Name: folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami
Uploaded: 2015-12-03T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
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Gli autori desiderano ringraziare S. Douglas per le discussioni di grande valore e consigli, e tutti i membri del laboratorio Bachelet per utili discussioni e lavoro. Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti della Facoltà di Scienze della Vita e Istituto di Nanotecnologie e Materiali Avanzati alla Bar-Ilan University.

1. Preparazione di Staples Pool Miscela <ol><li> Ordinare liofilizzato DNA graffette nanorobot su piastre da 96 pozzetti come elencato nella tabella 1 (vedi Materiali) e normalizzare a 10 nmol. Per una descrizione dettagliata della progettazione e architettura del nanorobot DNA vedere Ben-Ishay et al. 14 e Douglas et al. 15). </li><li> Ricostituire ogni fiocco bene con DNasi / ultrapuro RNasi-free a una concentrazione di 100 micron. Per punti normalizzati a 10 nmol, ricostituire con 100 ml di acqua ultrapura. </li><li> Pool insieme 20 ml di ogni fiocco usando una pipetta multicanale e di una sterile, 55 ml di soluzione di bacino. Nota: Poiché la forma nanorobot è composto di 254 filamenti fiocco (compresi core, Bordi, maniglie e sequenze Guide, Tabella 1), la concentrazione di ciascuno dei punti in piscina Staples è 394 nm. Rimozione di graffette da piscina fiocco, o l&#39;aggiunta di un po &#39;diverso a volUmes, può ridurre notevolmente la resa, o comunque provocare aggregati spiegate. </li></ol> 2. Preparazione di Fabrication Reaction Miscela <ol><li> Per una miscela di reazione standard di utilizzare 40 ml di M13mp18 virale genoma circolare singolo filamento di DNA, corrispondenti a 4 pmol di ponteggio DNA (100 nM soluzione madre, vedi Materiali). Concentrazione finale del ponteggio nella miscela fabbricazione è di 20 nm, volume finale di 200 ml. <ol><li> Regolare la quantità di DNA patibolo in base alle esigenze specifiche; tuttavia, mantenere la concentrazione finale di scaffold DNA nella miscela di reazione ad una costante di 20 nM. </li></ol></li><li> Aggiungere punti per raggiungere un ponteggio di graffette rapporto di 1 a 10, rispettivamente. Per una concentrazione di 20 nM impalcatura di DNA, ciascuna delle concentrazione finale dei 254 punti &quot;è di 200 nm. Per un volume di reazione finale microlitri 200 aggiungere 102 ml di miscela Staples piscina (punto 1.2). <ol><li> Aggiungi specifiche sequenze di cancelli separatamente the miscela di reazione pieghevole in questo momento. Questi oligo sono ordinati separatamente e richiedono purificazione HPLC. Assicurarsi che oligo gate sono presenti in 1:10 scaffold Gate rapporto sequenza, cioè 200 nM di ciascun oligo di 20 nM concentrazione ponteggio. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 0,4 ml per ciascuna delle quattro oligo Gate a una concentrazione di 100 mM magazzino. </li></ol></li><li> Aggiungere 10x TAE magazzino tampone per raggiungere una concentrazione finale di 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). Per un volume di reazione pieghevole 200 ml, aggiungere 20 ml di 10x TAE. </li><li> Aggiungere 1 M MgCl 2 ad una concentrazione finale di 10 mM. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 2 ml di 1 M MgCl 2. </li><li> Aggiungere 36 ml di DNasi / RNasi acqua ultrapura gratuito per un raggiungere un volume finale di 200 ml. </li><li> Campioni Vortex e un&#39;aliquota di 100 microlitri in fiale per PCR. Nota: consultare le specifiche termociclatore per quanto riguarda i volumi massimi di reazione da utilizzare.Riducendo il volume di rispettare tali limiti non ridurrà le rese ottenute. Volumi di reazione al di sopra del massimo specificato metterà in pericolo le rese. </li></ol> 3. temperatura di ricottura Rampa di Fabrication Reazione <ol><li> Programma termociclatore come segue: <ol><li> Rampa 85 ° C a 60 ° C ad una velocità di 5 min / ° C. </li><li> Rampa 60 ° C a 4 ° C ad una velocità di 75 min / ° C. </li><li> Mantenere a 4 ° C indefinitamente. </li></ol></li><li> Dopo la fabbricazione è finita conservare i campioni a -20 ° C. </li></ol> 4. Rimozione di Staples in eccesso <ol><li> Aggiungere 100 pl di miscela di reazione di piegatura ad un filtro centrifugo 0,5 ml con MWCO di 100 kDa. Salvare un campione di 10 ml di nanorobot pre-purificazione per un&#39;analisi successiva. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 9.600 x g. </li><li> Aggiungere 400 ml di tampone pieghevole (1x TAE, 10 mM MgCl 2). </li><li> Ripetere i punti 4.2 e 4.3 per altre due volte. </li><li>Centrifugare per 5 min a 9.600 x g. </li><li> Recupero il concentrato posizionando il filtro capovolto in una provetta pulita e centrifugare per 1 min a 9.600 x g. Volumi finali possono variare a seconda del volume iniziale della miscela di reazione fabbricazione che è stato messo nel filtro. Tipicamente si ottiene un volume finale 25-60 microlitri di campione nanorobot concentrato. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA nei campioni tramite spettrofotometro a 260 nm. Utilizzare peso molecolare di 5,3 mg / pmol quando calcolare le concentrazioni molari dei campioni nanorobot. Nota: Il coefficiente di estinzione molare per dsDNA, 50 ug / OD 260, è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. 48 mcg / OD 260 tiene conto della timina poli ssDNA estende ai bordi graffette. </li></ol> 5. Gel di Agarosio Analisi di Folded Nanorobots <ol><li> Preparazione di 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% gel di agarosio integrato con 10 mM MgCl 2 </sub&gt; (adattato da Ernesto Castro et al. 21): <ol><li> Preparare tampone TBE 0.5x diluendo 6,25 ml di 10x TBE buffer in magazzino 118.75 ml di DDH 2 O. </li><li> Sciogliere 2.5 g di agarosio in 125 ml di tampone TBE 0.5x. </li><li> Far bollire in forno a microonde fino agarosio è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di 1 M MgCl 2 alla concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Aggiungere 7 ml di 10 mg / ml di bromuro di etidio. </li><li> Attendere che la soluzione per un po &#39;freddo e riempire il vassoio gel prima si solidifica gel agarosio. Installa subito pettine desiderato. </li><li> Preparare 1 L 0,5x TBE tampone di corsa con l&#39;aggiunta di 50 ml di 10x TBE scorta regolatrice e 10 ml di 1 M MgCl 2-940 ml di DDH 2 O. </li><li> Una volta gel è add solido tampone di corsa al dispositivo elettroforesi e mettere dispositivo in un bagno di ghiaccio. </li></ol></li><li> Carico 1 mg DNA totale del nanorobot pre-purificazione (punto 3.2), e la purificazione posta (punto 4.7), a fianco di un ponteggioCampione di DNA e un marcatore DNA 1 kb, sul gel. Un esempio è riportato nella figura 2. Volumi di campioni effettivi dipendono dalle concentrazioni ottenute dopo purificazione. Ogni campione è caricato con tampone di caricamento in un rapporto 1: volume 6 finale. </li><li> Impostare fonte di alimentazione a 80 V e correre il gel per 3 ore. Eseguire il gel in un bagno riempito con acqua e ghiaccio. Nanorobot spiegheranno e appaiono come una macchia se il gel si riscalda durante l&#39;elettroforesi. Durante l&#39;elettroforesi aggiungere ghiaccio supplementare per mantenere dispositivo da riscaldamento. </li><li> Vista gel su un tavolo UV (Figura 2). </li></ol> 6. Macchia negativo di nanorobot con uranile-formiato <ol><li> Preparazione di soluzione uranile-formiato 2% (adattato da Castro et al. 23): <ol><li> Pesare 100 mg di polvere di uranile-formiato in un tubo da 15 ml. </li><li> Bollire DNase / RNase acqua ultrapura gratuito per 3 min per de-ossigenato. </li><li> Aggiungere 5 ml di acqua calda deossigenata (~ 60 ° C)nel tubo 15 ml contenente la polvere uranile-formiato (dal passo precedente). Chiudere bene il coperchio, avvolgere in un foglio di alluminio e vortex rigorosamente per 10 min (tubo a fissare un vortice). Soluzione deve apparire torbido con un colore giallo. </li><li> Filtro soluzione attraverso un 0,2 micron siringa fi ltro. Soluzione dovrebbe diventare trasparente. </li><li> Aliquota 200 ml di soluzione in microprovette. </li><li> Centrifugare alla massima velocità per 5 minuti in una centrifuga da tavolo per campioni piscina sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Caricamento di campione alla rete e colorazione negativa: <ol><li> Sbrinare un&#39;aliquota di 200 ml di soluzione di uranile-formiato 2% (preparato nella sezione 6.1). Aggiungere 10 ml di soluzione 0,5 M di NaOH e vortex rigorosamente per 3 min. Centrifugare a massima velocità per 5 minuti con una centrifuga da tavolo. </li><li> Nel frattempo, griglia glow-scarico con aria ambiente a 0,2 mbar e 25 mA per 30 sec. </li><li> Aggiungere 15 ml di 2 nm campione nanorobot dopo la purificazione (sectisu 4.7) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza) e lasciate assorbire per 1 min. Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza). </li><li> Utilizzare rapidamente carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Ripetere i punti 6.2.4 e 6.2.5. </li><li> Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza). Lasciate soluzione colorante assorbe per 30 sec. </li><li> Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia. </li><li> Lasciate che la griglia di asciugare completamente per almeno 30 minuti, a faccia in su una carta da filtro, prima di iniettare nel TEM. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo descritto la fabbricazione, la purificazione, e visualizzazione del nanorobot DNA. Dopo la fabbricazione del telaio esagonale del dispositivo, la funzione del nanorobot è programmato con la semplice introduzione di carico specifico e fili di rilevamento al robot che facilmente trovare la posizione designata causa idrogeno-bonding complementarità con siti di aggancio disponibile singolo filamento 14 , 15,22. Il protocollo di fabbricazione descritto utilizza una rampa di r...

