Name: generation of recombinant influenza virus from plasmid dna
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
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Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti nel Adolfo García-Sastre e Peter Palese laboratori per lo sviluppo di tecniche di reverse influenza genetica e plasmidi. La ricerca in laboratori di AG-S è parzialmente finanziato dalla CRIP, un NIAID-finanziato Centro di Eccellenza per la Ricerca e la sorveglianza dell&#39;influenza (HHSN266200700010C) e da sovvenzioni NIAD R01AI046954, U01AI070469 e P01AI058113. La ricerca in laboratorio LM-S è parzialmente finanziato dal NIAID concedere RO1AI077719.

1. Virus influenzale trasfezione di soccorso Influenza A virus appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae negativo-stranded RNA virus avvolto. Il genoma del virus influenzale A si compone di otto geni diversi RNA di polarità negativa che codificano, almeno, 11 proteine ​​virali (Figura 1) 4. Ci concentreremo, in questa relazione, il salvataggio di uno dei ceppo di laboratorio più comuni, l&#39;influenza A/PR/8/34, 5 usando plasmidi ambisense (PDZ) contenente l&#39;influenza 8 A/PR/8/34 segmenti virali ( Figura 2). Per il salvataggio dei virus influenzali ricombinante da DNA plasmidico, si consiglia 3 trasfezioni indipendenti per ogni virus ricombinante. Se più di un salvataggio virus ricombinante è tentato, scala le seguenti operazioni accordantly al numero di virus di essere salvati. La transfezione seguente e protocollo infezione è stabilita per 6-ben-piastre. Una rappresentazione schematica del protocollo è illustrato in Figura 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) miscela: Preparare 250 microlitri di media OptiMEM e 6-8 ml di LPF2000 per trasfezione. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente (RT). Nel frattempo, preparare la miscela plasmide trasfezione. </li><li> Miscela di trasfezione plasmide: Preparare il cocktail di plasmide transfezione in 50 ml di mezzi OptiMEM. Usiamo solitamente 1 mg di ogni influenza del DNA plasmidico al salvataggio. Aggiungere 1 ml di i plasmidi PDZ (a 1 mg / mL) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, e NS in una provetta contenente 50 ml di mezzi OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA miscela plasmide: Aggiungere 250 microlitri dal passo 1,1 nella miscela di trasfezione di DNA influenza plasmide (punto 1.2). Incubare la miscela per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare sospensioni di cellule 293T e MDCK per la trasfezione. </li><li> Preparazione di 293T/MDCK co-coltura: Prima di iniziare, portare l&#39;1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media e EDTA-tripsina miscela a 37 ° C. La densità delle cellule dovrebbe essere di 80-90% di confluenza del giorno di trasfezione. Di solito, una confluenti piatto 100 mm di 293T e un piatto confluenti 100 mm di cellule MDCK può essere utilizzato per 10-12 salvataggi. Abbiamo intenzione di utilizzare 250 microlitri di cellule per pozzetto. Entrambe le linee cellulari saranno risospese in un totale di 3 ml di DMEM 10% FBS 1% PS. <ul><li> Con attenzione risospendere ogni linea cellulare in 10 ml di DMEM 10% FBS 1% PS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Avrete un tubo per le cellule 293T e un tubo per le cellule MDCK. </li><li> Risospendere le cellule 293T in 3 ml di DMEM 10% FBS 1% PS e quando risospeso, fornire i 3 ml per le cellule MDCK per sospendere di nuovo le cellule. Questo vi darà la miscela di cellule 293T e MDCK da utilizzare per il vostro co-coltura. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di cellule 293T/MDCK per pozzetto (10-12 a 6 e pozzi). </li></ul></li><li> Dopo l&#39;incubazione 20-30 minuti RT (passo 1.3), aggiungere 1 ml di DMEM 10% FBS 1% PS al OptiMEM-LPF2000-influenzali miscela DNA plasmidico. </li><li> Aggiungere il 1,3 ml (passo 1,5) nei pozzetti con il 250 microlitri di cellule 293T/MDCK (passo 1,4). </li><li> Agitare delicatamente il 6-ben piatto e lasciare che la trasfezione incubare overnight (ON) in incubatrice a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Il giorno dopo, a circa 16-24 ore dopo la trasfezione, cambiare il supporto di trasfezione e incubare le cellule transfettate in BA DMEM 0,3% 1% PS contenente 1 mg / ml di TPCK-tripsina per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore di cambiare i media, trasferire il surnatante dalle cellule transfettate in una provetta. </li><li> Centrifugare il surnatante coltura di tessuti in una microcentrifuga per 1-2 minuti, 13.000 giri al minuto. </li><li> Infettare nuove cellule MDCK in 6 pozzetti (placcato il giorno prima) o 10 giorni di età uova embrionate di pollo con 200 ml di surnatanti centrifugati coltura dei tessuti dal punto 1.10. Incubare le cellule e / o uova a 37 ° C per 2-3 giorni. <ol><li> L&#39;infezione di uova embrionate di 10 giorni di età pollo: Tutte le procedure per infettare le uova embrionate di pollo vengono eseguite in condizioni sterili. <ol><li> Candela di 10 giorni di età le uova con un light-box speratura per vedere l&#39;interfaccia tra il sacco d&#39;aria e la cavità allantoidea. Fare un segno di matita sul bordo interfaccia. </li><li> Con un ago