Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

Questo protocollo, destinato agli utenti inesperti del tessuto dell'orecchio interno del topo, descrive in dettaglio i passaggi per l'elaborazione dell'orecchio interno del topo in diverse fasi di sviluppo per l'immunocolorazione della sezione.

Questo protocollo descrive in dettaglio i metodi istologici generali per la preparazione di campioni dell'orecchio interno da topi embrionali, neonatali e adulti. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e standardizzato per il processamento del tessuto dell'orecchio interno per i ricercatori, possibilmente nuovi nel campo, interessati a lavorare con la coclea di topo. Qui sono inclusi i protocolli per la dissezione, la fissazione, l'inclusione, la criosezione e l'immunocolorazione. L'immunocolorazione a sezione è uno dei metodi migliori per esaminare le singole cellule nel contesto dell'intera coclea.

I passaggi chiave includono la dissezione dell'orecchio interno lontano dal cranio, il fissaggio del tessuto con paraformaldeide al 4%, l'inclusione con il composto Optimal Cutting Temperature, la criosezione e l'immunocolorazione con anticorpi mirati a proteine specifiche espresse dalla coclea.

I nostri metodi includono considerazioni speciali per la coclea data la sua
forma e struttura. Sono necessarie una messa a fuoco e capacità di dissezione ragionevolmente buone, poiché il danno tissutale può influire sulla qualità dell'immunocolorazione e sulla coerenza tra i campioni. Tuttavia, con le procedure che descriviamo, la maggior parte degli utenti può essere addestrata in poche settimane a realizzare bellissimi preparativi. Nel complesso, questo protocollo offre un modo prezioso per promuovere la ricerca per comprendere lo sviluppo uditivo, la funzione e la malattia nei modelli murini.

Comprendere lo sviluppo e la funzione uditiva è fondamentale per caratterizzare e affrontare le diverse forme di perdita dell'udito. I fattori di rischio per la perdita dell'udito sono molti e includono il diabete ^1,2, l'ipertensione ^3,4,5, le malattie autoimmuni ^6,7, la meningite batterica ^8,9 e diversi disturbi neurodegenerativi 10,11,12,13. Inoltre, alcuni farmaci, come alcuni antibiotici e farmaci chemioterapici, possono anche avere un impatto negativo sull'udito¹⁴. Al di là delle sfide immediate della compromissione uditiva, la perdita dell'udito può avere un impatto negativo sulla funzione cognitiva e aumentare l'ansia e lo stress, che possono essere correlati al deterioramento cognitivo e al declino della salute mentale 11,15,16. Pubblicando questo protocollo, miriamo ad alleviare qualsiasi barriera all'ingresso nella ricerca uditiva, in particolare per coloro che non hanno precedenti esperienze di lavoro con la coclea. Questa guida spiega come preparare campioni di orecchio interno da topi embrionali, giovani (neonatali) e adulti. Lo scopo di questo protocollo è fornire un approccio diretto all'elaborazione del tessuto dell'orecchio interno, garantendo la riproducibilità e la coerenza tra gli esperimenti. L'immunocolorazione a sezione è uno dei metodi migliori per esaminare diversi tipi di cellule nel contesto dell'intera coclea; In altre circostanze, l'immunocolorazione a montatura intera può essere più vantaggiosa (ad esempio, esaminando la morfologia delle stereociglia delle cellule ciliate o la localizzazione delle proteine).