Gli usi per gli acidi nucleici nanotecnologie sono sbalorditivi. La trattabilità della base Watson-Crick accoppiamento nonché la facilità e relativo basso costo della sintesi su larga scala di oligo misura 2 ha generato un&#39;esplosione di applicazioni 3 e ricerca nel campo delle nanotecnologie DNA. Nanotecnologie DNA strutturale, basato sul immobile 4,5 giunzione Seeman come un elemento fondamentale fa uso di DNA come unità elementare auto-assemblaggio per la costruzione di forme arbitrarie 6-8. Il recente sviluppo del DNA ponteggi origami 9 tecnica permette per la costruzione di complessi 2D / 3D nano-architetture 10-12 con precisione sub-nanometrica ed è un percorso efficace per la costruzione di nuovi oggetti funzionali con l&#39;aumentare della complessità e la diversità sorprendente. Il processo di costruzione si basa su un DNA a singolo filamento lungo scaffold, di solito derivato da un genom viralee che può essere piegato attraverso l&#39;ibridazione di centinaia di singoli brevi oligo filamento di DNA definito graffette. La risoluzione strutturale elevato ottenuto con questa tecnica è la diretta conseguenza delle dimensioni naturali del DNA a doppia elica, mentre la riproducibilità della fabbricazione è il risultato della modulazione dei brevi sequenze singolo filamento fiocco per facilitare la massima complementarità idrogeno-bonding realizzabile. Con l&#39;uso di una temperatura di ricottura lenta rampa la creazione più bassa energia, termodinamicamente nanostruttura preferito è raggiunto in alte rese e fedeltà. La semplice applicazione di regole di progettazione di giunzione in un codice di calcolo ha permesso lo sviluppo di strumenti CAD, come caDNAno 13, che semplifica molto il compito di progettare grandi strutture complesse che contengono centinaia di incroci collegati. Precedentemente abbiamo descritto la progettazione di un nanorobot DNA con l&#39;ausilio dello strumento 14,15 caDNAno. Qui ci raffiguriamo la fabbricazione evisualizzazione, tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM), del nanorobot, una cavità nanodevice esagonale 3D, con dimensioni di 35 x 35 x 50 nm 3, destinato a subire un cambiamento conformazionale in risposta a determinati stimoli predeterminati e presenti carico specifico, tale come proteine ​​o oligonucleotidi di acidi nucleici, sequestrati all&#39;interno. Mentre 12 stazioni di carico sono disponibili all&#39;interno del telaio cavità, il numero effettivo di carico legato differisce a carico di formato. Molecole cargo vanno da piccole molecole di DNA di enzimi, anticorpi e 5-10 nanoparticelle d&#39;oro nm. Cargocan essere sia uniforme o eterogenea, tale che ogni nanorobot contiene una miscela di diverse molecole. Rilevamento avviene tramite due porte a doppia elica disegno di bloccaggio per rilevare proteine, acidi nucleici o altre sostanze chimiche, basato sia su aptasensor 16,17 o filamento di DNA spostamento 18 tecnologie. I recenti sviluppi in aptamer protocolli di selezione 19-21 consentono la progettazione di nanorobot risponderead una gamma sempre crescente di molecole e tipi di cellule. Lavoro precedenza ha mostrato un nanorobot trasportano un anticorpo specifico, che in seguito al legame al suo antigene può trasmettere sia un inibitore o un segnale prolifica all&#39;interno di specifici tipi cellulari in una popolazione cellulare mista 15. Una caratteristica interessante di questi nanodispositivi è la loro capacità di svolgere compiti ancora più complessi e controllo logico con l&#39;introduzione di diversi sottotipi nanorobot in una singola popolazione. Recentemente abbiamo dimostrato specifici sottotipi di nanorobot che effettuano sia come regolatori positivi o negativi, che controlla una popolazione effettori contenente un carico molecola attiva 22. Il protocollo presentato qui descritta la realizzazione, la purificazione e l&#39;imaging di un nanorobot gated con sequenze sensori aptameri che si legano selettivamente al PDGF per facilitare l&#39;apertura del nanorobot 15,22. Il processo di fabbricazione descritto è simile al nprocesso di fabbricazione anorobot inizialmente descritto da Douglas et al. 15 con modifiche volte a ridurre la durata complessiva dei processi, aumentando i tassi di rendimento e purificazione.

