Gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton - Università della Virginia

La gascromatografia (GC) viene utilizzata per separare e rilevare composti di piccolo peso molecolare nella fase gassosa. Il campione è un gas o un liquido che viene vaporizzato nella porta di iniezione. Tipicamente, i composti analizzati sono meno di 1.000 Da, perché è difficile vaporizzare composti più grandi. GC è popolare per il monitoraggio ambientale e le applicazioni industriali perché è molto affidabile e può essere eseguito quasi continuamente. GC è tipicamente utilizzato in applicazioni in cui vengono rilevate piccole molecole volatili e con soluzioni non acquose. La cromatografia liquida è più popolare per le misurazioni in campioni acquosi e può essere utilizzata per studiare molecole più grandi, perché le molecole non hanno bisogno di vaporizzare. GC è favorito per le molecole non polari mentre LC è più comune per separare gli analiti polari.

La fase mobile per la gascromatografia è un gas vettore, tipicamente elio a causa del suo basso peso molecolare e del suo essere chimicamente inerte. Viene applicata la pressione e la fase mobile sposta l'analita attraverso la colonna. La separazione avviene utilizzando una colonna rivestita con una fase stazionaria. Le colonne capillari tubolari aperte sono le colonne più popolari e hanno la fase stazionaria rivestita sulle pareti del capillare. Le fasi stazionarie sono spesso derivate del polidimetilsilossano, con il 5-10% dei gruppi funzionalizzati per sintonizzare la separazione. I gruppi funzionali tipici sono i gruppi fenile, cianopropile o trifluoropropilico. Le colonne capillari sono solitamente lunghe 5-50 m. Le colonne più strette hanno una risoluzione più elevata ma richiedono pressioni più elevate. Le colonne imballate possono essere utilizzate anche dove la fase stazionaria è rivestita su perle imballate nella colonna. Le colonne imballate sono più corte, 1-5 m. I capillari tubolari aperti sono generalmente preferiti perché consentono maggiori efficienze, analisi più veloci e hanno capacità più elevate.

Il rilevamento della ionizzazione di fiamma (FID) è un buon rivelatore generale per composti organici in GC che rileva la quantità di carbonio in un campione. Dopo la colonna, i campioni vengono bruciati in una fiamma calda idrogeno-aria. Gli ioni carbonio sono prodotti dalla combustione. Mentre l'efficienza complessiva del processo è bassa (solo 1 su 10⁵ ioni carbonio produce uno ione nella fiamma) la quantità totale di ioni è direttamente proporzionale alla quantità di carbonio nel campione. Gli elettrodi sono usati per misurare la corrente dagli ioni. Il FID è un rilevatore distruttivo, poiché l'intero campione è pirolizzato. Il FID non è influenzato da gas e acqua non combustibili.

L'equilibrio per la gascromatografia è la partizione e i componenti del campione si divideranno(cioè distribuiranno) tra le due fasi: la fase stazionaria e la fase mobile. I composti che hanno una maggiore affinità per la fase stazionaria trascorrono più tempo nella colonna e quindi eluiscono più tardi e hanno un tempo di ritenzione più lungo (t_R) rispetto ai campioni che hanno una maggiore affinità per la fase mobile. L'affinità per la fase stazionaria è guidata principalmente dalle interazioni intermolecolari e la polarità della fase stazionaria può essere scelta per massimizzare le interazioni e quindi la separazione. I picchi ideali sono distribuzioni gaussiane e simmetriche, a causa della natura casuale delle interazioni analitiche con la colonna. Le caratteristiche di picco asimmetriche, come il fronting o lo tailing del picco, possono essere dovute al sovraccarico della colonna, ai problemi di iniezione o alla presenza di gruppi funzionali adsorbiti come gli acidi carbossilici.

In GC, la temperatura viene regolata per cambiare l'equilibrio e quindi i tempi di eluizione. Le separazioni in GC si basano sulla volatilità perché le sostanze con punto di ebollizione più elevato possono condensarsi su una colonna se la temperatura è bassa, quindi non vengono eluite o richiedono molto tempo per eluire. Le separazioni isotermiche vengono eseguite a una temperatura o le separazioni a gradiente vengono eseguite dove la temperatura viene incrementata durante la separazione. Le rampe di temperatura consentono di separare i composti a basso e alto punto di ebollizione nella stessa separazione.

