Trasduzione retrovirale efficiente e homing competitivo per lo studio della localizzazione delle cellule T mediata da GPCR in diversi microambienti tissutali

Presentiamo protocolli migliorati per la trasduzione retrovirale dei recettori del traffico e l'homing competitivo per studiare il posizionamento dei linfociti specifici per organo e microambiente mediati dal recettore. Questo metodo offre preziose informazioni sui meccanismi di traffico delle cellule immunitarie e ha potenziali applicazioni nella futura ricerca di base e terapeutica.

Comprendere in che modo l'espressione del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) influenzi il posizionamento delle cellule all'interno di diversi microambienti tissutali è essenziale per chiarire i meccanismi di traffico delle cellule immunitarie. Presentiamo un saggio di homing competitivo progettato per studiare la localizzazione delle cellule T mediata da GPCR negli organi che esprimono i loro ligandi chemioattrattivi affini, applicabile sia per studi a breve che a lungo termine. L'approccio prevede un protocollo migliorato per la trasduzione ricombinante del virus delle cellule staminali murine (MSCV) delle cellule T per esprimere il GPCR di interesse o un costrutto di controllo, seguito da un homing competitivo nei topi riceventi. La distribuzione cellulare tra i diversi organi viene analizzata utilizzando la citometria a flusso e/o la microscopia confocale. In esperimenti a breve termine (10-12 ore), la microscopia confocale ha rivelato distinti modelli di localizzazione cellulare, inclusi alveoli, sottomucosa dei bronchi, siti venosi e interstizio nel polmone, nonché l'epitelio che riveste la trachea, lo stomaco e il corno uterino. Negli studi a lungo termine (1-7 settimane), la citometria a flusso ha fornito informazioni sull'accumulo preferenziale di cellule, rivelando cambiamenti dinamici e potenziale maturazione o riposizionamento all'interno dei tessuti nel tempo. Questo saggio di homing competitivo è uno strumento robusto per lo studio del posizionamento cellulare mediato da GPCR, che offre preziose informazioni sulla distribuzione tessuto-specifica e sulle potenziali applicazioni in immunologia e ricerca terapeutica.

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono fondamentali nella regolazione di una varietà di processi cellulari, tra cui la trasduzione del segnale, la neurotrasmissione, la regolazione ormonale^{e la migrazione} delle cellule immunitarie. Svolgono un ruolo cruciale nel controllo spazio-temporale della migrazione e della localizzazione dei linfociti². Durante la fase di priming delle risposte immunitarie, il microambiente locale e le interazioni cellulari spingono i linfociti T a esprimere un insieme unico di molecole di adesione e recettori per chemochine noti come recettori di homing. Questo adattamento consente alle cellule T con esperienza antigenica di interagire con le cellule endoteliali (EC) organo-specifiche e di migrare verso tessuti bersaglio distinti. La capacità delle cellule T di acquisire il trofismo tissutale è vitale per risposte di richiamo efficaci, in particolare nel contesto di infezioni ricorrenti che colpiscono lo stesso organo ^3,4.

I GPCR guidano le cellule immunitarie verso tessuti e organi specifici in cui svolgono funzioni critiche, come dirigere le cellule T e NK CD8+ verso i siti tumorali per l'azione citotossica o aiutare le cellule T CD4+ a orchestrare le risposte immunitarie supportando l'attivazione di altre cellule immunitarie. Comprendere in che modo i GPCR dirigono le cellule T verso le loro posizioni precise è essenziale per far progredire le immunoterapie mirate ^5,6. La sfida, tuttavia, risiede nella modellazione di queste complesse interazioni in vitro, poiché è difficile replicare contemporaneamente sia i segnali spazialmente limitati che i segnali chemiotattici direzionali.

Chiarire i ruoli di specifici recettori leucocitari è spesso difficile anche a causa della loro limitata frequenza di espressione nelle popolazioni endogene e del fatto che questi recettori in genere decorano tipi cellulari distinti. Questa complessità rende difficile isolare il ruolo di un recettore specifico da altri meccanismi specifici di un sottoinsieme cellulare. Idealmente, i metodi dovrebbero confrontare popolazioni simili, differendo solo nel recettore di interesse per fornire intuizioni chiare.

Per superare queste sfide, abbiamo adottato un saggio di homing competitivo che impiega la trasduzione retrovirale ricombinante di MSCV per un'efficiente espressione di GPCR nelle cellule T. I vettori retrovirali MSCV, che combinano elementi dei vettori MESV basati sul virus del sarcoma mieloproliferativo (PCMV) e dei vettori LN basati sul virus della leucemia murina di Moloney (MMLV), incorporano un segnale di imballaggio ibrido esteso derivato dai vettori LN⁷. Questa modifica migliora l'efficienza della consegna genica, consentendo studi sia a breve che a lungo termine sulla localizzazione delle cellule T in vivo. Utilizzando particelle retrovirali ad alto titolo e microscopia confocale, l'approccio consente una visualizzazione precisa del posizionamento e delle interazioni delle cellule T all'interno di ambienti tissutali complessi. Presentiamo protocolli dettagliati per la trasduzione retrovirale dei recettori di traffico e l'esecuzione di saggi di homing controllati internamente (cosiddetti competitivi) per studiare il posizionamento dei linfociti specifici per organi e microambienti mediati da recettori. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire preziose informazioni sui meccanismi di traffico delle cellule immunitarie e di consentire future applicazioni sia nella ricerca di base che nello sviluppo terapeutico.