La logica di ciò deriva dalle sfide che si incontrano lavorando con la coclea di topo. Le sue dimensioni ridotte, la bobina unica e la struttura delicata¹⁷ richiedono tecniche specializzate per la dissezione, la fissazione, l'inclusione, la criosezione e l'immunocolorazione accurate. La forma a spirale della coclea significa che l'inclusione richiede un'attenta attenzione all'orientamento per garantire che ogni giro della coclea sia preservato, il che è fondamentale per ottenere sezioni coerenti. Inoltre, man mano che la coclea matura, subisce l'ossificazione¹⁸, il che significa che si trasforma gradualmente in osso, il che può complicare la conservazione dei tessuti e richiedere la decalcificazione. L'immunocolorazione per criosezione offre diversi vantaggi rispetto alle preparazioni alternative (come l'immunocolorazione a montaggio intero). I principali vantaggi della criosezione sono la conservazione generale delle proteine e degli acidi nucleici e le sezioni relativamente sottili, ~2D, consentono misurazioni coerenti e precise. Inoltre, consente di conservare e visualizzare tutti i tipi di cellule cocleari e può migliorare la qualità dell'immunocolorazione. A differenza di molte preparazioni cocleari a montaggio intero, la criosezione preserva strutture tra cui il legamento spirale, la stria vascolare, la membrana di Reissner e la membrana tectoriale. Vedere le seguenti pubblicazioni precedenti per esempi di immunocolorazione di sezione di alta qualità delle orecchie interne embrionali 19,20,21,^neonatali 22,23,24 e adulte^25,26.

NOTA: Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Georgetown University. Tutti i topi in questo studio sono stati mantenuti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Georgetown University (protocollo #1147). Nella prima settimana postnatale, poiché le strutture ossee temporali non sono completamente sviluppate, la decalcificazione non è necessaria. Tuttavia, le coclee di topi di età pari o superiore a P6 richiedono la decalcificazione e un diverso metodo di dissezione. Nel nostro protocollo, sono stati utilizzati topi maschi e femmine NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) e a E16.5, P0 e P30. Per ogni sezione, annotiamo tra parentesi quanto tempo ci si aspetta che ogni passo richieda per i principianti. Molti dei passaggi diventeranno più veloci con la pratica.

1. Raccolta di campioni embrionali e giovanili dell'orecchio interno (~75 min)

1. Eutanasia e decapitazione dei topi in conformità con un protocollo di studio animale approvato.
2. Utilizzando le forbici da dissezione fine, praticare con cura un'incisione sulla linea mediana lungo il cuoio capelluto, partendo dal collo ed estendendosi verso il muso, spingendo la pelle lateralmente (primo taglio).
3. Posizionare la lama inferiore della forbice sul forame magno e la lama superiore della forbice sul cranio. Tagliare la metà superiore del cranio fino al naso (secondo taglio).
4. Estrarre le forbici dalla testa parzialmente incisa, quindi posizionare la lama inferiore delle forbici nella parte inferiore del cranio e l'estremità superiore delle forbici nel forame magno. Tagliare la metà inferiore della testa fino al naso (terzo taglio).
   NOTA: È importante che le lame delle forbici taglino la linea mediana e taglino facilmente con poco sforzo. Ciò assicurerà che le lame delle forbici taglino proprio tra l'orecchio interno sinistro e destro.
5. A questo punto, la testa del topo è divisa a metà lungo l'asse rostrale-caudale. Usando pinze sottili e forbici, stacca con cura tutti i tessuti molli che circondano l'osso temporale, come cervello, muscoli e tessuto connettivo. Evitare di danneggiare l'osso o le strutture circostanti.
6. Posizionare le mezze teste di topo nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1x PBS a temperatura ambiente. Una volta che ogni testa è stata processata, sostituire 1x soluzione di PBS con una soluzione di PFA al 4% (per il fissaggio) e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente (tipicamente 20 °C).
   NOTA: Il tempo di fissazione può variare a seconda delle proteine che devono essere rilevate e/o dell'efficacia di legame dei diversi anticorpi.
7. Dopo 45 minuti, risciacquare il fazzoletto per 3 x 5-10 minuti con 1x PBS.
8. Conservare i campioni in 1x PBS a 4 °C o passare alla fase successiva e sezionarli. Per la conservazione a lungo termine, conservare in 1x PBS contenente lo 0,1% di sodio azide a 4 °C.
9. Smaltire il tessuto di topo rimanente secondo le linee guida dell'istituto per il rischio biologico/smaltimento dei tessuti.