<table><tbody><tr><td>DNase/RNase free distilled water</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA scaffold</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide 10&amp;nbsp;mg/ml solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA marker</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>uranyl formate</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>carbon-coated TEM grids&amp;nbsp;</td><td>Science services</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler c1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge K100X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV table Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>Tecnai</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

Il nanorobot DNA è un dispositivo nanometrico cava esagonale, progettato per aprire in risposta a stimoli specifici e presentare merci sequestrate all&#39;interno. Entrambi gli stimoli e le merci possono essere personalizzati in base alle esigenze specifiche. Qui si descrive il protocollo di fabbricazione nanorobot DNA, con l&#39;uso della tecnica origami di DNA. Il procedimento inizia miscelando brevi graffette DNA filamenti singoli, in una miscela di magazzino che viene poi inserito in un lungo, circolare, scaffold DNA a singolo filamento in presenza di un buffer di piegatura. Un cycler termico standard viene programmato per ridurre gradualmente la temperatura di reazione di miscelazione per facilitare la ricottura graffette da ponteggio, che è la forza guida dietro la piegatura della nanorobot. Una volta che la reazione di piegatura 60 hr è completa, graffette eccesso vengono eliminati utilizzando un filtro centrifugo, seguita da visualizzazione tramite elettroforesi in gel di agarosio-(AGE). Infine, successo fabbricazione del nanorobot viene verificata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM),con l&#39;uso di uranile-formiato come colorazione negativa.

Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Tutte le corsie contengono 1 mg di DNA totale, misurata mediante spettrofotometro (OD 260). Rispetto al ponteggio circolare DNA a singolo filamento (corsia 2), nanorobots sono ostacolati nel gel causa del loro peso molecolare più elevato, il risultato di graffette ibridazione al DNA ponteggio (Lane 3. Red freccia). La banda basso peso molecolare a Lane 3 rappresenta graffette in eccesso che non si legano al DNA patibol...

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Piegatura e caratterizzazione di un robot bioresponsivo da DNA Origami | Chimica | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.5K Views.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

Origami Ispirato auto-assemblaggio di particelle Fantasia e riconfigurabile

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Ricerca

Chimica

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Progettazione di un robot bio-sensibile da DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Bioingegneria

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Biochimica

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

Assemblaggio di nanorod oro in Metamolecules plasmoniche chirale utilizzando modelli di Origami del DNA

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

Il nanopatterndifid antistrato DNA Mediato delle strutture inorganiche per applicazioni di rilevamento

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...