Tutti i topi in questo studio sono stati mantenuti in strutture specifiche prive di agenti patogeni (SPF) presso il Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). I topi B6/SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6/J (CD45.2) e Rag1-/- sono stati acquistati dai Jackson Laboratories. Sebbene sia stato utilizzato PepBoy per ottenere le cellule CD45.1, si consiglia di utilizzare JAXBoy (C57BL/6J-Ptprc^em6Lutzy/J). JAXBoy è una varietà completamente coisogenica generata attraverso CRISPR invece del tradizionale reincrocio, il che migliora la coerenza genetica. Storicamente, gli studi marcati con l'allotipo CD45 utilizzando topi PepBoy (CD45.1), che non sono completamente congeniti, hanno incluso saggi di homing e ricircolo di controllo con confronti wild-type (WT/WT) per affrontare la potenziale variabilità. Con i mouse JAXBoy ora disponibili come alternativa completamente isogenica, questi controlli aggiuntivi potrebbero non essere più necessari. I ricercatori dovrebbero ancora considerare che le differenze tra le varianti CD45.1 e CD45.2 – come il loro ruolo come proteina tirosina fosfatasi – possono influenzare il comportamento cellulare e i modelli di homing. Tutti i protocolli discussi nel testo e di seguito sono stati approvati o soddisfano le linee guida del Dipartimento accreditato di Medicina degli Animali da Laboratorio e del Gruppo Amministrativo sulla Cura degli Animali da Laboratorio presso il VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Gli animali venivano sacrificati secondo procedure approvate. Topi di entrambi i sessi, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono stati inclusi negli esperimenti.

1. Preparazione del vettore MSCV

1. Acquista il vettore retrovirale MSCV-IRES-Thy1.1 con la regione codificante del gene di interesse del topo (GOI) o un ORF_Stuffer (controllo ORF negativo)
   NOTA: Questo costrutto include il marcatore di superficie Thy1.1 insieme al gene GPCR di interesse. Il linker IRES (Internal Ribosome Entry Site) consente la co-espressione del GPCR con il Thy1.1, facilitando l'identificazione delle cellule trasdotte mediante citometria a flusso o purificazione e isolamento mediante biglie magnetiche. Ciò è particolarmente utile quando gli anticorpi specifici per i GPCR non sono disponibili, come spesso accade con i GPCR poco studiati.
2. Procurarsi il plasmide MSCV in forma batterica e coltura inoculando brodo di Luria-Bertani (LB) integrato con un'appropriata selezione di antibiotici basata sul gene di resistenza codificato dal plasmide (ad esempio, ampicillina, kanamicina o cloramfenicolo). Il terreno LB è costituito da triptone (10 g/L), estratto di lievito (5 g/L) e NaCl (10 g/L), regolati a pH 7,0 e sterilizzati in autoclave. Incubare la coltura a 37 °C in un'incubatrice vibrante (220 giri/min) per una notte.
3. Preparare stock di plasmidi utilizzando tecniche standard di biologia molecolare utilizzando un kit di preparazione del DNA.
4. Dopo l'isolamento del DNA, misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro e preparare soluzioni plasmidiche funzionanti a una concentrazione di 1 μg/μL. Conservare i plasmidi a -20 °C per un uso futuro.

2. Stabilire la coltura della linea cellulare di confezionamento

NOTA: Abbiamo utilizzato cellule di platino E (Plat-E) di Cell Biolabs. Le cellule Plat-E sono una linea cellulare a base di 293T con un promotore EF1α, che fornisce un'espressione stabile e ad alto rendimento delle proteine strutturali retrovirali (geni gag, pol ed env), consentendo l'impacchettamento retrovirale con una singola trasfezione plasmidica⁸. Sebbene possano essere utilizzate altre linee cellulari, come NIH-3T3 o 293T, non abbiamo testato queste alternative.

1. Preparare i terreni cellulari Plat-E aggiungendo DMEM, 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina, blasticidina (10 μg/mL) e puromicina (1 μg/mL). Utilizzare la blasticidina e la puromicina per il mantenimento delle cellule, ma ometterle durante e dopo la trasfezione.
2. Le cellule Plat-E su piastra vengono spedite congelate in 1,0 mL, a >3 x 10⁶ cellule/mL in DMEM, 20% FBS e 10% DMSO. Scongelarli rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire tutte le cellule scongelate in una provetta conica da 15 mL contenente terreno di coltura Plat-E.
3. Centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno Plat-E mediante pipettaggio delicato per creare una sospensione a cellula singola.
4. Aggiungere 9 mL di terreno Plat-E a una piastra di coltura da 10 cm, quindi trasferire 1 mL di cellule risospese nella piastra. Confermare che le cellule scongelate sono vitali mescolando un volume uguale di sospensione cellulare e blu di tripano e contando le cellule vitali (non colorate) e morte (colorate in blu) utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule, con l'obiettivo di ottenere una vitalità del >70%.
5. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5%. Non cambiare il mezzo per i primi 3 giorni; È normale osservare cellule galleggianti e morte al primo disgelo.
6. Quando le cellule raggiungono l'85%-90% di confluenza, lavare con DMEM/PBS Ca-/Mg-. Staccare le cellule utilizzando 2 mL di tripsina allo 0,05%/0,5 mM EDTA e incubare per 3 minuti a 37 °C. Aggiungere 8 mL di terreno Plat-E, raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C.
7. Dividere con un rapporto di superficie 1:10 o 1:5 (ad esempio, seminare nuove piastre con 1/10 o 1/5 del volume totale della piastra originale). Risospendere in un volume finale di 10 mL di terreno Plat-E e incubare a 37 °C in un incubatore umidificato con CO₂ al 5%.
8. Aliquotare il resto delle cellule in 1 mL di FBS con DMSO al 10% e congelare a -80 °C e successivamente in azoto liquido per un uso a lungo termine.
   NOTA: Trattare le cellule come descritto sopra quando sono vicine all'85% confluenti. Per mantenere una salute ottimale delle cellule, evitare l'eccessiva confluenza e puntare a divisioni di 3 giorni con diluizione 1:10. Se la crescita rallenta, utilizzare un'aliquota fresca. Le prestazioni delle celle in genere diminuiscono con i passaggi successivi. Si consiglia di utilizzare le celle per la trasfezione tra i passaggi 4 e 15 per ottenere i migliori risultati.