2. Dissezione di campioni dell'orecchio interno embrionale e giovanile (3 - 5 minuti per campione)

1. Individuare l'osso temporale/capsula auricolare interna all'interno della semitesta del topo. Occupa la stessa posizione dell'orecchio esterno ma si trova all'interno dell'osso del cranio. Usando una pinza sottile, staccare con cura i tessuti molli che circondano la capsula dell'orecchio interno. Una volta allentata la capsula dell'orecchio interno, inizia a tagliare il tessuto attorno alla capsula dell'orecchio interno.
2. Una volta che la capsula dell'orecchio interno è stata per lo più liberata dal tessuto cranico, applicare delicatamente una pressione sull'area circostante della capsula dell'orecchio interno usando una pinza per liberarla completamente.
   NOTA: Applicare una pressione graduale per allentare la capsula auricolare interna dagli attacchi circostanti. Evitare di danneggiare la capsula auricolare interna. Poiché l'orecchio interno in via di sviluppo precoce è piuttosto morbido, evita di entrare in contatto diretto con il forcipe.
3. Conservare i campioni dell'orecchio interno come al punto 1.8 ed eliminare eventuali detriti rimanenti dal tessuto della testa fissato.

3. Raccolta e dissezione di campioni per l'orecchio interno adulto (~75 min + 2 - 3 giorni di trattamento EDTA)

1. Eutanasia e decapitazione dei topi secondo un protocollo di studio animale approvato.
2. Usando le forbici da dissezione affilate, praticare con cura un'incisione sulla linea mediana lungo il cuoio capelluto, partendo dal collo ed estendendosi verso il muso. Ripiegare la pelle per esporre il teschio (primo taglio).
3. Posizionare la lama inferiore della forbice sul forame magno e la lama superiore della forbice sul cranio. Tagliare la metà superiore del cranio fino al naso (secondo taglio).
   NOTA: Durante questo passaggio, noterai un moderato "scricchiolio" delle lame delle forbici; Questo è normale.
4. Estrarre le forbici dalla testa parzialmente incisa, quindi posizionare la lama della forbice inferiore nella parte inferiore del cranio e la lama della forbice superiore nel forame magno. Taglia la metà inferiore della testa fino al naso (terzo taglio), facendo attenzione ad andare proprio lungo la linea mediana per assicurarti che le lame manchino le orecchie interne.
   NOTA: Non forzare le forbici attraverso il fazzoletto; Questo potrebbe indicare che le lame colpiscono una delle orecchie interne.
5. Per ogni mezza testa, usando pinze e forbici, staccare tutti i tessuti molli che circondano l'osso temporale, come il cervello, i muscoli e il tessuto connettivo.
   NOTA: Prestare attenzione per evitare di danneggiare l'osso temporale o le strutture circostanti.
6. Con il tessuto circostante pulito, "arriccia al contrario" il tessuto del cranio con le dita e usa un pollice per applicare delicatamente pressione sulla parte inferiore dell'osso temporale. Applicare una pressione graduale mentre si allenta l'osso dagli attacchi circostanti.
   NOTA: Quando viene applicata la pressione, la capsula dell'orecchio interno si separa gradualmente dalle ossa circostanti del cranio. Con una manipolazione delicata, l'osso dovrebbe fuoriuscire in modo relativamente facile.
7. Una volta rimossa la capsula auricolare interna, sciacquarla con 1x PBS.
8. Riempi un piatto silgardo con il 4% di PFA e mettilo sotto il microscopio. Metti un singolo orecchio interno estratto nel piatto sylgard.
9. Esaminare l'orecchio interno alla ricerca di eventuali tessuti molli o ossa attaccati e rimuoverli delicatamente.
10. Trova la finestra ovale e rimuovi delicatamente la staffa con una pinza.
11. Trova la finestra rotonda e fai un piccolo foro per assicurarti che nessun tessuto circostante la ostruisca.
12. Aprire un piccolo foro all'apice con una pinza fine. Sciacquare la coclea con una pipetta P20 riempita con PFA al 4% per fissarla. Assicurati di visualizzare il fluido (sangue diluito, endolinfa/perilinfa) che esce dalla finestra ovale.
13. Posizionare la coclea fissa in una piastra a 24 pozzetti riempita con PFA al 4%. Segna il tempo. Incubare 30-60 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione (bilanciere o nutatore), quindi sciacquare il campione per 3 x 5-10 minuti con 1 soluzione di PBS.
14. Dopo l'ultimo risciacquo, posizionare il fazzoletto in EDTA da 1,25 mM e lasciarlo oscillare per 2-3 giorni a 4 °C.
15. Smaltire il tessuto di topo rimanente in modo appropriato secondo le linee guida dell'istituto per il rischio biologico/smaltimento dei tessuti.
16. Dopo il trattamento EDTA, risciacquare il fazzoletto per 3 x 5 minuti con 1x PBS.
17. Conservare i campioni in 1x PBS a 4 °C o passare alla fase successiva e sezionarli. Per la conservazione a lungo termine, conservare i campioni in 1x PBS contenente lo 0,1% di sodio azide a 4 °C.

