המחקר שלנו מתמקד בפיתוח טיפול תאי CAR מהמדף לזיהומים פטרייתיים פולשניים. אנו שואפים לזהות את המטרות הטובות ביותר, עיצובי CAR ושילוב תאי חיסון כדי להשיג תוצאות טיפוליות מיטביות. ההתפתחויות האחרונות, כולל העבודה שלנו, התמקדו בפיתוח טיפולים בתאי T מסוג CAR המכוונים לאספרגילוס פומיגאטוס.
תאים מהונדסים אלה הראו תוצאות מבטיחות במודלים פרה-קליניים על ידי הפחתה משמעותית של העומס הפטרייתי, שליטה בחסינות אנטי-פטרייתית ושיפור ההישרדות הכוללת. כיום רוב המחקר בתחום מתרכז בייצור תאי T CAR ספציפיים לקבוצה מוגבלת מאוד של מטרות באמצעות וקטורים ויראליים או מערכת טרנספוזון היפהפייה הנרדמת. האתגרים העיקריים כוללים זיהוי מטרות פטרייתיות אופטימליות וייצור מוצר סלולרי מוכן לשימוש שהוא גם יעיל וגם ניתן להרחבה ליישומים קליניים.
עם פרוטוקול זה, אנו נותנים מענה לצורך בשיטות חסכוניות וניתנות להרחבה ליצירת תאי CAR-NK לא ויראליים. הוא מספק גישה נגישה לסינון מטרות אנטי פטרייתיות חדשות, ומספק צעד בסיסי לקראת טיפול תאי CAR-NK מהמדף לזיהומים פטרייתיים. כדי להתחיל, בדוק את תאי ה-NK-92 מתחת למיקרוסקופ לאיתור אשכולות ברקע ברור, הוסף 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר לכל מצב לצלחת של שש בארות והנח את הצלחת באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
העבירו 8 כפול 10 בחזקת 6 תאי NK-92 לצינור תחתון חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה של הצינור ב-200 G למשך חמש דקות עם תאוצה והאטה של 3. לאחר השלכת הסופרנטנט, מלאו שוב את הצינור המכיל את כדור התא בעד 15 מיליליטר של PBS וצנטריפוגה מחוממים מראש. במהלך הצנטריפוגה, פיפטה 8 מיקרוגרם של DNA פלסמיד Af-CAR, ו-4 מיקרוגרם של מיני-עיגול SB100X לתוך צינור תגובה אחד ושמור על ה-DNA של הצינור השני פנוי כדי לשמש כבקרה מדומה.
עבור מערכת הטרנספקציה, הוסף 3 מיליליטר של מאגר אלקטרוליטי לצינור הראשון והנח אותו בתחנת הפיפטה. לאחר הצנטריפוגה, השליכו בעדינות את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר השעיה מחדש. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל אחד משני צינורות התגובה וערבבו בעדינות.
פיפטה תערובת תאי ה-DNA מצינור התגובה הראשון באמצעות פיפטת מערכת הטרנספקציה, הכנס את פיפטת הטרנספקציה אנכית לתוך הצינור בתחנת הפיפטה. הגדר את הדופק הראשון ל-1, 650 וולט ואת זמן הדופק למשך 20 אלפיות השנייה לפני לחיצה על התחל כדי להפעיל את הדופק. לאחר הדופק הראשון, הגדר את הדופק השני על 500 וולט ואת זמן הדופק למשך 100 אלפיות השנייה והתחל את הדופק השני.
לאחר השלמת הדופק השני, הסר לאט את הפיפטה מתחנת הפיפטה. העבירו מיד את התאים לבאר אחת של צלחת התרבות המוכנה המכילה 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאים שחומם מראש והזיזו בעדינות את הצלחת בתנועה סיבובית כדי להפיץ את התאים באופן שווה. דגרו את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר 30 דקות של דגירה, הוסף אינטרלוקין-2 לבארות בריכוז סופי של 150 יחידות בינלאומיות למיליליטר. כדי להתחיל, העביר את תאי ה- NK-92 עם הפלסמיד הרצוי. העבירו את התאים לצינור תחתון חרוטי של 15 מיליליטר.
לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ודלל אותם לריכוז של 1 עד 2 כפול 10 בחזקת 6 תאים ל -100 מיקרוליטר באמצעות המאגר. הוסיפו מיקרוליטר אחד של ביוטין אנטי EGFR-T לכל 1 כפול 10 לעוצמה של 6 תאים וערבבו בעדינות כדי להבטיח שהתמיסה מפוזרת באופן שווה. דגרו את הצינור למשך 25 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, מלאו את הצינור עד 10 מיליליטר חיץ. לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור ב-200 G למשך חמש דקות עם תאוצה והאטה של 3, והשליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. לאחר מכן הוסף 8 מיקרוליטר של חיץ קר ואחריו שני מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים אנטי-ביוטין לכל 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים.
דגרו את הצינור למשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. כדי לשטוף את התאים, מלאו את הצינור עד 10 מיליליטר של חיץ וצנטריפוגה. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של חיץ.
הנח עמוד LS לתוך המגנט המקסימלי ושטוף אותו עם 3 מיליליטר חיץ. הוסף את מתלה התא לאחר שהמאגר עבר לחלוטין דרך העמודה. לאחר שטיפת העמוד, הסר אותו מהמגנט והנח אותו בצינור תחתון חרוטי נקי של 15 מיליליטר.
הוסף 5 מיליליטר של מאגר לעמודה והשתמש בבוכנה כדי לשטוף את התאים החיוביים של EGF-R במהירות האפשרית. יעילות הטרנספקציה לאחר ההתאוששות הגיעה ל-10 עד 20% וההעשרה המקסימלית הגדילה את טוהר תאי Af-CAR-NK-92 ליותר מ-95%כדי להתחיל, השג תאי NK-92 מועשרים המבטאים טרנסגנים באמצעות טכניקת מיון תאים המופעלת על ידי מגנטית. לאחר מכן הכינו תרחיף Aspergillus fumigatus conidia בריכוז של 2.5 כפול 10 בחזקת 5 קונידיה למיליליטר במדיום.
הוציאו 100 מיקרוליטר של תרחיף הקונידיה לכל באר של צלחת תרבית של 96 בארות ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. ביום השני, שטפו את תאי ה-NK-92 המדומים והפלסמיד פעמיים עם המדיום והוסיפו 5 פעמים 10 לעוצמה של 4 תאי NK-92 ב-100 מיקרוליטר של מדיום לכל באר של הצלחת המכילה את הפטרייה לתרבית משותפת. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני לחה למשך 6 שעות לפחות.
לאחר צנטריפוגה של הצלחת בחום של 300 גרם למשך חמש דקות, קצרו 100 מיקרוליטר סופרנטנט מכל באר מבלי לגעת בתחתית. לבסוף, העבירו את הסופרנטנטים למבחנות תגובה כדי לבצע ELISA. תאי Af-CAR-NK-92 הראו הפרשת אינטרפרון גמא גבוהה משמעותית בהשוואה לתאי NK-92 מדומים במהלך תרבית משותפת עם צינורות נבט אספרגילוס פומיגטוס.
