Visualizzazione della degenerazione dell'articolazione del ginocchio dopo lesione del LCA non invasiva nei ratti

Fonte: Lindsey K. Lepley^1,2, Steven M. Davi¹, Timothy A. Butterfield^3,4 e Sina Shahbazmohamadi⁵,

¹ Dipartimento di Kinesiologia, Università del Connecticut, Storrs, CT; ² Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT; ³ Dipartimento di Scienze della Riabilitazione, Università del Kentucky, Lexington, KY; ⁴ Centro di Biologia Muscolare, Dipartimento di Fisiologia, Università del Kentucky, Lexington, KY; ⁵ Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Connecticut, Storrs, CT

La lesione del legamento crociato anteriore (ACL) al ginocchio aumenta drasticamente il rischio di osteoartrite post-traumatica (PTOA), poiché circa un terzo degli individui dimostrerà PTOA radiografica entro la prima decade dopo la lesione del LCA. Sebbene la ricostruzione del LCA (ACLR) ripristini con successo la stabilità dell'articolazione del ginocchio, l'ACLR e le attuali tecniche di riabilitazione non impediscono l'insorgenza della PTOA. Pertanto, la lesione ACL rappresenta il modello ideale per studiare lo sviluppo della PTOA dopo una lesione traumatica dell'articolazione.

I modelli di ratto sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'insorgenza e l'effetto della lesione del LCA sulla PTOA. Il modello più utilizzato di lesione ACL è la transezione ACL, che è un modello acuto che destabilizza chirurgicamente l'articolazione. Sebbene pratico, questo modello non imita fedelmente le lesioni ACL umane a causa delle procedure di lesione invasive e non fisiologiche che mascherano la risposta biologica nativa alla lesione. Per migliorare la traduzione clinica dei nostri risultati, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo modello non invasivo di danno ACL in cui l'ACL viene rotto attraverso un singolo carico di compressione tibiale. Questa lesione replica da vicino le condizioni di lesione rilevanti per l'uomo ed è altamente riproducibile.

La visualizzazione della degenerazione articolare attraverso la tomografia micro-computerizzata (μCT) fornisce diversi importanti progressi rispetto alle tradizionali tecniche di colorazione OA, tra cui l'imaging 3D rapido, ad alta risoluzione e non distruttivo della degenerazione dell'intera articolazione. L'obiettivo di questa dimostrazione è quello di introdurre lo stato dell'arte della lesione ACL non invasiva in un modello di roditore e utilizzare μCT per quantificare la degenerazione dell'articolazione del ginocchio.

L'ACL è una struttura a banda di tessuto connettivo denso che nasce dallo spazio intercondilare anteriore della tibia e si estende superiormente e lateralmente all'aspetto posteriore del condilo laterale del femore. Strutturalmente, l'ACL funge sia da stabilizzatore passivo del ginocchio, lavorando di concerto con altri legamenti e con la muscolatura della coscia per aiutare a controllare l'articolazione durante il movimento dinamico. L'ACL è il principale freno allo spostamento tibiale anteriore e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della stabilità dell'articolazione del ginocchio. Oltre al supporto strutturale, l'ACL funge anche da percorso per le informazioni neurali tra l'articolazione del ginocchio e il sistema nervoso centrale. Il più grande stress sul LCA si verifica quando il ginocchio è vicino all'estensione, ed è durante questo periodo che l'ACL è a più alto rischio di lesioni.

L'ACL è il legamento del ginocchio più comunemente ferito durante lo sport e le attività legate al lavoro. Le lesioni ACL senza contatto rappresentano quasi il 70% di tutte le lesioni ACL e si verificano quando una persona genera forze e / o momenti sufficienti al ginocchio che portano a un carico eccessivo del LCA. Sebbene il meccanismo del danno ACL senza contatto sia stato studiato utilizzando una varietà di modelli di ricerca (prospettici, retrospettivi, osservazionali, in vivo e in vitro),una determinazione diretta di come si verifica la lesione rimane sfuggente. La ricostruzione del LCA viene spesso eseguita inserendo chirurgicamente una porzione del tendine del ginocchio o del tendine rotuleo degli individui nell'area del LCA. Lo scopo della ricostruzione chirurgica è quello di massimizzare la stabilità del ginocchio e la capacità funzionale che sono state perse in seguito all'infortunio. La ricostruzione chirurgica facilita un ritorno sicuro allo sport e promuove la salute a lungo termine dell'articolazione del ginocchio. Tuttavia, nonostante i migliori sforzi di medici e ricercatori, quasi due terzi dei pazienti con ACL ricostruiti non tornano in attività a 12 mesi dopo la ricostruzione e oltre il 50% delle ginocchia ricostruite con ACL hanno segni radiografici di PTOA 5-14 anni dopo l'infortunio.