da siringa da 5 ml di fare un buco nel guscio d&#39;uovo. </li><li> Con una siringa da 1 ml, infettare ogni uovo con 200 ml di sovranatanti del tessuto dal punto 1.10. </li><li> Coprire il buco nel guscio d&#39;uovo con la cera fusa usando un tampone di cotone. </li><li> Incubare le uova infette al 37οC per 2-3 giorni. </li></ol></li><li> L&#39;infezione di nuove cellule MDCK: Il giorno prima il passaggio della coltura tissutale surnatante dal 293T/MDCK co-culture, prepare ben 6 piatti piatto con le cellule MDCK raggiungere 80-90% confluenza giorno successivo. Di solito, un tessuto confluenti 100 mm Piastra cultura può essere suddivisa in 6-8 pozzi. Lavare le cellule due volte con PBS 1X, trypsinize e preparare il 6-pozzetti. Agitare delicatamente a mano i piatti in modo da avere una distribuzione uniforme delle celle. Coltivare le cellule, ON, nel 37 ° C incubatore, 5% di CO 2. Prima dell&#39;infezione, controllare le cellule al microscopio per confermare un monostrato, quindi, procedere con l&#39;infezione: <ul><li> Lavare le cellule due volte, con 1 ml di PBS 1X. </li><li> Infettare con il 200 microlitri di surnatanti centrifugati coltura dei tessuti per 1 ora a temperatura ambiente. Non lasciare le pile a secco. Rock the 6-ben-piastra ogni 10 minuti. </li><li> Dopo 1 ora di assorbimento virale, rimuovere il supporto infezione dalle cellule MDCK e aggiungere 2 ml di DMEM BA 0,3% 1% PS contenente 1 mg / ml di TPCK-tripsina. </li><li> A 48-72 ore dopo il passaggio, a seconda dell&#39;efficacia trasfezione e la carica virale, un effetto citopatico (CPE) saranno osservati nelle cellule infette MDCK. CPE suggerisce un salvataggio di successo. Tuttavia, un test HA (sezione 2) devono ancora essere eseguiti per confermare la presenza del virus in sovranatanti tessuto. </li></ul></li></ol></li><li> Fluido raccolta allantoideo da uova embrionate di pollo infetto: Tutte le procedure per raccogliere il liquido allantoico da uova infette vengono eseguite in condizioni sterili. Circa il 8-12 ml di liquido allantoico può essere raccolto da ogni 10 giorni di età con infezione da uovo. Prima della raccolta del liquido allantoico, incubare le uova di gallina per 2 ore (o ON) a 4 ° C per uccidere l&#39;embrione di pollo e coagulare il sangue. <ul><li> Lavare i gusci d&#39;uovo con il 70% di etanolo per stabilire condizioni di sterilità. </li><li> Aprire l&#39;uovo, con attenzione, oltre la cavità d&#39;aria toccando con un cucchiaio. Togliere il guscio d&#39;uovo rotto con l&#39;aiuto di pinze. </li><li> Con un ago 1 ml, togliere la membrana allantoide senza rompere il tuorlo dell&#39;uovo. </li><li> Stabilizzare l&#39;embrione di pollo con una spatola come si guida a 10 ml, pipetta nel liquido allantoico. Raccogliere il maggior liquido allantoico possibile in una provetta da centrifuga da 15 ml sul ghiaccio in un secchio di ghiaccio, senza rompere o raccogliere qualsiasi tuorlo dell&#39;uovo. Utilizzare una provetta da centrifuga da 15 ml per ogni uovo. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 4 ° C e trasferire il liquido allantoico (senza prendere in pellet globuli rossi) ad un nuovo 15 ml provette centrifuga. </li><li> Conservare le provette contenenti il ​​liquido centrifugato allantoideo a 4 ° C fino a quando non vengono controllati per la presenza del virus in salvo con un saggio di emoagglutinazione (HA). </li></ul></li></ol> 2. HA test per confermare il salvataggio dei virus influenzali ricombinanti Saggio emoagglutinazione (HA) viene normalmente utilizzato per rilevare la presenza del virus in salvo a surnatanti MDCK colture di tessuti e / o il liquido allantoico di uova raccolte. In alternativa, test di immunofluorescenza (IFA) può essere anche eseguita. Una volta che un test individua la presenza del virus in salvo, il virus dovrebbe essere purificata placca e la composizione genetica del virus sarà confermata mediante RT-PCR e sequenziamento. La presenza del virus nei surnatanti MDCK coltura di tessuti e / o nel liquido allantoico da uova infette può essere determinata macroscopicamente con HA di pollo (o altra fonte) globuli rossi (RBC). La presenza del virus induce emoagglutinazione di RBC, mentre l&#39;assenza di virus permette la formazione di una pallina rossa sul fondo del pozzo (Figura 4). Nel caso del virus influenzale, si ritiene che circa il 10 3 -10 4 unità placca formando (PFU) sono tenuti a dare un segnale positivo nel test HA, quindi, un IFA può essere eseguita in parallelo con il test per confermare HA un risultato vero negativo. IFA con primarie anticorpi anti-influenzale è più sensibile il test HA perché meno di 103-104 virus può essere rilevato con questa tecnica. E &#39;possibile che surnatanti o fluidi allantoide che sono HA-negativi sono positivi da IFA. In questo caso, il virus dovrebbe essere amplificato da passaging, ancora una volta, in cellule MDCK o nelle uova. Liquido allantoico e / o surnatanti di coltura dal secondo passaggio dovrebbe essere chiaramente positivo nel saggio HA. Saggi di HA sono svolte in V-parte inferiore piastre a 96 pozzetti. Negativo (per esempio, PBS 1X) e positivo (surnatanti colture di tessuti e / o liquido allantoico da una infezione da virus influenzale), campioni di controllo devono