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Method Article
Il DNA ambientale (eDNA) viene tipicamente catturato da campioni d'acqua utilizzando la precipitazione, la filtrazione o la flocculazione dell'alcol. Qui viene presentato un protocollo alternativo che utilizza il cloruro di lantanio per consentire la raccolta di acidi nucleici disciolti e legati al particolato da campioni d'acqua contenenti cellule eucariotiche, cellule procariotiche e virus.
L'analisi del DNA ambientale (eDNA) è diventata un approccio ampiamente utilizzato per la risoluzione dei problemi nella gestione delle specie. L'obiettivo è il rilevamento di specie criptiche, comprese le specie invasive e (o) a rischio, tipicamente raggiunto testando l'acqua e i sedimenti per la presenza di firme caratteristiche del DNA. Sono necessarie procedure affidabili ed efficienti per la cattura dell'eDNA, in particolare quelle che possono essere eseguite facilmente sul campo da personale con formazione limitata e da cittadini scienziati. La cattura dell'eDNA mediante filtrazione a membrana è attualmente ampiamente utilizzata. Questo approccio presenta problemi intrinseci che includono la scelta del materiale e della porosità del filtro, l'incrostazione del filtro e il tempo necessario in loco per l'esecuzione del processo. La flocculazione offre un'alternativa che può essere facilmente implementata e applicata a regimi di campionamento che si sforzano di coprire ampi territori in un tempo limitato.
Prima della metà degli anni 2000, il termine "DNA ambientale" era generalmente usato per riferirsi al DNA ottenuto da microbi dell'acqua e del suolo, anche se un certo uso per il rilevamento di DNA umano e animale ai fini del monitoraggio della fonte fecale o del rilevamento di specie non autoctone era iniziato 1,2,3. Attualmente, il DNA ambientale è generalmente utilizzato per descrivere il DNA proveniente da cellule staccate da organismi eucarioti e l'analisi di questo DNA è diventata uno strumento di gestione ampiamente utilizzato. L'obiettivo è il rilevamento di specie criptiche, comprese quelle invasive o a rischio, tipicamente raggiunto testando l'acqua o i sedimenti per la presenza delle firme del DNA caratteristiche delle specie bersaglio. Gli studi possono concentrarsi su una singola specie di interesse utilizzando uno specifico test PCR (campionamento attivo), oppure molte specie possono essere rilevate contemporaneamente utilizzando il metabarcoding e il sequenziamento massivamente parallelo.
Negli ultimi due decenni sono stati apportati molti miglioramenti nella raccolta dei campioni, nell'elaborazione dei campioni e nell'analisi dei dati associati alla ricerca sull'eDNA. I primi studi hanno impiegato la precipitazione dell'alcol per catturare il DNA da campioni d'acqua3. Sebbene collaudato, la necessità di analizzare grandi volumi d'acqua per aumentare la sensibilità del saggio rende questo metodo poco attraente a causa del tipico requisito di due volumi di etanolo per ogni volume di campione d'acqua.
Studi successivi hanno generalmente utilizzato la filtrazione di membrana, razionalizzando che l'eDNA è presente in un continuum di stati da quelli legati a quelli liberamente disciolti, ma che il DNA disciolto è soggetto a una rapida degradazione e quindi che il DNA legato alle cellule rappresenta la frazione più significativa. L'ottimizzazione del materiale filtrante e della dimensione dei pori è ampiamente discussa e dibattuta, così come il metodo o i metodi ottimali per l'estrazione dell'eDNA catturato dal filtro 4,5,6.
Un terzo approccio alla cattura dell'eDNA è la flocculazione, un processo che è stato utilizzato per secoli per chiarificare liquidi tra cui acqua, birra e vino. Diversi studi hanno utilizzato la flocculazione per catturare il virus da fonti di acqua naturale o potabile 7,8,9,10,11. Questi studi hanno tipicamente utilizzato latte scremato pre-flocculato o cloruro di ferro come agenti di cattura. I metodi con cloruro di ferro in genere comportano problemi molecolari di analisi a valle a causa dell'inibizione della reazione PCR12,13. I metodi che utilizzano il latte scremato pre-flocculato richiedono la preparazione anticipata del flocculante, il controllo del pH e finora sono stati applicati solo alla cattura del virus 7,8,9.
