פרוטוקול זה מספק הנחיות כיצד להימנע מזיהום עם אנדוטוקסין במהלך בידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שכל מעבדה העוסקת ברכב חשמלי עשויה להגביל את זיהום האנדוטוקסין על ידי שמירה על הליך אספטי ושימוש בציוד פשוט וזמין באופן נרחב. כל מי שמנסה טכניקה זו בפעם הראשונה צריך להתחיל עם מדיה חדשה, ריאגנטים, כלי פלסטיק אשר מסומנים נמוך אנדוטוקסין, לא פירוגני.
עבור פרוטוקול זה, השתמש בריאגנטים נטולי אנדוטוקסין, מים, מדיה לתרבית, PBS מסונן, FBS אנדוטוקסין נמוך במיוחד וצינורות אולטרה-צנטריפוגה. כדי להתחיל, אספו את הסופרנאטנט מקווי תאים SW480 ו-SW620 שגודלו בעבר בתרבית לתוך צינורות 15 מיליליטר המסומנים כראוי. הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה של supernatant ב 500 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
מבלי להפריע לפסולת, לאסוף את supernatant לתוך צינור מסומן חדש, צנטריפוגה ב 3, 200 x גרם במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים בזהירות 45 מיליליטר של הסופרנאטנט לתוך צינור סטרילי של 50 מיליליטר הממוקם אנכית, מבלי להרטיב את שולי הצינור. עטפו את מכסה הצינור בסרט סטרילי ושקוף, ואחסנו אותו במאונך בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לבידוד הבא של שלפוחיות חוץ-תאיות.
התחילו בבידוד על ידי הכנת מסנני מזרקים, מזרקים ושפופרות בגודל 0.22 מיקרומטר המכילים כ-90 מיליליטר סופרנטנט. ממלאים מזרק בסופרנטנט, ומקבעים את המסנן למתאם המחט. מסננים את הסופרנאטנט דרך הפילטר לתוך צינור של 50 מיליליטר.
פיפטה שבעה מיליליטר של תסנין לתוך צינור ultracentrifuge מוכן, וצנטריפוגה ב 100, 000 x גרם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. השתמשו בפיפטת פסטר סטרילית כדי להשליך את הסופרנטנט. משכו את הכדוריות לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה באמצעות קצה פיפטה ארוך ומסונן.
שטפו את השלפוחיות החוץ תאיות על ידי הוספת שבעה מיליליטר של PBS מסונן ללא אנדוטוקסין. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סטרילית של פסטר והשהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS נטול אנדוטוקסין. מעבירים את התרחיף למבחנה סטרילית של 1.5 מיליליטר עם קשירת חלבון.
לאחר מכן להעביר 10 מיקרוליטר של השעיה צינור חדש 1.5 מיליליטר לניתוח נוסף. עטפו את מכסה הצינור ואחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כעת, לתוך צינור חדש, לדלל מיקרוליטר אחד של תרחיף באמצעות PBS מסונן ביחס של 1 עד 1000 לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים.
כדי לבצע ניתוח ניקוי, תחילה ערבבו 20 מיקרוגרם של הדגימות עם מאגר טעינה. לדגור על הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן לטעון 20 מיקרוגרם של הדגימה לתוך כל באר של 10 עד 14% פוליאקרילאמיד ג'ל עם SDS, ולבצע אלקטרופורזה במשך 45 דקות ב 150 וולט, עם חיץ פועל.
לאחר מכן, מניחים את הג'ל במכונת העברה עם חיץ Towbin, ומבצעים העברה חצי יבשה של חלבונים על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד במתח של 25 וולט למשך שעה. חסום את הממברנה עם 1% BSA על ידי דגירה במשך שעה על נדנדה. הוסיפו נוגדנים מדוללים BSA, אנטי-CD9 או אנטי-אליקס, לממברנה, ודגרו במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על נדנדה.
לאחר הסרת הנוגדנים, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של TBST במשך 10 דקות. כעת הוסיפו נוגדן משני נגד ארנב או נגד עכבר, ודגרו שוב על נדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הנוגדן ולשטוף את הממברנה כפי שהודגם קודם לכן.
יוצקים מיליליטר אחד של התמיסה המכילה מצע ולומינול ביחס שווה על הממברנה. הניחו מיד את הממברנה במערכת הדמיה, ודמיינו את רצועות החלבונים על המסך. במחקר הנוכחי, ניתוח כתמים מערביים אישר את נוכחותם של שני סמני שלפוחית חוץ-תאיים, CD9 ואליקס.
הגודל הממוצע והריכוזים של השלפוחיות שבודדו הן מ-SW480 והן מ-SW620 היו דומים. גירוי של מונוציטים במינונים שונים של ליפופוליסכרידים, או LPS, הראה שהמינון הנמוך ביותר של LPS המאפשר הפרשת אינטרלוקין 10 וגורם נמק הגידול במונוציטים היה 50 פיקוגרם למיליליטר. בדיקת LAL כרומוגנית הצביעה על כך שזיהום LPS של השלפוחיות החוץ תאיות היה בסביבות 50 פיקוגרם למיליליטר עבור שני קווי התא.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא השימוש בריאגנטים נטולי LPS או מרוקנים, ומדידת LPS שגרתית בכל שלב של ההליך. מניעת זיהום אנדוטוקסין קלה יותר מאשר חיסולו. הפרוטוקול המוצע מגביל את האפשרות לתוצאות שגויות עקב זיהום של כלי רכב חשמליים באנדוטוקסין, ומאפשר להעריך את פעילות כלי הרכב החשמליים בכל תא.
הפרוטוקול המוצע שימושי לחוקרים העובדים עם תאים רגישים לאנדוטוקסין, כמו מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופאגים.