essere sempre inclusi in qualsiasi test HA per convalidarlo. <ul><li> Dispensare 50 ml di PBS 1X in ciascun pozzetto della V-parte inferiore a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 50 ml diil MDCK surnatanti coltura di tessuti e / o liquido allantoico dalle uova infette al pozzo prima e, fanno diluizioni seriali di 2 volte per i pozzi di seguito. Scartare la extra di 50 microlitri dal pozzo scorso. </li><li> Aggiungere 50 ml di 0,5% -1,0% globuli rossi di pollo (preparato in PBS 1X) in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare il V-basso 96-pozzetti per 30-45 minuti (fino a un punto rosso è visibile nella parte inferiore di un campione di controllo negativo PBS) su ghiaccio. Leggere e interpretare i risultati come indicato in Figura 4. </li></ul> 3. Passaggio di surnatanti coltura dei tessuti Un risultato negativo nel test HA può essere il risultato di bassa efficienza di trasfezione con bassi livelli di virus presente di essere in sovranatanti il ​​tessuto e / o liquido allantoico. Passaggio di questi campioni in MDCK uova fresche e / o embrionate permetterà l&#39;amplificazione del virus (come indicato nella figura 3) Le infezioni sono eseguiti come precedentemente descritto nel paragrafo 1.11.2. 4. Rappresentante Risultati Successo di soccorso virus influenzale sarà confermata dalla presenza di un test positivo HA (Figura 4). Inoltre, l&#39;esistenza di CPE nelle cellule infette con sovranatanti il ​​tessuto o con il liquido allantoico da uova proporrà un salvataggio positivo virale. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Struttura virus dell&#39;influenza: Il virus dell&#39;influenza è circondato da un doppio strato lipidico contenente i due glicoproteine ​​virali (HA, NA) e, inoltre, la proteina del canale ionico, M2. HA è la proteina virale attaccamento, responsabile per il legame di acido sialico contenenti recettori. NA è responsabile del rilascio dei virus da cellule ospiti. Sotto il doppio strato lipidico, è uno strato proteico costituito da proteine ​​della matrice interna busta superficie 1, M1, che svolge un ruolo nel virione assemblaggio e in erba e la proteina nucleare esportatore (NEP), richiesti per l&#39;esportazione nucleare di ribonucleocapsids virale. Il nucleo del virus è costituito da un complesso ribonucleoproteina (RNP), composta da 8 geni negativi a singolo filamento di RNA virale encapsidated dal nucleoproteina virale, NP. Associata con il complesso RNP sono i virale RNA-dipendente di RNA polimerasi subunità PA, PB1, e PB2. Le proteine ​​non strutturali NS1 e PB1-F2, codificate dai segmenti di RNA NS e PB1, rispettivamente, non fanno parte della struttura del virione. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Influenza plasmidi salvataggio virus: Gli otto geni del virus influenzale clonato nel PDZ ambisense plasmide sono indicati. plasmide PDZ 6, derivato dalla espressione della proteina plasmide pCAGGs 7, è un vettore bidirezionale plasmide con un umano RNA polimerasi I promoter del mouse e una sequenza di terminazione che codifica l&#39;RNA genomico senso negativo, con orientamento opposto al polimerasi mi unisco, una polimerasi II cassetta di trascrizione (pollo β-actina promotore e polyA) codifica le proteine ​​virali da lo stesso gene virale. cDNA da ogni segmento virali sono generati mediante RT-PCR con primer avanti e indietro che contiene il sito di restrizione Sapi endonucleasi e le regioni non codificanti di ogni segmento (scatole nere, alla fine dei geni virali). Il prodotto PCR è clonato nel PDZ digerito con Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Otto plasmide basato salvataggio del sistema influenza: PDZ plasmidi contenenti i geni 8 influenza virale sono co-trasfettate, in sospensione, in-293T MDCK cellule co-culture (giorno 1). Ventiquattro ore dopo la trasfezione, i media senza FBS ma contenente TPCK / tripsina viene sostituito (giorno 2). Quarantotto ore dopo la sostituzione del supporto, supernatante di coltura di tessuto viene raccolta e utilizzata per infettare MDCK o 10 giorni di età uova embrionate di pollo (giorno 4). 48-72 ore post-amplificazione, sovranatante di coltura tissutale da MDCK cellule infette o liquido allantoico da uova vengono raccolti e analizzati per la presenza del virus da HA (giorno 6). Se nessun virus è rilevato, il sovranatante stesso e / o liquidi allantoideo può essere ri-diversi passaggi in fresco le cellule MDCK e / o uova embrionate. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Emoagglutinina saggio (HA): emoagglutinazione di RBC da particella del virus è visibile macroscopicamente ed è la base per rilevare particelle virali nei supernatanti colture di tessuti e / o fluidi allantoideo. Anche se il test HA non discrimina tra particelle virali infettive e che sono particelle che sono degradati e non più in grado di infettare le cellule, il saggio è un buon indicatore della presenza del virus nei campioni. A) L&#39;assenza (in alto) di presenza (in basso) del virus nei campioni biologici è determinato dalla presenza di RBC sul fondo del piatto o la loro assenza, respectively. B) Un risultato rappresentante di un test HA senza livelli rilevabili di virus (in alto) o presenza (in basso) del virus è mostrato.