3. Produzione di cellule trasdotte

1. Giorno 1: Cellule E Seed Plat
   NOTA: Calcolare il numero di celle e piastre Plat E necessarie. Abbiamo utilizzato 1 mL di surnatante virale per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti per trasfettare le cellule 2 volte. Di solito utilizziamo circa due piastre trasfettate con piastra di Petri da 10 cm con cellule E per piastra da 24 pozzetti con cellule T in coltura.
   1. Iniziare rivestendo piastre di coltura tissutale da 10 cm con 5 mL di poli-D-lisina da 50 μg/mL in acqua sterile. Incubare a temperatura ambiente per 45 min. Lavare 2 volte con PBS Ca-/Mg sterile, per assicurarsi che non rimangano residui.
      NOTA: Si consiglia di rivestire le piastre poiché le cellule Plat-E tendono a staccarsi dopo la trasfezione, portando a scarse prestazioni cellulari e a una ridotta produzione di titoli virali.
   2. Staccare le cellule Plat-E come descritto sopra al punto 2.6 ed eseguire un saggio di esclusione del blu di tripano per garantire la vitalità. Mescolare un volume uguale di sospensione cellulare e Trypan Blue. Contare le cellule vitali (non colorate) e morte (colorate in blu) utilizzando un emocitometro/contatore di cellule. Seminare 3 cellule vive da 10′ in una piastra Petri per colture tissutali da 10 cm con terreno Plat-E privo di antibiotici.
      NOTA: Le piastre seminate dovrebbero raggiungere l'85%-90% di confluenza il giorno successivo. Se ciò non viene raggiunto, prendere in considerazione l'utilizzo di un'aliquota di cella diversa. Regolare la densità di semina in base ai tempi di placcatura; Per la placcatura serale, possono essere utilizzate 3,5 x 10⁶ celle.
2. Giorno 2: Trasfezione di cellule Plat-E e piastre di rivestimento per cellule T con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28
   1. Sostituire il terreno su colture cellulari Plat-E con 6,5 mL di terreno di sieroterapia ridotto.
   2. Preparare la miscela di trasfezione secondo le istruzioni del produttore per il reagente Lipofectamine (in questo studio è stato utilizzato Lipofectamine 2000).
   3. Per ogni piastra, mescolare 45 μl di Lipofectamine 2000 con 210 μl di terreno sierico ridotto in una provetta e 15 μg di DNA con 235 μl di terreno sierico ridotto in un'altra provetta. Combinare il contenuto delle provette pipettando 3x-4x.
   4. Incubare la miscela per 5-20 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi lipofectamina/DNA, quindi aggiungere goccia a goccia alle piastre. Incubare le piastre per 16 ore a 37 °C.
   5. Pozzetti di attivazione delle cellule T: rivestire piastre a 24 pozzetti con 5 μg/mL di CD28 anti-topo (37,51) e 10 μg/mL di CD3 anti-topo (145-2c11) in PBS da 375 μL/pozzetto durante la notte a 4 °C o per 3-4 ore nell'incubatore a 37 °C il giorno 3.
      NOTA: Avvolgere le piastre in una pellicola trasparente se incubate durante la notte per evitare l'evaporazione. L'attivatore per topi Dynabeads CD3/CD28 può essere utilizzato in alternativa con risultati comparabili.
3. Giorno 3: Cambiare il terreno Plat-E e isolare e attivare le cellule T
   1. Sostituire il terreno di trasfezione Plat-E con 14 mL di terreno completo DMEM al mattino. Preparare i terreni di coltura delle cellule T aggiungendo RPMI-10: RPMI 1640 con L-glutammina, 10% FBS, 1% Penicillina/Streptomicina, 1x MEM Aminoacidi non essenziali, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μM di β-mercaptoetanolo e 1 mM di HEPES.
   2. Eutanasia dei topi JAXBoy (CD45.1) e C57B6/J (CD45.2) utilizzando l'inalazione di CO₂seguita da lussazione cervicale. Isolare milze e linfonodi in condizioni sterili.
   3. Schiacciare delicatamente la milza su un filtro cellulare a rete di nylon da 100 μm con terreno RPMI in una piastra a 6 pozzetti utilizzando uno stantuffo a siringa.
   4. Trasferire la soluzione attraverso un filtro cellulare a rete di nylon da 40 μm per una sospensione a cellula singola in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare a 450 x g per 5 min a 4 °C e lavarli con PBS Ca-/Mg-.
   5. Eseguire la selezione del negativo magnetico utilizzando il kit di isolamento Mouse T/T CD4 seguendo le istruzioni del produttore o, in alternativa, ordinare le cellule utilizzando FACS sterile
   6. Contare le cellule T utilizzando un contatore di cellule e piastrle nei pozzetti di attivazione delle cellule T a 1-1,5 x 10⁶ per pozzetto in 1 mL di terreno RPMI-10 per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore umidificato. Attendere 24-48 ore per una corretta attivazione, come valutato al microscopio, come spiegato nelle note seguenti.
      NOTA: La reticolazione di CD3 e CD28 attiva efficacemente le cellule T in questa configurazione. Una milza di topo produce tipicamente circa 1 x 10⁸ splenociti. Le cellule T CD4+ costituiscono generalmente circa il 10% della popolazione totale di splenociti. Pertanto, per preparare una piastra a 24 pozzetti con 1-1,5 x 10⁶ cellule T CD4+ per pozzetto, si stima che saranno sufficienti cellule di 2-3 topi.