4. Preparazione del campione dell'orecchio interno per la criosezione (~24 h)

1. Posizionare la capsula auricolare interna sezionata in saccarosio al 10% (in 1x PBS) e lasciarla incubare a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore.
   NOTA: Quando i campioni si sono completamente equilibrati, affonderanno sul fondo del tubo.
2. Scartare la soluzione di saccarosio al 10%, aggiungere il 20% di saccarosio in 1x PBS e lasciare altre 2 ore di incubazione a temperatura ambiente.
3. Scartare la soluzione di saccarosio al 20%, aggiungere il 30% di saccarosio in 1x PBS e incubare a 4 °C per una notte (minimo).
   NOTA: Questo passaggio può essere ridotto a 2 ore, ma l'incubazione notturna produce i migliori risultati. Il tessuto può essere lasciato in qualsiasi percentuale di saccarosio per un periodo di tempo prolungato.
   1. Estrarre metà della soluzione di saccarosio al 30% e riempire lo spazio con il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT). Lasciarlo oscillare per un minimo di 30 minuti e un massimo di 2 ore.
      NOTA: Lasciare i campioni nell'OCT per un periodo di tempo prolungato causerà il restringimento del tessuto.
4. Trasferire i campioni in criostampi etichettati riempiti con OCT.
5. Controllare l'orientamento cocleare al microscopio nel crioblocco incorporato. Per le sezioni trasversali cocleari "standard", verificare che il lato concavo dell'orecchio interno sia rivolto verso i lati stretti del criostampo.
6. Mettere il ghiaccio secco in un piccolo contenitore e aggiungere 5-10 ml di etanolo o dimetilbutano. Posiziona i criostampi + OCT + campione su ghiaccio secco gorgogliante per congelare rapidamente il blocco.
7. Conservare i campioni a -80 °C.

5. Sezionamento delle orecchie interne (~25 min per campione)

1. Trasferire i crioblocchi nella camera di un criostato preraffreddato a -20 °C. Lasciare che i campioni si equilibrino per 30-60 minuti.
2. Usando una matita, segnare il lato del crioblocco che corrisponde alla posizione cocleare per garantire il corretto orientamento per il sezionamento.
3. Aggiungere una piccola pozza di OCT al mandrino e posizionare il crioblocco su di esso, con il lato largo (senza il segno della matita) rivolto verso il basso.
4. Posizionare il mandrino + OCT + campione nella camera del criostato raffreddata, lasciando che l'OCT si congeli completamente. Dopo alcuni minuti, posizionare il mandrino + campione sul supporto del mandrino con il segno della matita rivolto a destra o a sinistra.
5. Tagliare il blocco fino a quando il tessuto è evidente (utilizzare 40 μm come impostazione di taglio).
6. Una volta che il tessuto è evidente, prelevare una sezione di 12 μm con vetrini progettati per la criosezione e controllare la posizione di sezionamento al microscopio.
7. Se ci si avvicina a curve cocleari, prelevare sezioni da 12 μm, controllando la posizione di tanto in tanto, fino a superare tutte le curve.
   NOTA: Il numero di sezioni per diapositiva può variare, ma in genere otteniamo 8-10 sezioni per diapositiva e circa 6 vetrini per coclea.
8. Conservare i vetrini a -80 °C.