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Mount Sinai School of Medicine ha i diritti di proprietà intellettuale nel campo dei virus influenzali ricombinanti, e AG-S è un inventore di questa proprietà intellettuale.

Salvataggio dei virus influenzali ricombinante da DNA plasmidico è un processo semplice e lineare una volta che il protocollo è eseguita di routine in laboratorio, ma in principio, più cose possono andare storte. E &#39;indispensabile avere una buona preparazione plasmide per generare il virus. La corretta manutenzione delle linee cellulari (293T e MDCK) è fondamentale per un salvataggio di successo virale. Tradizionalmente, un tag genetico viene inserito in una influenza gene codifica plasmide, da mutagenesi silenzio. Introduzione di questa mutazione silente (s) e la creazione, per esempio, una restrizione sito romanzo enzima viene utilizzato per distinguere tra le wild-type e virus influenzale ricombinante dalla digestione enzimatica. Pertanto, dopo l&#39;amplificazione della placca virus ricombinante purificata, RT-PCR e sequenziamento approcci dovrebbero essere effettuati per verificare la natura del virus in salvo. Lo sviluppo di queste tecniche di genetica inversa e salvataggio di successo dei virus influenzali ricombinanti da plasmidi vi permetterà di rispondere a domande specifiche sulla biologia del virus.