I modelli animali forniscono sia un modo pratico che clinicamente rilevante per studiare la storia naturale e la risposta del trattamento alla salute delle articolazioni. È importante sottolineare che il ginocchio di un ratto ha un'anatomia e una funzione simili alle ginocchia negli esseri umani, il che rende il ginocchio del ratto un modello utile per studiare la PTOA dopo la lesione del LCA. Per migliorare la traduzione clinica dei nostri risultati, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo modello non invasivo di danno ACL, in cui l'ACL viene rotto attraverso un singolo carico di compressione tibiale. Questa lesione replica da vicino le condizioni di lesione rilevanti per l'uomo ed è altamente riproducibile.

Il dispositivo di carico è costituito da due piattaforme di carico personalizzate (Figura 1); lo stadio superiore del ginocchio è montato rigidamente su un attuatore lineare (attuatore lineare DC L16-63-12-P, Phidgets, Alberta, CA) che posiziona l'arto posteriore destro in 30°^1-3 di dorsiflessione e 100°¹ di flessione del ginocchio fornendo spazio per la sublussazione anteriore della tibia rispetto al femore; lo stadio inferiore tiene il ginocchio flesso ed è montato direttamente sopra una cella di carico (HDM Inc., PW6D, Southfield, MI). Durante la lesione, i ratti vengono anestetizzati e quindi l'arto posteriore destro viene sottoposto a un singolo carico di compressione tibiale ad una velocità di 8 mm / s.^{1 Lesione} ACL è notata da un rilascio di forza di compressione durante la lesione che viene monitorata tramite un programma personalizzato (LabVIEW, National Instruments, Austin, TX). Dopo l'infortunio, la rottura del LCA è clinicamente confermata dal test di Lachman, in cui il femore viene fissato mentre una forza anteriore viene applicata alla tibia. Un'eccessiva traduzione tibiale anteriore indica un deficit di LCA. L'arto posteriore ferito al LCA può quindi essere esteso e fissato in un dispositivo personalizzato stampato in 3D per visualizzare la degenerazione dell'articolazione del ginocchio. Le immagini vengono acquisite per caratterizzare i cambiamenti nella struttura trabecolare legati allo sviluppo della PTOA. ⁴

Figura 1: Carico compressivo tibiale che causa lesioni ACL isolate non invasive.

Lesione ACL non invasiva

1. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale. È possibile utilizzare una maschera respiratoria, ma non è obbligatoria per questo protocollo.
2. Anestetizzare i ratti utilizzando una camera di induzione con il 5% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno. Mantenere il flusso dell'anestesia utilizzando tramite un cono nasale con 1 - 3% di isoflurano e 500 ml / min di ossigeno. Se l'apparecchio non è impostato su una tavola di backdraft o downdraft, assicurarsi che i gas di scarico siano scavati utilizzando un sistema da tavolo e filtri a carbone.
3. Eseguire un pizzicamento della dita per garantire che sia stata raggiunta un'adeguata profondità di anestetico. Si noti che non è necessario applicare lubrificante per gli occhi il protocollo viene eseguito rapidamente (< 3 min) e vi è un rischio minimo di secchezza corneale.
4. Posizionare l'arto posteriore destro a 30° di dorsiflessione e 100° di flessione del ginocchio fornendo spazio per la sublussazione anteriore della tibia rispetto al femore.
5. Montare rigidamente lo stadio superiore del ginocchio su un attuatore lineare.
6. Posizionare il ginocchio flesso sul palco inferiore, che è montato direttamente sopra una cella di carico.
7. Indurre lesioni ACL utilizzando un singolo carico di compressione tibiale ad una velocità di 8 mm/s.
8. La lesione del LCA è notata da un rilascio di forza di compressione. Questo è monitorato tramite un programma personalizzato.
9. Dopo l'infortunio, mentre l'animale è ancora sotto il piano dell'anestesia, eseguire un test di Lachman per confermare clinicamente che si è verificata una rottura del LCA. Un test di Lachman è un test clinico utilizzato per valutare l'integrità del LCA valutando la stabilità del piano sagittale. Mentre si stabilizza il femore, tirare la tibia in avanti (in direzione anteriore) per valutare la quantità di movimento. Un ACL intatto produrrà una "sensazione finale ferma" in cui il ricercatore non sarà in grado di tradurre la tibia in avanti. Un ACL ferito produrrà una "sensazione finale morbida o molle", indicativa di un ACL strappato.
10. Palpare il femore e la tibia per rilevare eventuali danni ossei gravi. Se non vengono identificate controindicazioni, trasferire l'animale nella sua gabbia e consentirne il recupero. Durante questo periodo, monitora l'animale per assicurarti che non mostri alcun segno di dolore, come riluttanza a muoversi, vocalizzazione o postura anormale.