4. Giorno 4: Trasduzione
   1. Controllare le cellule T dopo 24 ore al microscopio. Assicurarsi che le cellule T siano in uno stato esplosivo (formando cluster e apparendo ingrandite a causa dell'attivazione) prima della trasduzione. L'esplosione delle cellule T assicura che siano in uno stato di divisione, che è fondamentale per la trasduzione di MSCV⁹.
   2. Raccogliere ~10 mL di surnatante virale dalle piastre da 10 cm in una provetta conica. Sostituire le piastre di coltura Plat-E con altri 10 mL di terreno Plat-E senza antibiotici per garantire un terreno sufficiente a generare più terreno per una seconda trasduzione il giorno successivo. Regolare il volume dei terreni nelle piastre PLAT-E in base al numero di pozzetti delle cellule T che devono essere trasfettati il giorno successivo.
      NOTA: La trasduzione di 2x migliora significativamente l'efficienza.
   3. Filtrare il surnatante virale facendolo passare attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm. Aggiungere 8 μg/mL di polibrene e HEPES 1:100.
   4. Centrifugare la piastra di celle T a 24 pozzetti per 7 minuti a 950 x g. Raccogliere e conservare con cura il surnatante senza spostare le cellule. Questo surnatante contiene citochine e altri fattori secreti dalle cellule T dopo l'attivazione e sostituiti con questo surnatante dopo la frattura per mantenere il profilo delle citochine e dei fattori per supportare la proliferazione e la crescita delle cellule T.
   5. Eseguire la sterilizzazione aggiungendo 1 mL di surnatante virale a ciascun pozzetto e centrifugando a 1.150 x g per 4 ore a 32 °C. Sigillare le piastre con pellicola trasparente durante la sterilizzazione.
   6. Dopo la sterilizzazione, sostituire con cura il terreno con il surnatante delle cellule T precedentemente salvato.
5. Giorno 5: Ripetere la trasduzione
   1. Ripetere la trasfezione come descritto il giorno 4. Facoltativamente, se il terreno appare esaurito, mescolare il surnatante salvato nel passaggio 3.4.3 delle cellule T attivate inizialmente con terreni freschi in un rapporto 1:1.
6. Giorno 6: Lavare le celle ed espandere
   1. Lavare le celle con PBS Ca+/Mg+. e trasferirli in una nuova piastra di coltura con 130 U/mL di IL2 di topo e 10 ng/mL di IL7 di topo. Incubare le cellule per almeno 2 giorni o fino a quando non raggiungono il livello di espansione desiderato, in base al numero di cellule necessarie per l'iniezione.
7. Giorno 8: Raccolta e purificazione
   1. Raccogli le cellule e purificale con un gradiente di densità Histopaque 1.077.
      NOTA: Questa tecnica aiuta a isolare le cellule vitali (come i linfociti o altre cellule immunitarie) dalle cellule morte o dai detriti. Le cellule morte, che hanno una densità più elevata, si depositano sul fondo del tubo, mentre le cellule vitali in genere rimangono nello strato di interfaccia.
   2. Aggiungere 5 mL di Histopaque 1.077 a una provetta da 15 mL. Raccogliere le celle centrifugando a 450 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule.
   3. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS Ca+/Mg+. Sovrapporre accuratamente la sospensione cellulare sopra 5 mL di Histopaque 1.077 nella provetta da centrifuga.
   4. Centrifugare a 400-500 x g per 20 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi che la rottura/accelerazione della centrifuga sia impostata a zero.
   5. Dopo la centrifugazione, le cellule si separeranno in strati distinti in base alla densità. Le celle desiderate si troveranno tipicamente allo strato di interfaccia tra l'istopaco e il mezzo superiore, mentre le celle morte si depositeranno sul fondo. Raccogliere con cura lo strato di cellule allo strato di interfaccia utilizzando una pipetta, evitando la contaminazione con altri strati. Le cellule raccolte sono ora pronte e pulite per le iniezioni.
   6. Valutare l'efficienza della trasduzione eseguendo la colorazione Thy1.1 e l'analisi della citometria a flusso. Vedere la strategia di gating nella Figura 1.
      NOTA: Dopo la trasduzione, le cellule possono essere utilizzate nei saggi di chemiotassi per valutare la loro migrazione verso chemochine specifiche rispetto alle cellule vettoriali di controllo per confermare funzionalmente la loro attività in vitro prima di procedere con le iniezioni.
8. Saggio di localizzazione in vivo a lungo termine
   1. Per l'homing a lungo termine, utilizzare CD45.1 per il GPCR di topo di interesse e CD45.2 per le cellule trasdotte a vettore vuoto (o viceversa). Mescolare le due popolazioni cellulari in un rapporto 1:1.
   2. Iniettare per via endovenosa 20-30 x 10⁶ cellule totali per ogni topo adulto ricevente Rag1-/- per 1 settimana di tropismo e 5 x 10⁶ per 7 settimane di tropismo. Utilizziamo riceventi di Rag1-/- carenti di linfociti per ridurre la competizione con le cellule T endogene.