Linee cellulari 293T (numero di catalogo CRL-11268) e MDCK (numero di catalogo CCL-34) linee di cellule sono mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Le cellule vengono modulo disponibile l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 Università Boulevard, Manassas, in Virginia. 20110-2209 USA). Uova embrionate di pollo Embrionate di 10 giorni di età uova di pollo può essere ottenuto da Charles River Laboratories, organismi patogeni specifici di alimentazione aviaria Fee (SPAFAS) aviaria Prodotti e Servizi. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Le uova vengono incubate a 37 ° C precedente e dopo l&#39;infezione virale. Prima e dopo l&#39;infezione virale, le uova sono candled a determinare la vitalità degli embrioni. E &#39;molto importante per cercare le uova morti prima e dopo l&#39;infezione virale. Prima dell&#39;infezione un uovo morto può essere facilmente individuato per l&#39;assenza di vasi sanguigni così come l&#39;assenza di mobilità dell&#39;embrione. Quando esaminate, embrioni vivi movimento. Dopo l&#39;infezione virale un uovo morto (probabilmente correlati all&#39;infezione da virus influenzale) sarà facilmente individuato dalla comparsa cattiva dell&#39;uovo come si vede dal volume più piccolo e sanguinario di liquido allantoico. Infetti-uova vengono scartati in due sacchetti autoclavabili e sterilizzati in autoclave seguendo le procedure standard. Pollo globuli rossi (RBC) Pollo RBC possono essere acquistati presso Fattorie Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conservare a 4 ° C. Per i saggi di HA, lavare 5 ml di globuli rossi di pollo con 45 ml di PBS 1X in un tubo da centrifuga da 50 ml. Centrifugare per 5 minuti a 1000 rpm, RT. Scartare con attenzione il sopranatante e utilizzare una diluizione 1:1000 del RBC pellet in PBS 1X (concentrazione finale del 0.5-1.0% RBC). Tessuti e fluidi sovranatanti allantoideo Entrambi, surnatanti colture di tessuti e fluidi allantoideo può essere conservato a 4 ° C per un breve periodo di tempo. Dopo aver confermato di soccorso virus, virus da surnatanti di cellule o liquido allantoico sono conservati a -80 ° C. Plasmidi Tutti i plasmidi sono preparati con le raccomandazioni di un plasmide produttore di kit maxi successivo. Tutti i plasmidi sono aliquota a concentrazioni di 1 mg / ml in DDH 2 O e conservati a -20 ° C. Per la conservazione a breve termine, il plasmide si può mantenere a 4 ° C. La concentrazione del DNA plasmidico purificato è determinata dalla spettrofotometria a 260 nm, con purezza di essere stimato utilizzando il rapporto 260:280 nm. Preparazioni a 1,8-2,0 260:280 rapporti nm sono considerati appropriati per operazioni di ripristino del virus. Inoltre, la concentrazione e la purezza plasmide deve essere confermata con gel cromatografia. Ambisense PDZ plasmidi (6) contenente l&#39;influenza otto A/PR/8/34 geni virali (7) sono illustrati nella Figura 2. Virus Il protocollo descritto per il salvataggio influenza A/PR/8/34 può essere effettuata sotto il livello di biosicurezza (BSL) 2 condizioni. Materiali contaminati, comprese sovranatanti tessuti e uova embrionate, devono essere sterilizzati prima dello smaltimento. Salvataggio del virus dell&#39;influenza altri possono esigere condizioni BSL superiore e, di conseguenza, le condizioni speciali / misure di sicurezza dovranno essere seguite. Terreni di coltura dei tessuti e soluzioni DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml di Dulbecco modificato Eagle medium (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di 100X penicillina / streptomicina (PS). Conservare a 4 ° C. Questo supporto sarà utilizzato per mantenere le cellule 293T e MDCK così come per la transfezione. DMEM BA 0,3% 1% PS: 495,7 ml di DMEM, 4,3 ml di 35% di albumina bovina (BA). Conservare a 4 ° C. Appena prima dell&#39;uso, aggiungere tripsina TPCK trattati per una concentrazione finale di 1 mg / ml. Mezzi di comunicazione infettivi. Fosfato 10X soluzione salina tamponata (PBS): 80 g di NaCl, 2 g di KCl, 11,5 g di Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 2 g di KH 2 PO 4. Aggiungi DDH 2 O fino a 1 litro. Regolare il pH a 7,3. Sterilizzare in autoclave. Conservare a temperatura ambiente. PBS 1X: Diluire 10X PBS 1:10 con DDH 2 O. Sterilizzare in autoclave e conservare a temperatura ambiente.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Gli sforzi da una serie di gruppi di ricerca sono stati influenzali fondamentale per lo sviluppo e il miglioramento della genetica del virus dell&#39;influenza A inversa. Originariamente fondata nel 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; Le tecniche di reverse plasmide basato genetica per creare virus ricombinanti hanno rivoluzionato il campo della ricerca, perché l&#39;influenza specifiche domande hanno avuto risposta da parte geneticamente modificati, infettive, virus influenzali ricombinanti. Tali studi includono la replicazione del virus, la funzione delle proteine ​​virali, il contributo di specifiche mutazioni nelle proteine ​​virali in replicazione virale e / o patogenesi e, anche, vettori virali con virus influenzali ricombinanti che esprimono proteine ​​estranee<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Salvataggio di virus dell&#39;influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell&#39;influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.3K Views.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

