare le prime due reazioni, ma non può essere in grado di rilevare le alterazioni transitorie nella struttura nucleosoma. Un test in grado di rilevare alcuni tale alt transitoriarazioni sfrutta il fatto che il DNA nucleosomal sulla superficie del ottamero nucleosoma è in gran parte inaccessibile al taglio con un enzima di restrizione, mentre linker DNA che è stato spostato dalla superficie ottamero da nucleosomi scorrevole o parziale svolgimento del DNA nucleosomal è suscettibile al taglio 10,11,12. Tale dosaggio può essere particolarmente utile nel caso in cui il rimodellamento enzima nucleosoma si lega così strettamente ad un substrato che non può essere rimosso dal concorrente 13. Il nostro nucleosoma scorrevole e vincolante test misurano le attività INO80 utilizzando substrati mononucleosomal preparati con nativi istoni cellule Hela. Tuttavia, rimodellamento attività di INO80 o di altri enzimi di rimodellamento della cromatina possono, in linea di principio essere influenzati dalla presenza o assenza di specifiche modificazioni post-traduzionali o varianti istoniche. Inoltre, mononucleosomes possono stimolare le attività complesse di INO80 diverso rispetto a di-nucleosomi,o una serie di nucleosomi. Pertanto, le attività di misura complesse INO80 utilizzando più complessa e diversificata substrato nucleosomal possono fornire una conoscenza del meccanismo con cui INO80 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolati. In alternativa all&#39;utilizzo di frammenti di DNA radiomarcato nel rimodellamento nucleosoma e saggi di legame, alcuni ricercatori visualizzare nucleosomi e / o DNA mediante colorazione DNA nucleosomal con bromuro di etidio 14; Tuttavia, i saggi eseguiti utilizzando metodi di rilevamento non radioattivi può essere molto meno sensibile di quello descritto in questo protocollo, in genere richiedono l&#39;uso di molto più enzimi. Monitorare lo stato di avanzamento delle reazioni ATPasi in funzione del tempo usando il saggio base-P 32 qui descritta richiede round di manipolazione del campione e di analisi in ogni punto di tempo. Come approccio alternativo, ATPasi attività può essere misurata mediante saggi basati fluorescenza <sup&gt; 15,16, che sfruttano il fatto che la variazione del segnale di fluorescenza può essere facilmente monitorata in tempo reale, fornendo così una migliore possibilità di monitorare conversione del substrato in prodotto in tempo reale. Tali test possono, tuttavia, essere tecnicamente impegnativo e sono in generale meno sensibile rispetto al test qui descritto. Le procedure che abbiamo descritto in questo documento JOVE sono stati utilizzati per caratterizzare tre diverse proprietà biochimiche di INO80 o INO80 Sottocomplessi nel processo di ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Utilizzando vari Sottocomplessi INO80 o mutanti INO80 in questi saggi, è possibile sezionare i contributi funzionali di varie subunità INO80 e / o strutture di dominio all&#39;attività rimodellamento INO80 nucleosoma e definire passo (s) nella reazione rimodellamento in cui subunità INO80 e / o domini possono essere importanti. Queste procedure possono essere adattati per lo studio di altri rimodellamento nucleosomi ed enzimi vincolanti e ATPasi wesimo sia DNA e attività nucleosoma-dipendenti o indipendenti. Si noti che diversi enzimi di rimodellamento della cromatina possono avere attività ATPasi o rimodellamento dei nucleosomi superiori o inferiori intrinseci rispetto al complesso INO80 umano. Quindi, quando adegua questi protocolli per l&#39;analisi di altri enzimi cromatina rimodellamento, si dovrebbe variare concentrazioni di enzima, ATP, DNA o nucleosomi, ei tempi e / o temperature di reazione al fine di ottimizzare i dosaggi per gli enzimi particolari allo studio.

SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina famiglia includono un centro SNF2-come ATPasi subunità 1,2. Alcune funzioni ATPasi SNF2-come come enzimi singole subunità, mentre altri funzionano come la subunità catalitica di grandi complessi multi-subunità. Chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali ciascuna delle subunità dei complessi di rimodellamento della cromatina contribuiscono alla loro attività richiede la capacità di effettuare saggi biochimici che sezionano il processo di rimodellamento. ATP-dipendente rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80 umano e di altri enzimi rimodellamento della cromatina può essere immaginato come un processo multi-step che inizia con il legame dell&#39;enzima rimodellamento di nucleosomi, seguita dall&#39;attivazione del suo DNA e / o nucleosoma-dipendente ATPasi, traslocazione dell&#39;enzima rimodellamento sul DNA nucleosomal, ed eventuale riposizionamento dei nucleosomi 1,2. Comprendere i dettagli molecolari del ATP-dipendente processo di rimodellamento della cromatina requires dissezione della reazione rimodellamento nelle sue singole fasi e la definizione dei contributi delle singole subunità del complesso rimodellamento della cromatina per ogni fase della reazione. Tali analisi richiedono la capacità di analizzare il rimodellamento dei nucleosomi e altre attività utilizzando substrati molecolari definite in vitro. In un protocollo JOVE precedente, abbiamo descritto le procedure utilizzate per generare INO80 complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi con composizioni subunità definite 3. Qui, vi presentiamo tre saggi biochimici che permettono l&#39;analisi quantitativa del legame, DNA e nucleosomi attivato ATPasi, e le attività di rimodellamento nucleosoma associati a tali complessi nucleosoma.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR reaction buffer&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>Roche Taq DNA Polymerase</td><td>Roche Applied Science&amp;nbsp;</td><td>11435094001</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Nuclease-free Spin Columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Cat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ultrapure ATP&amp;nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonicated salmon sperm DNAs&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% ammonium persulfate (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonase&amp;nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Cat. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR thermal cycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer vertical electrophoresis unit</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM filter paper</td><td>Whatman&amp;nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe</td><td>Biodex</td><td>Model 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemical assays for analyzing activities of atp-dependent chromatin remodeling enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Le figure mostrano risultati rappresentativi di saggi biochimici utilizzati per caratterizzare attività INO80, tra cui nucleosoma scorrevole (figura 1) e vincolante (Figura 2) saggi e DNA o saggi ATPasi nucleosoma-dipendente (Figura 3). L&#39;esperimento mostrato in Figura 1 confronta la capacità di complessi INO80 intatti purificato attraverso FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E e INO80 Sottocomplessi purificato attraverso sia FLAG-Ino80ΔN o Ino80ΔNΔHSA di catalizzare rimodellamento di mononucleosomes montati su un 216 bp, frammento di DNA radioattivo. La posizione del nucleosoma sul frammento di DNA influisce mobilità elettroforetica; lateralmente nucleosomi posizionati più veloci nel gel di nucleosomi posizionati più centralmente. Dal INO80 complessi di rimodellamento della cromatina preferenzialmente mononucleosomes muovono verso il centro di un pezzo di 6,7,8 DNA, l&#39;attività di rimodellamento è monisbranati dalla comparsa di una popolazione di nucleosomi che mostrano una diminuita mobilità elettroforetica. Al termine della reazione, un eccesso di oligonucleosomes Hela e sperma di salmone o di altro DNA deve essere aggiunto alla miscela di reazione come concorrente per rimuovere eventuali INO80 o INO80 Sottocomplessi substrato-bound, in quanto legato rimodellamento enzima cambierà la mobilità elettroforetica del nucleosoma substrato. Complessi purificati attraverso Ino80ΔN FLAG mancano le subunità specifica-metazoi INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB, e UCH37, mentre complessi purificati attraverso Ino80ΔNΔHSA mancano anche Arp4, Arp8, e YY1. Complessi purificati attraverso FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, e FLAG-Ino80ΔN hanno attività analoghe, che indica che le subunità specifica-metazoi sono indispensabili per il rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80. Al contrario, i complessi purificati attraverso FLAG-Ino80ΔNΔHSA non sono attive in questo saggio, che indica che l&#39;attività di rimodellamento dipende dal dominio HSA della INO80 ATPase e / o le sue subunità associate. Gli esperimenti in figura 2 confronta la attività di INO80 e INO80 Sottocomplessi utilizzando saggi di mobilità elettroforetica turno vincolante nucleosoma. Questi test vengono eseguiti in modo simile ai test di rimodellamento nucleosoma, salvo che non vi è alcuna aggiunta di oligonucleosomes e DNA al termine della reazione per rimuovere complessi nucleosoma-bound. Di conseguenza, l&#39;incubazione di nucleosomi con quantità crescenti di complessi INO80 intatti purificato attraverso la subunità INO80E porta ad una scomparsa dose-dipendente della banda corrispondente a mononucleosomes