Recentemente, è stata studiata la cattura flocculatoria di batteri e virus basata sull'uso di cloruro di lantanio (III) 12,13,14,15. Gli autori hanno dimostrato che i patogeni vitali possono essere raccolti con questo metodo poiché il legame del cloruro di lantanio è efficace a basse concentrazioni (0,2 mM). Inoltre, la flocculazione del lantanio è reversibile attraverso la chelazione in condizioni blande a differenza di quella del cloruro di ferro.
Pertanto, la flocculazione con cloruro di lantanio per catturare il particolato biologico è interessante dato che è necessaria solo una piccola quantità di agente flocculante concentrato aggiunto, non è necessario un rigoroso controllo del pH e i volumi del campione sono scalabili da millilitri a galloni. Per quanto riguarda la cattura dell'eDNA, il DNA cellulare, subcellulare (mitocondri e cloroplasti) e disciolto viene facilmente recuperato. Batteri e virus vengono raccolti simultaneamente, consentendo l'analisi dei patogeni e (o) ulteriori studi ecologici da un singolo campione d'acqua. Viene presentato un protocollo di flocculazione che utilizza cloruro di lantanio che consente la raccolta di acidi nucleici disciolti e legati al particolato da campioni d'acqua.
1. Decontaminazione delle apparecchiature e preparazione dei reagenti di flocculazione
2. Raccolta e flocculazione dei campioni
3. Lavorazione dei fiocchi
Figura 1: Raccolta di fiocchi sedimentati a gravità unitaria. I floc contenenti materiale cellulare ed eDNA si depositano sul fondo del flacone del campione e sono pronti per essere recuperati dopo la rimozione del surnatante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Otto campioni d'acqua da 500 mL (450 mL ciascuno) prelevati da un acquario che ospita due tartarughe dipinte orientali (Chrysemys picta picta) sono stati utilizzati per preparare l'eDNA utilizzando il protocollo descritto. Altri otto campioni d'acqua da 500 mL sono stati filtrati su filtri in fibra di vetro da 47 mm con porosità di 1,5 μm senza legante e l'eDNA è stato estratto utilizzando lo stesso metodo di estrazione utilizzato per il protocollo di flocculazione. Il DNA pr...
Sebbene questa tecnica sia semplice, alcuni passaggi sono fondamentali per il successo. La raccolta e il trasferimento dei fiocchi devono essere effettuati completamente per non perdere il DNA. Il materiale residuo deve essere raccolto mediante risciacqui strategici. Il protocollo descritto utilizza un kit di estrazione del DNA commerciale per la lavorazione finale del materiale flocculato. Altri metodi di estrazione possono avere prestazioni simili o superiori, ma le modifiche di questa...
L'autore non ha nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato completato con il finanziamento dell'U.S. Geological Survey.
Qualsiasi uso di nomi commerciali, aziendali o di prodotti è solo a scopo descrittivo e non implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Available from several commercial sources | ||
1 x TE Buffer, pH 8.0 | Available from several commercial sources | ||
15 ml Conical Centrifuge Tubes | Single use | ||
16 oz. PET Clear Square Bottles | Reusable with cleaning and decontamination | ||
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner | Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner. | ||
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Single use | ||
6% Citric Acid Solution | Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles. | ||
Fecal/Soil Microbe Kit | Use inhibitor removal resin or column | ||
Lanthanum (III) chloride heptahydrate | 100 mM Stock Solution | ||
Peristaltic DC Pump | Any peristaltic pump will do, or can be syphoned | ||
Polyacryl Carrier | 10% linear polyacrylamide | ||
Sodium Bicarbonate | 1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture |
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