   3. Dopo 1-7 settimane (a seconda dello studio), iniettare l'anticorpo anti-CD45 per via endovenosa (i.v.) nei topi 5 minuti prima del prelievo per marcare le cellule trasportate dal sangue.
   4. Eutanasia dei topi utilizzando l'inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
      NOTA: Sono stati condotti studi di 1 settimana e 7 settimane; Studi più lunghi possono essere possibili, ma devono ancora essere testati.
   5. Raccogli cellule da diversi organi di interesse e controlli. Digerire i tessuti secondo i protocolli standard di preparazione dei linfociti per ogni organo^10,11.
   6. Colorare le cellule raccolte con anticorpi monoclonali (mAb) per l'analisi citofluorimetrica.
9. Homing competitivo a breve termine: posizionamento delle cellule T e imaging
   1. Si consiglia di utilizzare topi C57B6/J come donatori, dato che etichetteremo le cellule in modo fluorescente. Tuttavia, per saggi di homing molto brevi fino a poche ore, è possibile utilizzare qualsiasi ceppo.
   2. L'ottavo giorno di coltura, isolare magneticamente le cellule trasdotte (Thy1.1+) utilizzando microsfere CD90.1, secondo le istruzioni del produttore¹².
   3. Mantenere in coltura solo le cellule trasdotte (purezza >95%) dopo questo punto per 2 giorni sotto IL2 e IL7 come indicato sopra e lasciarle espandere. Le microsfere sono biodegradabili e dopo 48 ore non compromettono la normale funzione cellulare.
   4. Il giorno 11, etichettare le cellule che esprimono il GPCR di interesse con carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE è un colorante fluorescente per la colorazione cellulare). Per le celle Stuffer, utilizzare un colorante fluorescente giallo o viceversa. Se preferisci, puoi usare coloranti alternativi.
      1. Preparare una sospensione cellulare a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL in RPMI con FBS al 2%. Incubare le cellule con il colorante a una concentrazione finale di 5 μM a 37 °C in un bagno d'acqua con leggera agitazione per 20 minuti. Per garantire risultati comparabili, alternare le assegnazioni dei coloranti in esperimenti separati. In alternativa, utilizzare un singolo colorante per etichettare un tipo di cellula comune come standard interno, includendo cellule sperimentali e di controllo in diversi destinatari.
      2. Lavare le celle marcate e mescolarle in rapporto 1:1. Stimare la concentrazione di celle utilizzando un contatore di cellule. Iniettare 15-30 x 10⁶ cellule per via endovenosa nei topi riceventi (topi riceventi WT o transgenici, a seconda dello scopo dell'esperimento).
   5. Circa 10-12 ore dopo, iniettare nei topi l'anticorpo anti-CD31 (ad esempio, marcato con DyLight 633, clone 390), che dovrebbe essere 10-15 minuti prima del sacrificio per delineare i vasi sanguigni e discriminare le cellule intravascolari da quelle stravasate.
   6. Eutanasia dei topi utilizzando l'inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale. Analizzare la localizzazione cellulare mediante FACS delle sospensioni cellulari come descritto nel passaggio 3.8 sopra o mediante imaging di montature intere di tessuto come nel passaggio 3.9.8 o nel passaggio 3.9.7 per gli organi di interesse utilizzando la microscopia confocale.
   7. Per organi sottili come la trachea, il corno uterino o i linfonodi, prepara le montature da squash. Posizionare il fazzoletto su un vetrino con nastro biadesivo sui lati, aggiungere alcune gocce di soluzione di montaggio Fluoromount-G, coprire con un vetrino coprioggetti e premere delicatamente e uniformemente per fissare il vetrino coprioggetti al nastro utilizzando un vetrino separato o un altro oggetto piatto.
   8. Per le sezioni congelate, incorporare il fazzoletto nel composto della temperatura di taglio ottimale (OCT). Per i polmoni, perfondere con il 50% di OCT/PBS prima dell'inclusione.
   9. Utilizzare la citometria a flusso per organi di controllo come i linfonodi periferici (PLN), la milza o il sangue per valutare l'efficienza di trasduzione (% Thy1,1+) come mostrato nella Figura 1 e normalizzare i risultati. Visualizzazione di PLN con montature o sezioni di squash utilizzando la microscopia confocale. Conta le cellule utilizzando la microscopia confocale con il software Imaris.
   10. Determinare il rapporto tra le cellule trasdotte da GPCR e le cellule di controllo (trasdotte da Stuffer) in interi organi o compartimenti d'organo specifici. Normalizzare i rapporti di input determinati dal FACS e/o il rapporto recuperato dagli organi di controllo in cui il GPCR è noto o si presume irrilevante.
   11. Per l'analisi della localizzazione microambientale nei polmoni, misurare la distanza delle cellule dai punti di riferimento istologici (ad esempio, membrane o vene del basamento bronchiale) utilizzando il software Imaris.

