In vitro Monitoraggio del pH extracellulare in tempo reale

Questo articolo rappresenta un utile test in vitro per misurare le variazioni del pH extracellulare durante la migrazione transepiteliale (TEM) dei neutrofili (PMN)

L'accumulo precoce di neutrofili (PMN) è un segno distintivo dell'infiammazione intestinale acuta. Questa infiammazione acuta si risolve o progredisce in infiammazione cronica. Senza un'efficiente eliminazione del PMN nei siti di infiltrazione, il PMN può accumularsi e contribuire a condizioni infiammatorie croniche, tra cui le malattie intestinali colite ulcerosa (CU) e il morbo di Crohn (CD). Il pH nel colon distale negli individui con CU attiva può variare tra un pH di 5 e 6, mentre gli individui sani mantengono il pH del colon nell'intervallo 6,8-7,4. È stato dimostrato che il pH extracellulare influenza sia le cellule epiteliali intestinali che le cellule immunitarie infiltranti. Più specificamente, l'acidosi extracellulare ha un impatto significativo sulla PMN. A pH inferiore a 6,5, si verifica un aumento della produzione di H₂O₂, l'inibizione dell'apoptosi e un aumento della durata funzionale del PMN. Data la significativa presenza di PMN e acidificazione extracellulare nei siti di infiammazione, abbiamo sviluppato un nuovo modello che consente il monitoraggio del pH extracellulare durante la migrazione transepiteliale del PMN in tempo reale. Qui, descriviamo questo modello e come può essere utilizzato per misurare il pH apicale e basale durante il traffico di PMN. Questo modello può essere utilizzato per monitorare il pH extracellulare in un'ampia gamma di condizioni; tra cui, ipossia, migrazione transepiteliale PMN e per lunghi periodi di tempo.

È stato dimostrato che il microambiente extracellulare svolge un ruolo significativo nella modulazione della risposta infiammatoria. Un aspetto del microambiente che viene spesso sottovalutato è l'acidificazione extracellulare. L'acidificazione extracellulare è spesso osservata nei siti di infiammazione attiva, compresi i disturbi della mucosa come le malattie infiammatorie intestinali. Il pH luminale nel colon distale dei pazienti con CU può variare tra un pH di 5 e 6, mentre gli individui sani hanno un pH del colon compreso tra 6,8 e 7,4 ^1,2. Questa diminuzione del pH del colon è di particolare interesse perché è stato dimostrato che il pH extracellulare influenza ampiamente la IEC e la funzione delle cellule immunitarie infiltranti. È stato dimostrato che i microambienti acidi, ad esempio, prolungano la vita funzionale delle uova di PMN infiltranti, stimolano la produzione di H₂O₂ e inibiscono l'apoptosi PMN ^3,4. L'esatto meccanismo con cui l'ambiente extracellulare diventa acido rimane poco chiaro, evidenziando la necessità di sviluppare tecniche per studiare l'acidificazione nel tempo.