liberi e comparsa di un nuovo &#39;spostato&#39; specie che migra vicino alla parte superiore del gel (corsie 6-8). Al contrario, quando nucleosomi vengono incubati con complessi più piccoli che erano stati purificati attraverso Ino80ΔN e che mancano di un sottoinsieme di subunità INO80, la specie spostate migra più rapidamente (corsie 2-5 e 9-11), suggerendo che la relativa mobilità della banda super-variata viene determinata dalla dimensione dei complessi saggiati. La Figura 3 mostra i risultati di un test confrontando il DNA e nucleosoma attivato attività ATPasi di due diverse Sottocomplessi INO80. Le macchie più lentamente migrazione corrispondono alla partenza α- 32 P etichettato ATP, e le specie più rapidamente che migrano sono prodotti di reazione ADP; le frecce indicano la direzione di migrazione solvente. Uno dei complessi analizzati qui, INO80ΔN, comprende una subunità INO80 ATPasi che si estende al normale C-terminale della proteina, mentre l&#39;altro, INO80ΔNC, manca della regione C-terminale INO80. Anche se questi due complessi sono identiche, il tasso di idrolisi (misurata mediante conversione di ATP radio-marcato a ADP) è maggiore in presenza di INO80ΔNC, suggerendo la C-terminale della INO80 ATPasi può regolare negativamente la sua attività. Si noti che il tasso di ATP hydrolysis da entrambi i complessi è maggiore in presenza di nucleosomi di DNA, suggerendo il nucleosoma INO80 rimodellamento complessi preferiscono substrati nucleosomal per idrolisi dell&#39;ATP. Nel test mostrato in figura, c&#39;è solo un livello molto basso di idrolisi nelle reazioni prive di DNA o nucleosomi (dai rilevabile a &lt;5% di quella osservata in presenza di DNA / nucleosomi). Poiché l&#39;attività ATPasi di INO80 e di altri enzimi di rimodellamento della cromatina SNF2 famiglia è fortemente stimolato da DNA o nucleosomi, la presenza di una sostanziale DNA e / o attività ATPasi nucleosoma-indipendente nelle preparazioni purificate del complesso INO80 suggerirebbe la presenza di contaminanti cellulare DNA, o in alternativa, contaminando ATPasi non INO80 che non sono stati rimossi con successo durante la purificazione. Diverse misure possono essere prese per ridurre al minimo l&#39;introduzione di DNA indesiderati e / o ATPasi durante la purificazione. 1) Aumentare le sconcentrazione alt (NaCl) nei passi vincolanti e lavaggio durante la purificazione. L&#39;uso di NaCl inferiore a 200 mm nel legare e fasi di lavaggio di solito produce preparazioni di complessi di rimodellamento con livelli inaccettabili di contaminazione del DNA e / o ATPasi. Noi abitualmente purificare complessi INO80 utilizzando un tampone contenente 450 mM NaCl per ridurre al minimo i contaminanti (descritto in 3). Abbiamo usato tamponi contenenti il ​​più 1 M NaCl per purificare complessi INO80 attivi; tuttavia, si ottiene un rendimento diminuito di complessi attivi in ​​queste condizioni; 2) Diminuire il rapporto di FLAG agarosio al lisato cellulare durante immunopurification; la quantità ottimale di FLAG-agarosio dovrebbe essere determinata mediante titolazione; 3) accompagnatori ATP-dipendenti possono rimanere legato alle proteine ​​FLAG-tagged durante immunopurification. Questi possono spesso essere rimossi includendo 1 mM ATP nel buffer di lavaggio durante immunopurification; 4) Abbiamo di successoy Rimosso contaminazione del DNA includendo benzonasi ad una concentrazione di 25 unità / ml durante l&#39;incubazione di estratto con perline FLAG-agarosio. ATTENZIONE: E &#39;essenziale assicurarsi che benzonasi viene rimosso durante le fasi di lavaggio successive, come DNasi residua degradare DNA substrato o nucleosomi durante il test per l&#39;attività INO80. L&#39;interpretazione di questi test ATPasi potrebbe, in linea di principio, essere complicata dal fatto che i complessi INO80 rimodellamento della cromatina contengono diversi ATPasi potenziale, compreso il SNF2-come nucleo ATPasi INO80, actina-come le proteine ​​ARP5, Arp8, Baf53a, actina, e la AAA + ATPasi Tip49a e Tip49b. Nonostante la presenza fisica di più ATPasi, tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che solo i complessi contenenti cataliticamente attivo INO80 può supportare DNA o nucleosomi attivato ATP idrolisi; complessi contenenti la forma E653Q cataliticamente inattiva di INO80 ATPasi non riescono a esporre DNA rilevabile o nucleosoma-ATPasi stimolata actività in qualsiasi condizione testato 8. Così, DNA e / o attività ATPasi nucleosoma-stimolata di INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono conferiti principalmente dalla subunità INO80 ATPasi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg" /> Figura 1 INO80 attività nucleosoma rimodellamento dipende dal dominio INO80 HSA e / o subunità associate, ma è indipendente dal INO80 NTD e subunità specifica-metazoi. Saggi rimodellamento dei nucleosomi sono stati effettuati con complessi FLAG-immunopurified da estratti nucleari ottenuti da linee cellulari che esprimono FLAG versioni -tagged di tipo selvatico o subunità INO80 mutanti. Complessi INO80 intatte sono stati purificati da linee cellulari che esprimono FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E; Sottocomplessi INO80 sono stati purificati da linee cellulari che esprimono FLAG-Ino80ΔN o FLAG-Ino80ΔNΔHSA. Una concentrazione relativa (rel. Conc.) Di 1 corrisponde a ~ 10 nM complesso INO80. <a<html> href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51721/51721fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51721/51721fig2highres.jpg" /> Figura 2 nucleosomi vincolante dal complesso INO80 è indipendente dal INO80 NTD e subunità specifica-metazoi. Nucleosoma saggi di legame sono stati eseguiti in presenza di quantità variabili della indicata complesso INO80 FLAG-immunopurified. Il legame di INO80 o Sottocomplessi INO80 per mononucleosomes risultati nella nascita di bande lenta migrazione &quot;super-spostato&quot; corrispondenti a mononucleosomes stabilmente vincolati da INO80 o Sottocomplessi INO80. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51721/51721fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3 DNA e saggi ATPasi nucleosoma-dipendenti. TLC (cromatografia su strato sottile) a base di saggi ATPasi sono stati eseguiti per misurare il tasso di idrolisi da INO80 Sottocomplessi purificato attraverso FLAG-Ino80ΔN (ΔN) o FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) in la presenza di saturare quantità di DNA o nucleosomi. I saggi sono stati eseguiti utilizzando due diverse concentrazioni di ciascun complesso (5 nM e 10 nM) e per i tre tempi di reazione diversi. La quantità di ATP idrolizzata (in pmol) nelle reazioni è indicata sotto ogni pannello. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51721/51721fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 67,5 ml </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 10 microlitri </td><td> 10x PCR tampone di reazione (vedi Materiali List) </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 1 ml </td><td> pGEM-3Z-601 (10 ng / ml) </td></tr><tr><td> 5 ml </td><td> primer forward (10 micron) </td></tr><tr><td> 5 ml </td><td> primer reverse (10 micron) </td></tr><tr><td> 0,5 microlitri </td><td> soluzione madre contenente dNTP 10 mM ciascuno dei 4 dNTP </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> Taq DNA polimerasi (5 unità / ml) </td></tr><tr><td> 10 microlitri </td><td> [Α- 32 P] dCTP (6.000 Ci / mmol, 3,3 mM) </td></tr></tbody></table> Tabella 1 mix di reazione per l&#39;amplificazione PCR del frammento radioattivo &#39;601&#39; DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 20 nM </td><td> INO80 o INO80 Sottocomplessi </td></tr><tr><td> 2.8 nM </td><td> nucleosomi (costituiti da una miscela di mononucleosomes sui 32 P-marcato 601 frammento di DNA e cellule Hela nucleosomi) </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> ultrapura ATP </td></tr><tr><td> 20 mM </td><td> HEPES-NaOH (pH 7.9) </td></tr><tr><td> 50 mM </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> ditiotreitolo (DTT) </td></tr><tr><td> 0,1 mm </td><td> phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) </td></tr><tr><td> 0,1 mg / ml </td><td> albumina di siero bovino (BSA) </td></tr><tr><td> 5% </td><td> glicerina </td></tr><tr><td> 0,02% </td><td> Nonidet P-40 </td></tr><tr><td> 0,02% </td><td> Triton X-100 </td></tr></tbody></table> Tabella 2 Componenti del nucleosoma ATP-dipendente rimodellamento saggi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 32,6 ml </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 5 ml </td><td> 40% acrilamide / Bis (37,5: 1) </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10x TBE (Tri 900 mms-borato, 20 mM EDTA) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere i seguenti ingredienti immediatamente prima di versare il gel: </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> 10% persolfato di ammonio </td></tr><tr><td> 0,1 ml </td><td> TEMED </td></tr></tbody></table> Tabella 3 Preparazione di gel di poliacrilammide nativo per nucleosoma rimodellamento test ATP-dipendente. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 10 mM </td><td> HEPES pH 7.9 </td></tr><tr><td> 10% </td><td> glicerina </td></tr><tr><td> 100 mM </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 1,5 mm </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% </td><td> TritonX-100 </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere poco prima dell&#39;uso: </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td></tr><tr><td> 200 micron </td><td> PMSF </td></tr><tr><td> 1: 1.000 diluizione </td><td> Inibitore della proteasi Cocktail (vedi Materiali List) </td></tr></tbody></table> Tabella 4 buffer di EB100. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 3.9 ml </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> 10x rimodellamento Buffer (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% glicerolo, 50 mM MgCl 2, 1 mg / ml BSA) </td></tr><tr><td> 0,1 microlitri </td><td> ATP 100 mM </td></tr><tr><td> 0.01 microlitri </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.01 microlitri </td><td> PMSF 100 mM </td></tr><tr><td> 0.25 microlitri </td><td> substrato mononucleosome ricostituito dal punto 1.2 </td></tr></tbody></table> Tabella 5 Componenti del cocktail master per nucleosoma rimodellamento test ATP-dipendente. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 0.33 microlitri </td><td> 400 nucleosomi nM Hela </td></tr><tr><td> 0,75 ml </td><td> 100 Nm di salmone sonicati DNA dello sperma </td></tr><tr><td> 0.01 microlitri </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.01 microlitri </td><td> PMSF 100 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 6 Rimozione cocktail mix. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 microlitri </td><td> H 2 O </td></tr><tr><td> 0.25 microlitri </td><td> 20x ATPasi Buffer contenente 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 200 mM, 132 mM MgCl 2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% glicerolo, 2 mg / ml di BSA </td></tr><tr><td> 0,1 microlitri </td><td> 100 mM ATP </td></tr><tr><td> 0.005 ml </td><td> 1 M DTT </td></tr><tr><td> 0.005 ml </td><td> PMSF 100 mM </td></tr><tr><td> 0,1 microlitri </td><td> [Α- 32 P] ATP (3.000 Ci / mmol) </td></tr></tbody></table> &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabella 7 Componenti del cocktail master per saggi ATPasi.