In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per studiare la capacità di specifici recettori di dirigere la localizzazione delle cellule T in vivo. Come dimostrazione di questo protocollo, abbiamo utilizzato GPR25¹³. Siamo in grado di raggiungere un'efficienza di trasduzione del 30%-40% utilizzando questo protocollo, come valutato dalla colorazione Thy1.1 mediante citometria a flusso. Abbiamo eseguito saggi di chemiotassi basati su transwell in vitro utilizzando cellule trasdotte con GPR25 insieme a controlli stuffer, testando la loro migrazione verso hCXCL17, mCXCL17 e CXCL12 come controllo positivo. Le cellule T trasdotte con GPR25 sono migrate in modo efficiente verso CXCL17 rispetto alle cellule trasdotte con stuffer, confermando il successo della trasduzione e dell'espressione funzionale del recettore (Figura 2).

Homing a lungo termine
Figura 1 descrive la strategia di gating per l'analisi delle cellule T in vari organi. L'anticorpo anti-CD45 è stato iniettato 5 minuti prima del prelievo del tessuto per escludere le cellule intravascolari dall'analisi. Sono state incluse solo le cellule TCRβ+ CD4+ Thy1.1+, indicative di una trasduzione riuscita. Per ciascun organo è stato calcolato il rapporto tra le cellule che esprimono GPCR e quelle con il vettore vuoto. Questi risultati sono stati normalizzati alla percentuale di trasduzione originale (% Thy1.1+) del pool di cellule in ingresso.

Dopo l'iniezione nei topi riceventi, le cellule trasdotte con GPR25 hanno popolato preferenzialmente i tessuti mucosi non intestinali (NIMT) come il tratto genito-urinario (GU), lo stomaco e gli organi tracheali ricchi di GPR25LG (Figura 3). I nostri studi hanno rivelato un arricchimento significativo delle cellule trasdotte da GPR25 in isolati polmonari interi a 7 settimane ma non a 1 settimana dopo l'iniezione, suggerendo una potenziale maturazione o riposizionamento all'interno del polmone nel tempo (Figura 3). Questi risultati evidenziano l'importanza di selezionare una lunghezza di studio appropriata.

Homing a breve termine
Per studiare la localizzazione in vivo di GPR25 e il suo ruolo nell'homing dal flusso sanguigno al NIMT, abbiamo condotto saggi di homing a breve termine. Le cellule T trasdotte con GPR25 sono state co-iniettate con cellule trasdotte da vettori di controllo e analizzate 10-12 ore dopo il trasferimento endovenoso in topi wild-type (WT) e CXCL17-/- (Figura 4). L'anti-CD31 è stato somministrato 20 minuti prima del sacrificio per distinguere le cellule intravascolari da quelle stravasate. Nei riceventi di WT, l'espressione di GPR25 ha conferito un vantaggio di homing agli organi ricchi di CXCL17, come la trachea, lo stomaco, la lingua, la cistifellea e le mucose uterine, ma non all'intestino, ai linfonodi o alla milza dove CXCL17 non è espresso (Figura 4A-C). È interessante notare che l'imaging confocale e la quantificazione hanno mostrato che le cellule T trasdotte da GPR25 non erano arricchite solo tra le cellule stravasate, ma anche tra le cellule ancora attaccate all'endotelio vascolare all'interno di NIMT, suggerendo che la via contribuisce all'arresto iniziale sull'endotelio, nonché all'ingresso nei tessuti bersaglio e alla migrazione verso l'epitelio della mucosa. Il vantaggio delle cellule T trasdotte da GPR25 rispetto alle cellule trasdotte da stuffer è stato abolito quando iniettate in riceventi CXCL17-/-.

All'interno dell'interstizio peribroncovascolare del polmone, le cellule trasdotte da GPR25 erano localizzate prevalentemente nei bronchi, mentre le cellule di controllo si trovavano più frequentemente vicino alle vene (Figura 4D). Questo modello suggerisce il riposizionamento delle cellule GPR25-dipendente dai siti venosi alla sottomucosa bronchiale. Tuttavia, le cellule trasdotte da GPR25 non hanno mostrato una preferenza per i bronchioli e non sono riuscite a segregare dalle cellule di controllo nei riceventi CXCL17-/-. Questi risultati indicano che la chemioaffinità di GPR25 guida specificamente la localizzazione ai bronchi polmonari, mentre lo stravaso iniziale può essere indipendente da GPR25 e mediato da meccanismi alternativi.

La nostra tecnica ci ha permesso di concludere che l'asse GPR25-CXCL17 media specificamente il reclutamento dei linfociti nelle vie respiratorie, gastrointestinali superiori, biliari e genito-urinarie. Il protocollo qui descritto ha definito il ruolo di GPR25 nell'homing tessuto-specifico, contribuendo a una comprensione più profonda di come questo recettore precedentemente orfano influenzi la localizzazione delle cellule T all'interno di microambienti tissutali distinti.