In un recente studio, è stato dimostrato che il PMN TEM provoca una significativa acidificazione del microambiente e che l'IEC risponde rapidamente a questa acidificazione attraverso la sovraregolazione adattativa del SLC26A3, il principale trasportatore cloruro-HCO₃ nel tessuto mucoso ^5,6, promuovendo così l'omeostasi del pH⁷. L'esatto meccanismo o i meccanismi con cui PMN TEM induce l'acidificazione extracellulare rimangono poco chiari. Attualmente si ritiene che l'acidificazione dei tessuti sia causata da un aumento dell'accumulo di acido lattico derivante dall'aumento della glicolisi ed è stato recentemente osservato che il PMN TEM stimola il rilascio di lattato da IEC ^7,8. Tuttavia, i livelli di lattato secreto non spiegano completamente l'acidificazione osservata durante il PMN TEM. Una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nell'acidificazione extracellulare consentirà la potenziale identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Per comprendere meglio il meccanismo coinvolto, è necessario un sistema che consenta il monitoraggio del pH per un periodo di tempo prolungato, consentendo al contempo la trasmigrazione del PMN nella direzione apicale e basale fisiologicamente rilevante. L'uso di una sonda di pH richiede molto tempo e la manipolazione ripetuta del sistema di coltura. Attualmente, esistono diverse tecniche non invasive per monitorare il pH nel tempo. Un test comunemente usato utilizza la 2',7'-bis(2-carbossietil)-5,6-carbossifluoresceina (BCECF), un colorante che viene internalizzato dalla cellula, tuttavia questo test è limitato allo studio del pH ⁹ interno. Esistono diversi saggi per pH su piastra, ma la maggior parte sono disponibili solo in un formato a 96 pozzetti o richiedono l'aggiunta di coloranti sensibili al pH. Il protocollo descritto di seguito si basa su una piastra di rilevamento del pH disponibile in commercio, progettata per il monitoraggio non invasivo del pH per un periodo di tempo prolungato¹⁰. Le cellule vengono coltivate come monostrato in una piastra a 24 pozzetti che contiene un sensore di pH pre-calibrato. Questo sensore contiene un colorante luminescente che viene eccitato da un lettore di piastre specializzato. Anche la durata della luminescenza, che dipende dal pH, viene misurata dal lettore di piastre. Tuttavia, questo modello manca di un compartimento apicale e basale, impedendo lo studio della trasmigrazione o delle differenze basali/apicali nell'acidificazione.

Viene descritto un protocollo che consente la valutazione in vitro dell'acidificazione extracellulare durante la PMN TEM, utilizzando cellule epiteliali intestinali umane T84 cresciute su inserti transwell, PMN umano e un sensore di pH a base fluorescente non invasivo. Viene fornito un esempio di successo in cui il pH extracellulare viene esaminato nel corso di 10 ore e dimostra che il PMN TMN attivo provoca l'acidificazione extracellulare. Sebbene venga presentato un esempio specifico, questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'effetto di un numero qualsiasi di fattori; tra cui, metaboliti, tipi di cellule e potenziali terapie, sul pH extracellulare.

1. Preparazione cellulare

Giorno 1

1. Terreni di coltura cellulare caldi (DMEM/F12 con il 5% di FBS, 2 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide e Pen Streptide) in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti.
2. Preparare la cappa di coltura tissutale spruzzandola con etanolo al 70% e strofinando le superfici con carta assorbente.
3. Spruzzare e pulire i flaconi e i terreni di coltura tissutale, i flaconi di PBS e tripsina con etanolo al 70% e portarli nella cappa di coltura tissutale.
4. Aspirare il terreno dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con 12 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
5. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tripsina alle cellule. Incubare a RT per 10-20 minuti, fino a quando le cellule non si staccano.
6. Aggiungere 11 mL di terreno di coltura cellulare alla tripsina e mescolare pipettando su e giù 3-5 volte.
7. Capovolgere una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti contenente inserti porosi da 5 μm e pipettare delicatamente 100 μl di sospensione cellulare sul lato inferiore dell'inserto (Figura 1).
8. Posizionare la piastra capovolta in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
   Giorno 2
9. Riscaldare i terreni di coltura cellulare in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti.
10. Preparare la cappa di coltura tissutale spruzzandola con etanolo al 70% e strofinando le superfici con carta assorbente.
11. Spruzzare e pulire i flaconi e i terreni di coltura tissutale, i flaconi di PBS e tripsina con etanolo al 70% e portarli nella cappa di coltura tissutale.
12. Raddrizzare la piastra di coltura tissutale e aggiungere delicatamente 1 mL di terreno al compartimento basale e 180 μL al compartimento apicale.
13. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
    Giorno 3-7:
14. Monitorare quotidianamente la resistenza transepiteliale (TER), utilizzando un volt/Ohmmetro epiteliale, fino a quando la TER non si è stabilizzata e le cellule hanno formato un monostrato confluente.

