המחקר שלנו משתמש במודל סרטן כליות על שבב כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאי כליה בריאים וסרטניים. מערכת זו עוזרת לנו לשכפל מצב in viva המאפשר לנו לחקור שינויים המונעים על ידי גידולים בביטוי גנים, דלקת ומטבוליזם. זה גם מספק תובנות ברורות מאוד על התקדמות סרטן הכליה וגם את ההשפעות שלה על רקמות בריאות שמסביב.
מערכת סרטן הכליה המתקדמת משתמשת בגישות רבות כמו מיקרופלואידיקה, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, הדמיה ברזולוציה גבוהה, ביו-חיישנים בזמן אמת, ריצוף RNA ובדיקת קריספר. טכנולוגיות אלה מאפשרות לנו ליצור סימולציה מדויקת מאוד של מצבי כליות in viva המאפשרים לנו לחקור את התגובות התאיות ואת השינויים בביטוי גנים. השגת יכולת שחזור בניסויים מיקרופלואידים, זה מאתגר מאוד.
בעיות טכניות כמו טיפול מדויק בנוזלים יכולות להוביל לשונות בתוצאות. בנוסף, תנודות הפרוטוקולים המורכבים בקצב הזרימה ובתנאי הסביבה משפיעים עוד יותר על תוצאות עקביות. המחקר הקרוב שלנו יתמקד בזיהוי חתימות מיקרו-רנ"א הקשורות להתקדמות סרטן הכליה והערכת הפוטנציאל שלהן כסמנים ביולוגיים של המחלה.
כדי להתחיל, תכנן את התא הנדרש הכולל ארבעה תאים מקבילים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב. התא חייב להכיל שני תאי תאים, תא מטריצה אחד ותעלה מקשרת. להדפסה תלת מימדית של התא, המיסו חוט להט ביופלסטי, במיוחד פוליפרופילן, באמצעות פיית חימום והפקידו אותו שכבה אחר שכבה.
לאחר ההדפסה, מערבבים 1, 000 מיקרוליטר של קולגן מסוג I עם תמיסת הגניפין והנתרן הידרוקסיד תוך שמירה על התערובת על קרח. הוסיפו בזהירות את האגר ואת תמיסת הקולגן לתאי המטריקס המתאימים של התא המודפס בתלת-ממד. הניחו את התא באינקובטור פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60-90 דקות כדי לאפשר למטריצה להתפלמר.
לאחר מכן מוסיפים 150 מיקרוליטר של מדיום תרבית על גבי המטריצה ודגרים עליו למשך הלילה. להטמעת תאי caki-1, יש להוסיף 25 מיקרוליטר של תרחיף תאים, ולאחר מכן 75 מיקרוליטר של קולגן מסוג I לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מערבבים היטב את התערובת.
עכשיו, בזהירות להוסיף 100 מיקרוליטר של ג'ל מותך 2% agarose לצינור ולהמשיך מערבול עד הג'ל הופך הומוגני. מניחים את התא באינקובטור ושומרים על תנאים של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שעה, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיה סלולרית על גבי המטריצה כדי למנוע התייבשות.
למחרת, השתמש במרית כדי להסיר את המטריצה מהחדר. מניחים את המטריצה התלת-ממדית עם התאים לתוך צלחת של 24 בארות המכילה 1, 000 מיקרוליטר של מדיום תרבית ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. להזרקת תאי RPTEC/TERT1, יש להעמיס 10 מיקרוליטר מתרחיף התא לתוך מיקרו פיפטה עם קצה של 10 מיקרוליטר.
הזריקו בזהירות את תרחיף התא לתוך מטריצת הקולגן המצוקה שהוכנה קודם לכן דרך תא התא בתוך התא. מניחים את התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני. לאחר 60 דקות, הוסיפו 150 מיקרוליטר של מדיה תאית על גבי המטריצה כדי למנוע התייבשות ודגרו על התאים למשך 24 שעות.
לאחר מכן, להסיר את המטריצה מן החדר באמצעות מרית ומניחים אותו לתוך צלחת 24 באר המכילה 1, 000 מיקרוליטר של מדיום תרבית לדגור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. עכשיו מוסיפים את הג'לים לשבב. חבר את השבב עם מטריצת התא התלת-ממדית למערכת הזילוח באמצעות צינורות.
הגדר את פרמטרי המערכת והכנס את השבב לחממה. לאחר השלמת הזילוח, הסר את הג'לים ממערכת הזילוח ושטוף אותם עם PBS. צביעת אימונופלואורסנציה אישרה את המורפולוגיה האופיינית של צינוריות הכליה כרציפה עם מונושכבה הדוקה הממוקמת במרכז הג'ל.
ספרואיד קרצינומה של תאי הכליה נראה מעוגל ובגודל הומוגני. כדאיות התאים נשארה עקבית לאורך תקופת התרבית ללא טיפולים, כפי שהוכח על ידי דליפת LDH יציבה בין היום הראשון לחמישה. פעילות קספז מוגברת בנוכחות תאי מערכת החיסון הצביעה על אפופטוזיס משופר.
בהשפעת קרצינומה ספרואיד של תאי הכליה, צינוריות הכליה הציגו ביטוי מועשר של גנים הקשורים לוויסות המערכת החיסונית. הפרשת TNF-אלפא הייתה מוגברת בצינוריות הכליה בתרבית המשותפת עם ספרואידים של קרצינומה של תאי הכליה.