Figura 1: Strategia di gating rappresentativa. Grafico FACS che mostra la strategia di gating utilizzata per gli esperimenti di trasduzione delle cellule T di topo, in particolare per lo studio di homing a lungo termine (esempio polmonare). La colorazione CD45-PE e Thy1.1 iniettate per via endovenosa sono state utilizzate per escludere le cellule intravascolari e analizzare in modo specifico le cellule trasdotte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Chemiotassi di cellule trasdotte per verificarne la funzione. Le cellule trasdotte da mGPR25, ma non le controparti vuote trasdotte da vettori, effettuano una robusta chemiotassi verso CXCL17 di topo e umano in vitro in saggi di migrazione basati su transwell. I risultati sono presentati come media ± SEM da almeno due esperimenti indipendenti. P < 0,0001 rispetto a nessun controllo delle chemochine (test t a due code). Questa cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati FACS per l'homing a lungo termine. Rapporto tra le cellule trasdotte da GPR25 e quelle trasdotte da vettore di controllo nei tessuti 1 e 7 settimane dopo l'iniezione in topi Rag1-/-. Le cellule GPR25 e di controllo sono state distinte in base all'allotipo CD45.1 rispetto a CD45.2, commutate in diversi esperimenti, analizzate mediante citometria a flusso e normalizzate in base ai rapporti di input. I risultati raccolti da tre esperimenti indipendenti (2-3 topi per esperimento) sono mostrati come media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (test T a due code). N/D indica un basso recupero cellulare per l'analisi. Questa cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati dell'imaging confocale dall'homing a breve termine. (A) Rapporto tra GPR25 e cellule di controllo del donatore 10-12 ore dopo l'iniezione, determinato mediante microscopia confocale di interi tessuti montati o sezioni congelate. I rapporti nella milza di controllo sono stati determinati mediante citometria a flusso. Valori P derivati dal test esatto di Fisher che confronta la conta cellulare nei tessuti bersaglio indicati rispetto alla milza nei riceventi WT (+) o confronta la conta nei tessuti bersaglio nei riceventi CXCL17-/- rispetto ai riceventi WT (*). Conta cellulare aggregata da 1 (cistifellea) o 2-4 esperimenti indipendenti con un topo per condizione ed esperimento. Vengono mostrati i rapporti medi. (B-D) Immagini rappresentative delle sezioni trasversali della trachea (B), PLN (C) e del polmone (D) 10 ore dopo l'iniezione, che mostrano le cellule T CD4 GPR25 (verde) e di controllo (rosso). Le punte di freccia in (D) indicano le cellule GPR25 localizzate al bronco (Br); gli asterischi indicano le cellule vicino alle vene (V). (E) Il rapporto tra GPR25 e cellule di controllo del donatore all'interno dei microambienti polmonari indicati: Bronchi: entro 30 μm dalla membrana basale bronchiale. Vena: entro 30 μm o a contatto con l'endotelio venoso. Alveoli: all'interno di spazi alveolari non adiacenti a vene o bronchi. Ogni punto è il rapporto all'interno di 2-4 campi 10x indipendenti per WT e CXCL17, che rappresenta ~ 4 mm². I rapporti della milza sono stati duplicati da (B) per il confronto. I risultati mostrano 3 esperimenti indipendenti con 1-2 topi per esperimento e mostrati come media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 vs milza; WT vs CXCL17-/- (t-test a due code). Questa cifra è stata modificata da¹³. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il saggio di homing controllato internamente descritto in questo studio è un metodo completo per esaminare il traffico e il posizionamento delle cellule T mediate da GPCR all'interno di diversi organi e microambienti tissutali. Questo approccio integra diverse ottimizzazioni critiche per migliorare la riproducibilità, l'accuratezza e l'efficienza.

Un aspetto critico di questo protocollo è l'efficiente trasduzione delle cellule T utilizzando vettori retrovirali MSCV, che è facilitata dall'uso di cellule Plat-E per la produzione virale. Le ottimizzazioni chiave includono il mantenimento delle cellule Plat-E a una confluenza appropriata, l'utilizzo di piastre rivestite di poli-D-lisina per migliorare la trasfezione virale e l'impiego di una strategia di doppia trasduzione per massimizzare l'espressione di GPCR. Poiché i vettori MSCV richiedono una divisione cellulare attiva per un'efficace integrazione del genoma, indurre l'ingresso nel ciclo cellulare attraverso l'attivazione delle cellule T migliora significativamente l'efficienza della trasduzione retrovirale. Alte concentrazioni di anticorpi anti-CD3 e CD28 sono fondamentali per garantire l'attivazione e l'esplosione delle cellule T, che i nostri studi hanno scoperto essere più efficaci rispetto a concentrazioni più basse riportate altrove¹⁴. Abbiamo anche scoperto che l'inclusione delle citochine IL-2 e IL-7 nel terreno di coltura è vitale per mantenere la vitalità delle cellule T e promuovere la loro espansione, garantendo una robusta popolazione di cellule T sane e trasdotte, necessarie per studi accurati sulla migrazione e l'homing.

Oltre a ottimizzare la trasduzione retrovirale, il protocollo consente studi di homing a lungo termine utilizzando marcatori CD45.1/CD45.2 per differenziare tra cellule trasdotte da GPCR e cellule di controllo in esperimenti competitivi all'interno dello stesso ospite. Questo approccio garantisce che le cellule siano esposte agli stessi segnali fisiologici. L'inclusione del marcatore Thy1.1 è preziosa per distinguere tra cellule T trasdotte e non trasdotte, in particolare quando non sono disponibili anticorpi specifici per i GPCR orfani. Un'alternativa adatta ad alcune applicazioni sarebbe l'utilizzo di proteine fluorescenti al posto della cassetta Thy1.1.

Per le analisi delle cellule homed mediante FACS, il protocollo impiega anticorpi anti-CD45 iniettati 5 minuti prima del prelievo del tessuto per distinguere tra cellule circolanti e residenti nel tessuto, prevenendo un'interpretazione errata dei dati di homing. Per la microscopia confocale, gli anticorpi anti-CD31 sono stati iniettati 10-30 minuti prima del sacrificio per marcare i vasi sanguigni, consentendo una visualizzazione precisa della localizzazione delle cellule T e la distinzione tra cellule attaccate all'endotelio vascolare e cellule stravasate. L'analisi delle immagini con il software Imaris quantifica la distanza delle cellule dai punti di riferimento istologici, fornendo informazioni dettagliate sulla loro localizzazione e interazioni microambientali.