6. Immunocolorazione della sezione (~1 - 3 giorni)

1. Togliere i vetrini dal congelatore a -80 °C e lasciarli asciugare all'aria per circa 10 minuti.
2. Usando una matita, etichettare i vetrini con gli anticorpi che verranno utilizzati.
3. Tracciare i bordi utilizzando un pennarello idrofobico (ad esempio, Hydrophobic Barrier Perossidasi-Antiperossidasi Pen (PAP)).
4. Reidratare i campioni in 1x PBS per 5 minuti.
5. Scartare 1x PBS dai vetrini e aggiungere 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (0,1% PBSTx) ai vetrini per 20 minuti per permeabilizzare.
6. Rimuovere lo 0,1% di PBSTx dal vetrino e aggiungere 200 μl della soluzione bloccante per un'incubazione di 1-2 ore a temperatura ambiente.
   NOTA: Il blocco è un passaggio cruciale nelle tecniche di immunocolorazione come l'immunoistochimica e l'immunofluorescenza, in cui impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai tessuti o alle cellule. Per ulteriori informazioni, consultare la guida di Lewis alla selezione dei reagenti di controllo e di blocco²⁷. Una soluzione bloccante comunemente usata è il 10% di siero d'asino normale allo 0,5% in PBSTx, ma questo vale solo quando vengono utilizzati anticorpi secondari derivati dall'asino.
7. Effettuare un rapido risciacquo con 1x PBS, aggiungere 200 μL di soluzione di anticorpi primari composta da 0,5% di PBSTx e incubare per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Per gli anticorpi primari mostrati nella Figura 1, utilizzare le seguenti diluizioni: 1:200 per Plexin-B1, 1:200 per Sox2, 1:1.000 ciascuno per Tuj1, Myo6 e Myo7A (vedere anche l'elenco dei materiali).
   NOTA: Ogni anticorpo primario si comporta in modo diverso a seconda delle sue caratteristiche di legame con l'epitopo e della capacità di penetrare i campioni di tessuto.
8. Dopo il trattamento con anticorpi primari, risciacquare per 4 x 30 minuti in PBSTx, aggiungere 200 μL di soluzione di anticorpi secondari composta da PBSTx allo 0,5% (Elenco dei materiali) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   NOTA: A volte può essere utile far girare le soluzioni di anticorpi secondari alla massima velocità a 4 °C per 30 minuti per eliminare eventuali precipitati indesiderati. Se le soluzioni secondarie sono state centrifugate, evitare di toccare il fondo della provetta con il puntale della pipetta.
9. Risciacquare per 4 x 30 minuti in PBSTx (o risciacquare durante la notte), quindi montare le diapositive utilizzando un mezzo di montaggio che aiuti a prevenire il fotosbiancamento (ad es. Fluoromount).
10. Aggiungere un vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate con uno spessore appropriato per la configurazione di imaging (ad esempio, n. 1 vetrino coprioggetti, che hanno uno spessore di 0,13-0,16 mm).

Presentiamo esempi dal nostro laboratorio dell'apice e del giro basale di una coclea di topo embrionale del giorno 16,5 (E16,5) e del giro basale dal giorno postnatale 0 (P0) e delle coclee P30. Questi campioni sono stati sezionati e immunocolorati utilizzando marcatori per cellule ciliate (Myo7A e Myo6), neuroni gangliari spirali (SGN; Tuj1), glia e cellule di supporto (Sox2) e Plexin-B1, che etichetta la membrana basale attorno al dotto cocleare e agli SGN. Le sezioni trasversali della...

Ci sono diversi passaggi chiave per il successo della criosezione e dell'immunocolorazione. La corretta fissazione del tessuto cocleare è essenziale e anche la durata della fissazione è importante, che può variare a seconda dell'anticorpo. Mentre la maggior parte degli anticorpi funziona meglio con un tempo di fissazione più breve, come 45 minuti in PFA, alcuni epitopi bersaglio possono tollerare la fissazione notturna. Sulla base della nostra esperienza, una fissazione di 45 minuti ...

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

M.A.D. e T.M.C. sono stati supportati dalle sovvenzioni NIH 5R01DC016595-07 (a T.M.C.) e 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Le micrografie di esempio nella Figura 1A-H sono state generate dal Dr. Kaidi Zhang.