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Immunologia e infezioni

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian and avian host species, including humans. With the recent advent of rotavirus reverse genetics systems, it has become possible to use directed mutagenesis to explore rotavirus biology, modify and optimize existing rotavirus vaccines, and develop rotavirus multitarget vaccine vectors. In this report, we describe a simplified reverse genetics system that allows the efficient and reliable recovery of recombinant rotaviruses. The system is based on co-transfection of T7 transcription vectors expressing full-length rotavirus (+)RNAs and a CMV vector encoding an RNA capping enzyme into BHK cells constitutively producing T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotaviruses are amplified by overseeding the transfected BHK-T7 cells with MA104 cells, a monkey kidney cell line that is highly permissive for virus growth. In this report, we also describe an approach for generating recombinant rotaviruses that express a separate fluorescent reporter protein through the introduction of a 2A translational stop-restart element into genome segment 7 (NSP3). This approach avoids deleting or modifying any of the viral open reading frames, thus allowing the production of recombinant rotaviruses that retain fully functional viral proteins while expressing a fluorescent protein.

Generation of recombinant rotaviruses from plasmid DNA provides an essential tool for the study of rotavirus replication and pathogenesis, and the development of rotavirus expression vectors and vaccines. Herein, we describe a simplified reverse genetics approach for generating recombinant rotaviruses, including strains expressing fluorescent reporter proteins.

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

Espressione e purificazione di particelle virus-simili per la vaccinazione

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Biologia

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54041">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors &#8212; encoding different viral structural proteins &#8212; in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

Una tecnica per la generazione di particelle simili al virus dell'influenza attraverso un sistema di mammiferi

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the ...