2. Isolamento PMN

1. Soluzioni a gradiente di temperatura ambiente, 50 mM K₂EDTA e soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza calcio/magnesio (HBSS-) a temperatura ambiente.
2. Preparare gradienti a doppia densità in provette coniche da 50 mL.
3. Rivestire una siringa da 60 mL con 6 mL di 50 mM K₂EDTA e raccogliere 54 mL di sangue dal donatore.
4. Sovrapporre 15 mL di sangue ai gradienti a doppia densità preparati sopra.
5. Centrifugare a 700 x g per 30 min a temperatura ambiente, con il freno spento.
6. Aspirare il siero, il monocita del sangue periferico, le interfasi e trasferire lo strato contenente PMN in una nuova provetta conica da 50 mL e risospendere a 50 mL in HBSS-.
7. Centrifugare a 700 x g per 10 min a temperatura ambiente.
8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 40 mL di tampone freddo per la lisi dei globuli rossi.
9. Centrifugare a 700 x g per 10 minuti a 4 °C.
10. Aspirare il surnatante e combinare i pellet di tutte le provette in 3 mL di HBSS-.
11. Determinare la concentrazione di PMN e diluire a 5x10⁴ utilizzando l'appropriato circa di HBSS-.

3. Saggio di monitoraggio del pH in vitro

1. Scaldare l'HBSS con calcio/magnesio (HBSS+) a bagnomaria a 37 °C per 20 minuti.
2. Preparare la cappa di coltura tissutale spruzzandola con etanolo al 70% e strofinando le superfici con carta assorbente.
3. Spruzzare e pulire HBSS+ con etanolo al 70% e portarli nella cappa di coltura tissutale.
4. h Prima di eseguire il test, equilibrare le piastre di rilevamento del pH aggiungendo 1 mL di HBSS+ a ciascun pozzetto e collocandole in un incubatore a 37 °C.
5. min prima del saggio, rimuovere le piastre di rilevamento del pH dall'incubatore e aggiungere 1 μM di fMLP a ciascun pozzetto.
6. Posizionare la piastra di rilevamento del pH sul lettore SDS a 37 °C e registrare il pH per stabilire una linea di base per l'esperimento.
7. Una volta stabilizzata la lettura del pH, rimuovere il terreno dagli inserti e aggiungere 180 μl di HBSS+ al pozzetto superiore.
8. Aggiungere 20 μL di HBSS+ ai pozzetti di controllo o 20 μL di PMN.
9. Rimuovere l'HBSS+ e trasferire gli inserti sulla piastra di rilevamento del pH.
10. Sul fondo, aggiungere 1 mL di HBSS+ con e senza 1 μM di fMLP.
11. Al pozzetto superiore, aggiungere 180 μL di HBSS+.
12. Al pozzetto superiore, aggiungere 20 μl di HBSS- contenente 0 o 1 x 10⁶ PMN.
13. Posizionare la piastra di rilevamento del pH sul lettore SDS a 37 °C (Figura 2).
14. Sul computer collegato, aprire il software di monitoraggio del pH e configurare il software per registrare il pH a intervalli di tempo designati (ogni 1-10 minuti).

I risultati sono solitamente tramite grafico a linee per mostrare la variazione del pH nel tempo (esempio mostrato nella Figura 3A) o come grafico a dispersione che mostra il pH extracellulare in un singolo punto nel tempo (esempio mostrato nella Figura 3B). A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere inclusi controlli e trattamenti aggiuntivi. Inoltre, questo test può essere modificato per monitorare gli extracellula...

In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave. I monostrati devono essere confluenti, ma non sovraconfluenti. Per T84 IEC, devono essere utilizzati 7-10 giorni dopo la placcatura. Gli enteroidi umani e murini crescono a velocità diverse rispetto al T84 IEC e i ricercatori dovrebbero determinare quanto tempo impiega ogni linea per raggiungere la confluenza. È importante che i ricercatori utilizzino terreni minimamente tamponati per garantire che si osservino i cambiamenti nel pH...

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