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Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

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Universidad San Sebastian

Research

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14.7K Views.  Stowers Institute for Medical Research. Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

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Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous nature of most mammalian chromatin-modifying complexes. In order to overcome these hurdles, we have adapted a sequential salt extraction (SSE) assay for evaluating the relative binding affinities of chromatin-bound complexes. This easy and straightforward assay can be used by non-experts to evaluate the relative difference in binding affinity of two related complexes, the changes in affinity of a complex when a subunit is lost or an individual domain is inactivated, and the change in binding affinity after alterations to the chromatin landscape. By sequentially re-suspending bulk chromatin in increasing amounts of salt, we are able to profile the elution of a particular protein from chromatin. Using these profiles, we are able to determine how alterations in a chromatin-modifying complex or alterations to the chromatin environment affect binding interactions. Coupling SSE with other in vitro and in vivo assays, we can determine the roles of individual domains and proteins on the functionality of a complex in a variety of chromatin environments.

Sequential salt extraction of chromatin bound proteins is a useful tool for determining the binding properties of large protein complexes. This method can be employed to evaluate the role of individual subunits or domains in the overall affinity of a protein complex to bulk chromatin.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Ricerca

Genetica

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Biochimica

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

Ricerca sul cancro

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in response to environmental stimuli. These changes are essential for genomic integrity, epigenetic regulation, and DNA metabolic reactions such as replication, transcription, and repair. Chromatin assembly is crucial for chromatin dynamics and is catalyzed by histone chaperones. Despite extensive studies, the mechanisms by which histone chaperones enable chromatin assembly remains elusive. Moreover, the global features of nucleosomes organized by histone chaperones are poorly understood. To address these problems, this work describes a unique single-molecule imaging technique named DNA curtain, which facilitates the investigation of the molecular details of nucleosome assembly by histone chaperones. DNA curtain is a hybrid technique that combines lipid fluidity, microfluidics, and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) to provide a universal platform for real-time imaging of diverse protein-DNA interactions.Using DNA curtain, the histone chaperone function of Abo1, the Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, is investigated, and the molecular mechanism underlying histone assembly of Abo1 is revealed. DNA curtain provides a unique approach for studying chromatin dynamics.

DNA curtain, a high-throughput single-molecule imaging technique, provides a platform for real-time visualization of diverse protein-DNA interactions. The present protocol utilizes the DNA curtain technique to investigate the biological role and molecular mechanism of Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase.

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologia

Sviluppo di un test click-based per lo screening dell'attività dell'enzima HAT1

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Autore in primo piano: Sviluppo del test dell'acetil-clic per lo screening degli inibitori di HAT1

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Spettroscopia CD per studiare le interazioni DNA-proteina

In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning

Decifrare il meccanismo molecolare dell'assemblaggio degli istoni mediante la tecnica della tenda del DNA

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell'espressione genica attivata nelle cellule umane

Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1