La lettura prodotta da GC è un cromatogramma che dà il segnale nel tempo. I picchi sono osservati per ogni composto nel campione. Per ogni picco, è possibile calcolare un'altezza di picco e un'area di picco. L'area di picco viene generalmente utilizzata per creare curve di calibrazione e per calcolare le concentrazioni di campioni in incognite. Il numero di piastre teoriche (N) viene calcolato da ciascun picco per fornire una misura dell'efficienza della colonna. Un'equazione pratica per misurare N è N=16(t_R/W)² dove t_R è il tempo di ritenzione dell'analita e W è la larghezza del fondo del picco. N viene utilizzato per confrontare le separazioni su colonne diverse.

Il rivelatore a ionizzazione di fiamma è sensibile alla massa. Pertanto, la quantità di segnale è proporzionale alla massa di carbonio nel campione, non al numero di moli. I composti con più carbonio danno segnali maggiori. La combustione del carbonio produce ioni che vengono rilevati come corrente. FID è uno dei rivelatori generali più sensibili per GC con un limite di rilevamento nell'intervallo del picogramma. La risposta è lineare su sette ordini di grandezza, dandogli un ampio intervallo lineare.

1. Inizializzazione del CG

1. Accendere il gas e l'aria di trasporto dell'elio e regolare i manometri sullo strumento.
2. Accendere il forno a colonna ad alta temperatura (in genere 250 °C o superiore) per cuocere nella colonna. Non superare la temperatura massima della colonna. Questo rimuoverà eventuali contaminanti. Lasciare cuocere per almeno 30 minuti prima di eseguire un campione.

2. Creazione di un file di metodi

1. Nel software che controlla lo strumento, inserire tutti i valori desiderati per un file di metodi. Innanzitutto, imposta le impostazioni del autocampionatore. Impostare il numero di risciacqui pre-esecuzione, risciacqui post-esecuzione e risciacqui con campione. Questi risciacqui puliscono la colonna tra diversi campioni.
2. La quantità iniettata è in genere di 1 μL. Di solito viene impostato un rapporto di divisione perché l'iniezione di tutto un campione potrebbe sovraccaricare la colonna. Se il rapporto di divisione è 100:1, ciò significa che per ogni 1 parte che viene iniettata nello strumento 100 parti vanno sprecate.
3. Immettere i parametri della fase mobile. La portata è controllata dalla pressione impostata. Portate più elevate portano a separazioni più rapide, ma c'è meno tempo per l'analita di interagire con la colonna.
4. Immettere la programmazione della temperatura. Per una corsa isotermica, inserire la temperatura della separazione e quindi un tempo per la separazione. Per un'eluizione del gradiente, immettere la temperatura iniziale e il tempo di attesa, la temperatura finale e il tempo di attesa e la velocità di rampa in °C/min. Viene inoltre impostato un tempo di equilibrio che consente alla colonna di raffreddare la temperatura originale tra una corsa e l'altra.
5. Immettere i parametri del rilevatore. Verranno inserite una temperatura e una frequenza di campionamento del rilevatore. Il rivelatore deve avere sempre una temperatura superiore alla temperatura della colonna in modo che nessun analita si condensi sul rivelatore.
6. Salvare il file dei metodi. Potrebbe anche essere necessario scaricare i parametri in modo che vengano letti dal GC.

3. Raccolta dei dati delle CG

1. Accendere l'idrogeno gassoso e assicurarsi che il manometro sia impostato correttamente. Accendi la fiamma del FID.
2. Sul rack dell'autocampionatore, riempire il flaconcino di lavaggio con solvente di lavaggio, come acetonitrile o metanolo. Assicurarsi che il flaconcino di scarico sia vuoto.
3. Preparare il campione. Se c'è qualche possibilità di particolato nel campione, filtrare il campione. Poiché a volte si possono vedere residui di plastica con GC, utilizzare solo siringhe di vetro e flaconcini di vetro per preparare il campione.
4. Riempire il flaconcino almeno a metà strada con il campione in modo che la siringa autocampionatore sia assicurata per raccogliere il campione. I flaconcini dell'autocampionatore sono in genere di 2 ml, ma se il volume del campione è limitato, sono disponibili inserti del flaconcino per ridurre il volume del campione necessario.
5. Caricare il flaconcino o i flaconcini campione nel rack dell'autocampionatore. Tieni traccia della posizione in cui si trova ogni campione.
6. Prima dell'esecuzione, azzerare la linea di base del registratore grafico sul software del computer.
7. I file possono essere raccolti come singola esecuzione o utilizzando una tabella batch per più esecuzioni. Assicurarsi di specificare il numero di flaconcino corretto per il campione. Premi il pulsante "start" e crea un file.
8. I dati vengono in genere analizzati con un programma software. I parametri che possono essere misurati includono il tempo di ritenzione, l'altezza del picco, l'area del picco e il numero di piastre teoriche.