Imaging μCT della degenerazione articolare

Le immagini 2D sono ottenute utilizzando le impostazioni dello scanner di 70 kV, corrente 85,5 μA (Figura 2B). I dati vengono raccolti ogni passo di rotazione di 0,6° con una risoluzione di 11,5 μm attraverso un completo 180°. Le immagini in sezione trasversale vengono ricostruite utilizzando un algoritmo di retroproiezione levigata e sulla pila di immagini ricostruite (Figura 2C). La struttura trabecolare viene quindi analizzata mediante segmentazione in software, per cui una sfera di 1,53 mm è centrata nella piastra epifisale dei plateau tibiali e laterali e del femore per determinare lo spessore trabecolare (μm), la separazione trabecolare (μm) e il numero trabecolare (1/mm). ^5,6

1. A 4 settimane dopo la lesione del LCA, l'eutanasia del ratto con esposizione prolungata a CO₂ nella camera di induzione.
2. Estendere e proteggere l'arto posteriore danneggiato dall'ACL in un dispositivo personalizzato stampato in 3D (Figura 2A).
3. Acquisire immagini utilizzando μCT.
4. Ottenere radiografie del piano frontale per determinare lo spazio articolare. restringimento (tra il condiolo femorale e il plateau tibiale [misurato in mm]) rispetto all'arto non ferito.
5. Ottenere immagini 2D utilizzando le seguenti impostazioni dello scanner: 70 kV e corrente 85,5 μA.
6. Raccogli i dati ogni passo di rotazione di 0,6° con una dimensione in pixel di 11,5 μm attraverso un completo 180°.
7. Ricostruisci le immagini in sezione trasversale utilizzando un algoritmo di retroproiezione uniforme sulla pila di immagini ricostruite.
8. Per garantire che venga misurata una regione di interesse coerente, posizionare una sfera di 1,53 mm nella piastra epifisale dei plateau tibiali e laterali e del femore per determinare lo spessore trabecolare (μm), la separazione trabecolare (μm) e il numero trabecolare (1 /mm).

Figura 2: A) Dispositivo stampato personalizzato per tenere l'arto posteriore durante μCT, B) immagini 2D e C) 3D μCT.

Un numero trabecolare più piccolo, uno spessore trabecolare ridotto e una maggiore spaziatura trabecolare, tutte caratteristiche distintive dell'insorgenza della PTOA, erano evidenti 4 settimane dopo lo strappo del LCA non invasivo (Tabella 1 e Figura 3). Un'immagine di un LCA sezionato di un arto sano rispetto a un arto ferito acuto è mostrata nella Figura 5. Il nuovo modello non invasivo di lesione del LCA, in cui l'ACL viene rotto attraverso un singolo carico di compressione tibiale, è stato in grado di produrre una lacerazione prossimale isolata del LCA.

Figura 3: Immagine μCT ricostruita in 3D di una lesione acuta del LCA (a sinistra) e 4 settimane dopo la lesione del LCA (a destra) in un ratto.

Tabella 1: Misure caratteristiche dell'insorgenza della PTOA.

Figura 4: Immagine di un arto ACL acuto ferito (a sinistra) e immagine di un LCA intatto e sano (a destra).

Questo video dimostra come un attuatore lineare può essere utilizzato per produrre una rottura isolata non invasiva del LCA nei ratti. Questa lesione replica da vicino le condizioni di lesione rilevanti per l'uomo ed è altamente riproducibile. Per superare molti dei principali limiti delle tradizionali tecniche di colorazione OA, questo metodo utilizza μCT per quantificare la degenerazione articolare intera e la struttura trabecolare.

Gli interventi basati sull'evidenza per migliorare i risultati riabilitativi muscoloscheletrici sono un'area altamente significativa che è cambiata poco negli ultimi due decenni, anche se significativi progressi nella biologia di base hanno suggerito che le alterazioni dei protocolli di riabilitazione sono in ritardo da tempo. Il problema è che gli specialisti della riabilitazione classica hanno usato rapporti aneddotici per modellare la pratica clinica piuttosto che la scienza di base per fornire ipotesi informate che vengono testate in organismi modello prima della traduzione in clinica. Le procedure qui descritte forniscono agli scienziati un metodo per replicare da vicino una lesione articolare traumatica che è rilevante per gli esseri umani e utilizzare μCT per monitorare la progressione della salute delle articolazioni.

Elenco dei materiali:

1. Maerz T, Kurdziel MD, Davidson AA, Baker KC, Anderson K, Matthew HW. Biomechanical Characterization of a Model of Noninvasive, Traumatic Anterior Cruciate Ligament Injury in the Rat. Ann Biomed Eng. 2015;43(10):2467-2476.
2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
6. Jones MD, Tran CW, Li G, Maksymowych WP, Zernicke RF, Doschak MR. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2726-2735.