אנו מעוניינים לגלות מנגנונים תאיים ומולקולריים חדשים השולטים בגזע של תאים. המטרה העיקרית שלנו היא לפענח כיצד תאי גזע נמנעים מהתמיינות בגומחות. מכיוון שאנו עובדים בתנאי ניסוי, חיוני לשמור על שלמות הרקמות כדי להבטיח ש-GSCs יקבלו התנהגות פיזיולוגית.
הפרוטוקול שלנו שומר על נישת GSC בריאה ופונקציונלית המאפשרת ניטור של חלוקת GSCs כפי שהם יהיו in vivo. השימוש בהדמיית חיים ארוכים מאפשר לנו לחקור את כל מחזור התא של GSCs ודינמיקה ספקטרוזומית. באופן ספציפי, אנו מאפיינים בהצלחה את השינויים הספקטרוזומיים לאורך מחזור התא, משימה שבעבר היה קשה להשיג עם תמונות קבועות או תקופות הדמיה קצרות יותר.
הידיעה לבצע בעיקר ניסויים מבלי להשפיע על הדינמיקה שלו מאפשרת לנו לחקור כיצד תאי הנישה מתקשרים. אנו רוצים לחקור מנגנוני בקרה של ביטוי גנים ומטבוליזם תאי המתווכים על ידי אינטראקציה ישירה בין mRNAs, אנזימים מטבוליים בביולוגיה של תאי הגזע. כדי להתחיל, הכינו 100 מיקרוליטר של תערובת האנטיביוטיקה סטרפטומיצין פניצילין בריכוז של 10,000 יחידות למיליליטר.
הכן את כל שאר הריאגנטים הנדרשים להליך ואחסן אותם כראוי. אסוף זבובים בני יום עד יומיים המבטאים את הביטוי הנפוץ והקונסטיטוטיבי של ה-par 1 המאוחד ל-GFP לתוך צינור חדש. לגדל את הזבובים במשך יומיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באינקובטור לפני הניתוח.
הנח טיפה של שלושה מיקרוליטר של דבק ה-Cell-Tak הספציפי במרכז החלקה של צלחת מצופה פולי-D-ליצין בגודל 35 מילימטר. הוסף מיד נפח שווה של 0.1 נתרן ביקרבונט מולארי עם pH של שמונה לטיפות דבק של שלושה מיקרוליטר. מערבבים את התמיסה עם פיפטה.
לאידוי מלא, דגרו את הצלחת עם המכסה שלה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן אחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הפשרת הצלחת למחרת, יש לשטוף אותה שלוש פעמים בשישה מיקרוליטרים של מים טהורים לחיטוי בזהירות מבלי לגעת ולהפריע לשכבת הדבק.
תנו למים להתאדות לחלוטין בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. כדי להתחיל, תרבו את הזבובים והכינו את צלחת הזכוכית התחתונה עם הציפוי. לאחר מכן נקו צלחת חיתוך שלוש בארות, מלקחיים ומחטי חיתוך עם אתנול 70%.
הוסף כ -200 מיקרוליטר של תמיסת רינגר לכל אחת משלוש הבארות של צלחת החיתוך. בעזרת מלקחיים, תפוס את נקבת הדרוזופילה בצומת בית החזה והבטן. קרעו בעדינות את הציפורן בבטן האחורית ומשכו אותה לאחור כדי לחשוף את השחלות.
לאחר ניתוח השחלות, העבירו אותן לבאר הבאה כדי להפחית את הזיהום בשאריות רקמות, או פסולת מהדיסקציה. תחת מיקרוסקופ סטריאו עם תאורת LED, השתמש בזוג אחד של מלקחיים עדינים כדי לעגן את כל השחלה ובזוג השני כדי לתפוס תא ביציות בשלב מאוחר. יש למתוח בעדינות עד שהמעטפת של השריר נשברת ומפגרת מאחור.
בעזרת מלקחיים, העבירו את 15 עד 20 השחלות נטולות מעטפת השרירים בזו אחר זו לבאר השלישית המכילה 200 מיקרוליטר של מדיום רינגרים. הרטיבו מראש קצה של 200 מיקרוליטר עם 0.1% טווין 20 כדי למנוע מהשחלות להידבק לדופן הקצה. העבירו שישה מיקרוליטרים של תמיסת רינגר המכילה את השחלות נטולות מעטפת השריר באמצעות הקצה הרטוב מראש לצלחת ההדבקה המוכנה בטמפרטורת החדר.
בעזרת מחט חיתוך או מלקחיים, לחץ בזהירות על השחלות לתחתית טיפת הצלצול כדי להבטיח מגע עם משטח הדבק. לאחר מכן, הוסיפו לצלחת MatTek שלושה מיליליטר של המדיום של שניידר, בתוספת תערובת אנטיביוטיקה של 15% FBS ו-0.6% סטרפטומיצין פניצילין. העבירו את הצלחת המכילה את השחלות נטולות מעטפת השריר על משטח ישר לתחנת המיקרוסקופ.
הנח את הצלחת על המטרה פי 63 של מיקרוסקופ דיסק מסתובב או מיקרוסקופ קונפוקלי. מקדו את הדגימה ובחרו את מישור ה-Z האמצעי עבור כל גרמניום. כדי להגדיר את הפרמטרים הניסיוניים, הגדר את סוג הלכידה ל-3D time lapse.
כוונן את עוצמת הלייזר ל-70% מהמקסימום. הגדר את אורך גל העירור ל-488 ננומטר. טווח מחסנית Z הוא 30 מיקרומטר והמרחק בין ערימות Z מגיע ל-1.2 מיקרומטר.
הגדר את מרווח הזמן בין נקודות זמן לכל 10 דקות ואת משך הזמן ל- 17 שעות. אם זמין, השתמש באפשרות ריבוי מיקומים כדי להגדיר מחדש את ה-XY של הדגימות. בחר את מישור Z באמצע כל גרמריום כך שערימות ה-Z יהיו מרוכזות במיקום זה ויתחילו את הרכישה.
נתח את התמונות בזמן ולאורך ציר Z כדי להמחיש שינויים במורפולוגיה של הספקטרוזום באמצעות תוכנת Imaris או Image J. כדי ליצור את הסרטים, בחר ידנית את מישור ה-Z הטוב ביותר בכל נקודת זמן. אות ה-GFP החזק של אזור הספקטרו העגול G2 הופחת משמעותית במהלך שלבי ה-G2 MG1.
במהלך הפרופאזה המוקדמת GFP par 1 עזב את הספקטרוזום ומילא את הציטופלזמה המציינת את כניסת תאי הגזע של קו הנבט למיטוזה. לאחר מיטוזה ורפורמציה של המעטפת הגרעינית, אות ה-GFP par one התאושש בהדרגה במחזור הספקטרו העגול G1. מהדורת Denovo של GFP par one לספקטרוזום G1 העגול הובילה להיווצרות מורפולוגיות ספקטרוזום תקע, מוט והיתוך.