4. Risultati: Analisi GC di campioni di caffè

1. In questo esempio, l'analisi GC-FID è stata eseguita per la caffeina e l'acido palmitico, due composti presenti nel caffè. La caffeina è meno polare dell'acido palmitico, che ha una lunga coda di alcano a catena. Pertanto, la caffeina viene trattenuta meno ed eluisce prima sulla colonna non polare del 95% di dimetilpolisilossano e del 5% di fenil-arilene (Figura 1).
2. Dal cromatogramma è possibile calcolare le aree di picco. Le aree di picco sono proporzionali alla massa di carbonio che passa attraverso il rivelatore e possono essere utilizzate per effettuare una curva di calibrazione della risposta dello strumento rispetto alla concentrazione. Per la Figura 1,l'area di picco è 27.315 per la caffeina e 18.852 per l'acido palmitico.
3. Una misura dell'efficienza della colonna è N, il numero di piastre teoriche. N può essere calcolato dal cromatogramma per ogni picco. Per la Figura 1,N è 283.000 per la caffeina e 261.000 per l'acido palmitico.
4. La Figura 2 mostra l'effetto della temperatura sulle separazioni isotermiche. Due separazioni sono sovrapposte dello stesso campione di caffeina e acido palmitico. Il primo è a 180 °C e il secondo a 200 °C. I tempi di ritenzione sono molto più piccoli per la maggiore temperatura.

Figura 1. Analisi GC-FID di campioni di caffeina e acido palmitico. Lo standard di caffeina 5 mM eluisce per primo, seguito dal campione di acido palmitico da 1 mM. La rampa di temperatura era di 0,1 minuti a 150 °C seguita da una rampa a 10 °C/min a 220 °C dove la temperatura veniva mantenuta per 5 minuti.

Figura 2. Analisi GC-FID delle corse isotermiche di un campione di caffè tostato scuro. Un confronto tra GC-FID funziona a 180 °C e 200 °C per un campione di caffè tostato scuro. I picchi si eluiscono molto più velocemente con la temperatura di 200 °C.

GC è utilizzato per una varietà di applicazioni industriali. Ad esempio, viene utilizzato per testare la purezza di un prodotto chimico sintetizzato. GC è anche popolare nelle applicazioni ambientali. GC viene utilizzato per rilevare pesticidi, idrocarburi poliaromatici e ftalati. La maggior parte delle applicazioni di qualità dell'aria utilizza GC-FID per monitorare gli inquinanti ambientali. GC viene anche utilizzato per l'analisi dello spazio di testa, in cui vengono raccolti e misurati i volatili evaporati da un liquido. Questo è utile per l'industria cosmetica e alimentare e delle bevande. GC viene utilizzato anche per applicazioni forensi, come il rilevamento di droghe d'abuso o esplosivi. Inoltre, GC è utile nell'industria petrolifera per misurare gli idrocarburi. Le ampie applicazioni rendono GC un miliardo di dollari all'anno mercato mondiale.

La Figura 3 mostra un esempio di come GC potrebbe essere utilizzato nell'industria alimentare. La figura 3 mostra un cromatografo di vaniglia artificiale (nero) e vaniglia reale (rosso). GC può essere utilizzato per identificare il campione reale, che contiene un grande picco per la vanillina ma non contiene un secondo picco per l'etilvanillina.

Figura 3. Cromatogramma GC-FID di campioni di vaniglia. Sia l'imitazione che la vera vaniglia mostrano grandi picchi a 4,7 minuti a causa della vanillina, il componente principale della vaniglia. Tuttavia, l'imitazione della vaniglia ha anche un grande picco a 5,3 minuti, che è dovuto all'etilvanillina, un composto non presente in grandi quantità nella vera vaniglia.