Il punto di forza di questo protocollo è il confronto fianco a fianco del comportamento di cellule altrimenti identiche che differiscono solo nell'espressione del recettore trasdotto. Sebbene usiamo il termine convenzionale homing competitivo per descrivere la co-iniezione e il successivo homing di cellule di controllo e di confronto, riconosciamo che questo termine è tecnicamente un termine improprio. Nei saggi a breve termine, i meccanismi di reclutamento tissutale sono probabilmente in eccesso, rendendo improbabile l'effettiva competizione tra le popolazioni cellulari. Un termine più preciso sarebbe homing comparativo o homing controllato internamente, poiché il protocollo valuta i comportamenti di homing in modo controllato e comparativo. Inoltre, la migrazione fisiologica e l'homing possono coinvolgere contributi integrati di più recettori chemioattrattivi, che possono agire simultaneamente o sequenzialmente per dirigere la migrazione cellulare in più fasi nei complessi campi di attrattivi esistenti in vivo¹⁵. Le cellule T attivate in vitro nelle condizioni che impieghiamo esprimono spontaneamente CXCR3 e probabilmente altri GPCR, che, attraverso il coordinamento con il recettore trasdotto, possono influenzare la localizzazione finale delle cellule. La trasduzione retrovirale provoca tipicamente una sovraespressione del gene bersaglio e si deve considerare che il livello di espressione del recettore potrebbe anche influenzare l'homing. Inoltre, la sovraespressione di un recettore potrebbe teoricamente alterare le proprietà cellulari indipendentemente dalle interazioni recettore-ligando. Per risolvere questo problema, abbiamo condotto un'espressione complementare utilizzando topi CXCL17-/-, che mancano del ligando per GPR25. Questo approccio aiuta a garantire che i nostri effetti osservati siano mediati dal riconoscimento del ligando affine. I ricercatori che non hanno accesso a specifici ceppi knockout potrebbero incorporare tecniche shRNA o CRISPR per abbattere o eliminare specifici GPCR nelle cellule T. Questo adattamento potrebbe migliorare ulteriormente la versatilità del protocollo per lo studio della funzione GPCR nelle cellule T.

Sebbene la trasduzione retrovirale offra un'elevata efficienza, richiede la divisione attiva delle cellule, che potrebbero non riflettere accuratamente il comportamento delle cellule quiescenti. Alcuni recettori delle chemochine mostrano un'attività differenziale a seconda dello stato proliferativo della cellula, sebbene la loro specificità rimanga invariata. Un metodo alternativo, l'elettroporazione al neon, ha dimostrato un'elevata efficienza di trasfezione nelle cellule T, anche se transitoriamente¹⁶. Questo può essere sufficiente per i saggi a breve termine, mentre l'MSCV può produrre un'espressione stabile, il che lo rende adatto sia per studi a breve che a lungo termine. Tuttavia, non siamo riusciti a trovare letteratura che indichi che questo sistema sia stato utilizzato per gli studi di homing. Se l'efficienza di trasfezione è bassa, potrebbe essere necessario selezionare le cellule utilizzando un marcatore visibile, come la co-trasfezione con GFP.

Questo protocollo fornisce un'istantanea statica del traffico cellulare, limitando le informazioni sul comportamento e la motilità cellulare in tempo reale. Ha anche limiti di risoluzione intrinseci, in particolare per l'osservazione delle strutture subcellulari e dell'architettura tissutale su scala fine. Per affrontare queste sfide, proponiamo l'uso di tecniche di imaging avanzate come la microscopia multifotone, l'imaging di cellule vive e la microscopia intravitale. Questi metodi offrono una risoluzione spaziale più elevata, una penetrazione più profonda nei tessuti e la capacità di visualizzare dinamicamente i processi cellulari. La microscopia intravitale, in particolare, consente il monitoraggio in tempo reale del comportamento delle cellule T in vivo, consentendo l'osservazione della migrazione cellulare, delle interazioni e delle risposte agli stimoli all'interno del loro contesto nativo. Questo approccio è particolarmente potente per valutare l'homing delle cellule T e la localizzazione dei tessuti, rivelando come le cellule si adattano dinamicamente a diversi microambienti. Integrando queste tecniche di imaging avanzate, gli studi futuri possono ottenere una comprensione più completa della motilità delle cellule T, delle interazioni e dell'homing mediato da GPCR, migliorando significativamente le informazioni sul loro comportamento all'interno dei tessuti.

Il protocollo che forniamo aiuterà a studiare le funzioni dei GPCR nell'homing delle cellule immunitarie e ha ampie applicazioni nell'immunoterapia, nell'infiammazione e nell'autoimmunità. Inoltre, offre nuove opportunità per scoprire bersagli terapeutici e migliorare le risposte immunitarie esplorando GPCR precedentemente non caratterizzati nel cancro delle cellule T e affrontando l'homing inappropriato delle cellule T nelle malattie autoimmuni.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Supportato dalle sovvenzioni NIH R01 AI178113 e R01 AI047822, dalla sovvenzione 1903-03787 da The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust e dalle sovvenzioni del Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) T31IP1880 e T33IR6609 all'ECB; Y.B. è stato sostenuto da un Research Fellows Award della Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Fondazione Ramon Areces (Madrid, Spagna) e da un Research Fellows Award della Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). A.A. è stato supportato dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) - EDUC2-12677.